吳榮強，王蘇建，王仕忠，周海俊，戚春建

(1.南京醫(yī)科大學附屬常州第二人民醫(yī)院檢驗科，江蘇常州213003; 2.南京醫(yī)科大學附屬常州第二人民醫(yī)院腫瘤研究所，江蘇常州213003)

β-葡聚糖對單核細胞釋放TNF-α、IL-8和IL-12的影響

吳榮強1，王蘇建1，王仕忠2，周?？?，戚春建2

(1.南京醫(yī)科大學附屬常州第二人民醫(yī)院檢驗科，江蘇常州213003; 2.南京醫(yī)科大學附屬常州第二人民醫(yī)院腫瘤研究所，江蘇常州213003)

目的研究β－葡聚糖對單核細胞釋放動脈粥樣硬化致病因子[腫瘤壞死因子α(TNF－α)、白細胞介素18(IL－8)和白細胞介素12(IL－12)]的影響。方法用密度梯度離心法分離健康志愿者新鮮血液中的單核細胞，使用佛波醇酯(PMA)誘導單核細胞分化為巨噬細胞，進一步利用氧化低密度脂蛋白(ox－LDL)誘導巨噬細胞為泡沫細胞，將實驗分為無藥對照組、ox－LDL組、顆粒性β－葡聚糖(WGP)組和WGP+ox－LDL組，提取總RNA，擴增TNF－α、IL－8和IL－12 cDNA，并采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定細胞上清液中的濃度。結果與無藥對照組比較，ox－LDL誘導單核細胞TNF－α、IL－8和IL－12蛋白水平的表達顯著升高(P＜0.05)，而WGP可以顯著抑制ox－LDL誘導的上述細胞因子在蛋白水平和TNF－α、IL－8在mRNA水平的表達(P＜0.05)。結論β－葡聚糖可能通過抑制單核細胞促炎因子的分泌減緩動脈粥樣硬化形成。

β－葡聚糖;低密度脂蛋白;單核細胞

近年來大量研究表明，冠心病是一種慢性進展的炎性疾病，其病理基礎是冠狀動脈硬化(cronary arteriosclerosis)及斑塊形成。聚集于動脈管壁部位的氧化性低密度脂蛋白(oxidized lowdensity lipoprotein，ox－LDL)是動脈粥樣硬化斑塊形成的關鍵因素[1]。炎性細胞及炎性因子可通過多種組織和病理學機制參與動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展，如巨噬細胞可吞噬ox－LDL形成泡沫細胞并分泌大量的炎癥細胞因子從而促進動脈粥樣硬化[2]。β－1，3/1，6－葡聚糖是某些酵母、真菌、谷類和藻類的細胞壁D葡萄糖的聚合物，是一種生物應答調節(jié)劑。很多β－葡聚糖的實驗觀察證明其具有顯著非特異性的免疫應答和抗氧化活性等生物學功能，能夠刺激增強天然殺傷(NK)細胞、巨噬細胞等免疫細胞的吞噬活性，一氧化氮的產生和炎癥應答等[3－4]。我們利用一種酵母來源的顆粒性β－葡聚糖(whole beta－glucan particle，WGP)，通過觀察WGP對ox－LDL誘導的單核－巨噬細胞表達炎癥因子[腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha，INF－α)、白細胞介素8 (interleukin 8，IL－8)和白細胞介素12(interleukin 12，IL－12)]的影響，進一步探討β－葡聚糖在拮抗動脈粥樣硬化方面的作用。

材料和方法

一、材料

WGP獲贈于美國路易斯維爾大學嚴俊教授，佛波醇酯(phorbol myristate acetate，PMA，美國Sigma公司產品)，單核細胞分離液Ficoll－Paque (上海GE生物公司產品)，TRizol試劑盒(Invitrogen公司產品)，反轉錄試劑盒為Bio－Rad公司的iScript cDNA Synthesis Kits，實時熒光定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)試劑盒為TaKaRa公司生產的SYBR Premix EX TaqTMⅡ(Perfect Real Time)。細胞因子酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme－linked immunosorbent，ELISA)測定試劑盒(美國Biolegend公司產品)。

二、方法

1.ox－LDL的制備人血漿LDL提取采用一次性密度超速離心法。新鮮人枸櫞酸鉀抗凝血液，室溫低速離心分離血清，用KBr調密度至1.019～1.063 g/mL，4℃以150 000×g離心5 h，收集LDL，于磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)中透析48 h，超濾除菌后4℃保存。LDL的氧化修飾采用經典硫酸銅方法，將無乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)的LDL置于5 μmol Cu2+的PBS中，37℃溫育24 h。修飾后的LDL置于含200 μmol EDTA的PBS中透析24 h后4℃保存。修飾程度用硫代巴比妥酸反應物質法測定。未經氧化的LDL丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量為0.12 nmol/mg蛋白，氧化后ox－LDL的MDA含量為28.7 nmol/mg蛋白。

2.單核細胞的分離培養(yǎng)及誘導處理新鮮抗凝血液標本2 mL加入2 mL PBS，人單核細胞分離液4 mL加至PBS稀釋的血液標本底部，使液面分層，用密度梯度離心法分離單個核細胞。將單個核細胞懸浮于含10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液，接種于25 mL培養(yǎng)瓶，在37℃5% CO2的條件下貼壁溫育6 h，收集貼壁細胞即為單核細胞。將分離好的單核細胞用含1%胎牛血清的RPMI－1640液重懸，置細胞于24孔培養(yǎng)板(1×106/孔)37℃培養(yǎng)6 h后，加入PMA至終濃度為100 ng/mL，培養(yǎng)48 h后實驗分為4組(每組均重復3次)，即無藥對照組(繼續(xù)溫育48 h)、ox－LDL組[加ox－LDL(10 μg/mL)溫育48 h]、WGP組[WGP(100 g/mL)溫育2 h，繼續(xù)溫育48 h]、WGP+ox－LDL組[先加WGP(100 g/mL)溫育2 h，之后加ox－LDL(10 μg/mL)繼續(xù)溫育48 h][3，5]。收集上清液離心后凍存于－70℃?zhèn)溆?，收集單核細胞用于提取總RNA。

3.總RNA提取和逆轉錄PCR擴增采用TRizol提取液按異硫氰酸胍－酚－氯仿抽提法提取總RNA，采用核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度(A260nm)和純度(A260nm/A280nm)。cDNA合成按照iScript cDNA Synthesis Kits操作說明進行。以GAPDH為內參，行實時熒光定量PCR，PCR引物見表1(所有引物由上海生物工程公司設計和合成)。實時熒光定量PCR采用SYBR GreenⅠ染料法，按照SYBR Premix EX TaqTMⅡ操作說明書在ABI 7300 real－time PCR儀上進行擴增。20 μL反應總體系:cDNA 2 μL，上、下游引物各0.8 μL (工作濃度為10 μmol/L)，焦碳酸二乙酯水6 μL，SYBRPremixEXTaqTM10μL，ROX Reference 0.6 μL。反應程序為:95℃30 s;95℃5 s，60℃31 s，共40個循環(huán)。采用比較閾值法2－△△Ct計算各細胞因子cDNA，據此間接反映mRNA的相對含量，以同一標本待測指標mRNA含量與內參照GAPDH mRNA含量的比值表示待測基因的表達水平。PCR擴增完成后用熔解曲線分析法確定產物特異性。

4.細胞因子測定參照ELISA試劑盒說明書測定細胞上清液TNF－α、IL－8和IL－12的水平。

三、統(tǒng)計學方法

結果

一、WGP對ox－LDL所致單核－巨噬細胞炎癥因子釋放的影響

單核－巨噬細胞經10 μg/mL ox－LDL處理48 h后，細胞培養(yǎng)上清液中的TNF－α、IL－8和IL－12濃度明顯增加，與無藥對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。單核－巨噬細胞經100 g/mL的WGP預處理2 h后加ox－LDL培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)上清液中TNF－α、IL－8和IL－12濃度均顯著降低，與ox－LDL組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見圖1和表2。

表2 各組細胞上清中TNF－α、IL－8和IL－12蛋白量的比較(±s，pg/mL)

注:與無藥對照組比較，*P＜0.05;與ox－LDL組比較，#P＜0.05

IL－8IL－12無藥對照組組別TNF－α 13.00±1.73500.00±96.15115.00±10.39 ox－LDL組38.00±5.57*940.70±91.43*240.70±23.69*WGP+ox－LDL組23.33±4.16#419.00±58.80#106.30±15.82#WGP組15.33±1.53208.30±43.6699.33±14.05

二、WGP對ox－LDL所致單核－巨噬細胞炎癥因子mRNA表達的影響

WGP干預后，再用ox－LDL刺激，與ox－LDL組比較，TNF－α mRNA和IL－8 mRNA的表達均顯著下調(P＜0.05)，而IL－12無明顯下調。見圖2。

討論

動脈粥樣硬化是一個復雜的慢性炎癥性過程，即在一系列心血管危險因素作用下，脂質代謝產物、細胞代謝產物和碎片沉積于大、中動脈內壁，引起血管內皮功能紊亂，動脈管壁內皮下免疫細胞浸潤，引發(fā)炎性反應，最終形成動脈粥樣斑塊[6]。

我們在先前的實驗中對心絞痛和急性心肌梗死患者檢測了外周血白細胞分類計數(數據未列出)，結果顯示急性心肌梗死組患者白細胞計數水平較健康對照組明顯升高，而心絞痛組與對照組無明顯差異，健康對照組、心絞痛組、急性心肌梗死組的中性粒細胞、單核細胞計數依次升高，且各組之間差異均有統(tǒng)計學意義，而淋巴細胞計數結果顯示急性心肌梗死組和心絞痛組均顯著低于健康對照組，這些與文獻報道相一致[7]。研究結果提示中性粒細胞、單核細胞計數的升高可能反映冠狀動脈的病變程度和急性病變的情況。同時，循環(huán)中單核細胞富集浸潤可能促進巨噬細胞的分化，后者吞噬大量氧化修飾的LDL，導致細胞內脂質堆積直至形成粥樣硬化斑塊。

在本研究中，我們發(fā)現健康志愿者單核－巨噬細胞與ox－LDL共同培養(yǎng)48 h后，單核－巨噬細胞上清液中TNF－α、IL－8和IL－12蛋白含量明顯增加，提示ox－LDL促進炎癥因子的分泌和表達，從而促進巨噬細胞向泡沫細胞分化。給予WGP預處理后，繼用ox－LDL刺激，與ox－LDL組相比，細胞培養(yǎng)上清液中TNF－α、IL－8和IL－12的蛋白含量明顯減少，巨噬細胞TNF－α mRNA和IL－8 mRNA表達明顯下調，說明WGP具有一定的抑制ox－LDL誘導單核－巨噬細胞分泌炎癥因子的作用。

β－葡聚糖的活性結構是由葡萄糖單位組成的多聚糖，它能夠活化多種免疫細胞(如巨噬細胞、嗜中性粒細胞)，全面刺激機體的免疫系統(tǒng)。ROVENSKY等[8]發(fā)現β－葡聚糖對大鼠佐劑性關節(jié)炎有抗炎鎮(zhèn)痛作用，且該作用可能與其抗氧化作用有關。KARUMUTHIL－MELETHIL等[9]也發(fā)現應用酵母聚糖A(提取自酵母細胞壁)免疫可以預防或延緩NOD小鼠1型糖尿病的發(fā)病。另有報道，Curdlan(由糞產堿桿菌產生的葡聚糖)可以誘導CD4+T細胞生成白細胞介素10 (interleukin 10，IL－10)，并抑制變應性氣道炎癥的發(fā)生，提示葡聚糖可能是通過抑制或促進促炎因子的釋放來發(fā)揮其抗炎和抗氧化的功能[10]。

β－葡聚糖因其特有的生理功能，受到了廣大科學工作者的關注和研究，并已成功應用于制藥工業(yè)和保健品業(yè)。其中，幾丁聚糖(β－1，4－聚－葡萄糖胺)已經被應用到臨床治療動脈粥樣硬化[11]。在本研究中，我們發(fā)現β－1，3/1，6－葡聚糖也能抑制ox－LDL誘導單核－巨噬細胞促炎因子的表達，從而拮抗動脈粥樣硬化?？梢灶A見，在冠心病將來的治療措施中，β－葡聚糖是一種潛在的抑制斑塊以及全身炎性反應、穩(wěn)定粥樣斑塊的有效治療藥物。

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The influence of beta-glucan on TNF-α，IL-8 and IL-12 in monocytes

WU Rongqiang1，WANG Sujian1，WANG Shizhong2，ZHOU Haijun2，QI Chunjian2.(1.Department of Clinical Laboratory，Changzhou Second People's Hospital，Nanjing Medical University，Jiangsu Changzhou 213003，China;2.Oncology Institute，Changzhou Second People's Hospital，Nanjing Medical University，Jiangsu Changzhou 213003，China)

ObjectiveTo study the influence of beta－glucan on tumor necrosis factor alpha(TNF－α)，interleukin 8(IL－8)and interleukin 12(IL－12)in atherosclerosis pathogenesis monocytes.MethodsThe monocytes of healthy subjects were separated by density gradient centrifugation.The monocytes were induced into macrophages by phorbol myristate acetate(PMA)，and the macrophages were induced into foam cells by oxidized low－density lipoprotein (ox－LDL).There were control group，ox－LDL group，whole beta－glucan particle(WGP)group and WGP+ox－LDL group，the total RNA was extracted，and the TNF－α，IL－8 and IL－12 cDNA was amplified.The concentrations in supernates were determined by enzyme－linked immunosorbent assay(ELISA).ResultsCompared with control group，the protein expression of TNF－α，IL－8 and IL－12 in monocytes were significantly up－regulated by ox－LDL(P＜0.05).After pretreated with WGP，the protein expressions of TNF－α，IL－8 and IL－12 and the mRNA expressions of TNF－α and IL－8wereinhibitedsignificantly(P＜0.05).Conclusionsbeta－glucanmayinhibitedox－LDL－induced pro－inflammatory effects in macrophages，which attenuates the development of atherosclerosis.

Beta－glucan;Low－density lipoprotein;Monocytes

1673－8640(2015)03－0280－04

R446.62

A

10.3969/j.issn.1673－8640.2015.03.019

2014－06－06)

(本文編輯:姜敏)

國家自然科學基金資助項目(81272323);江蘇省自然科學基金資助項目(BK2011244);教育部第46批留學回國人員科研啟動基金資助項目

吳榮強，男，1982年生，學士，主管技師，主要從事臨床生物化學檢驗研究。

王蘇建，聯(lián)系電話:0519－88132707。