徐鳴皋,丁進亞,徐 娟，孫 潔

(廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院檢驗科，武漢 430070)

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WalkAway 40誤鑒定布魯菌1例

徐鳴皋,丁進亞,徐 娟，孫 潔

(廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院檢驗科，武漢 430070)

布魯菌； 16S rRNA； 誤鑒定

布魯菌被列為B類生物恐怖戰(zhàn)劑，同時也是導致實驗室獲得性感染的重要病原菌。因此實驗室能夠準確、快速、安全的鑒定這種病原菌就顯得至關重要。從患者血液、骨髓、其他體液及排泄物等任一培養(yǎng)物中分離出布魯菌即可確診為布魯菌病。目前臨床實驗室廣泛使用的全自動血液培養(yǎng)系統(tǒng)如BACTEC和BacT/ALERT已經顯著提高了從標本中分離出布魯菌的速率[1-2]。但是在使用自動化的細菌鑒定系統(tǒng)的過程中，布魯菌的誤鑒定一直都存在。本院從1例不明原因發(fā)熱患者血液和骨髓中分離出1株緩慢生長細菌，由WalkAway 40鑒定為動物潰瘍威克斯菌、莫拉菌屬等，而Vitek2 Compact和16S rRNA 基因序列檢測鑒定為布魯菌。

1 臨床資料

1.1 一般資料 患者,男性，17歲。入院20 d前于體能訓練后出現(xiàn)咽痛，繼而出現(xiàn)畏寒、發(fā)熱，體溫最高達40.1 ℃?；颊甙l(fā)熱時感頭痛，咽痛，熱退后無特殊不適感，無大汗淋漓，無全身關節(jié)疼痛。曾在單位衛(wèi)生隊給予退熱處理，體溫下降后又復升，且咽痛程度加重，吞咽時尤甚，遂來本院就診。本院門診查血常規(guī)、肺部X線片正常，雙側扁桃體Ⅱ度腫大，可見白色豆渣樣分泌物，以“急性扁桃體炎”收入感染內科。入院時患者否認近期禽類接觸史，否認密切接觸人群有類似癥狀。入科后查白細胞介素-6 26.0 pg/mL；抗“O”315.00 U/mL↑、C反應蛋白12.40 mg/L↑，考慮“化膿性扁桃體炎”可能性較大。依次使用過哌拉西林鈉舒巴坦鈉、克林霉素、左旋氧氟沙星等，因患者持續(xù)高熱不退一度將抗菌藥物調整為替考拉寧?；颊呷肟坪蠹葱醒号囵B(yǎng)和骨髓培養(yǎng)，血液與骨髓經BacT/Alert 3D240培養(yǎng)48 h報陽性，轉種血瓊脂平板，經2 d培養(yǎng)形成針尖樣細小菌落，革蘭染色呈紅色短小桿菌，氧化酶陽性，動力陰性。取血瓊脂平板上菌落分別使用WalkAway 40和Vitek2 Compact鑒定。WalkAway 40 NC31鑒定藥敏復合板將血液中分離株鑒定為動物潰瘍威克斯菌(74.18%)、洛菲不動桿菌(23.37%)；將骨髓分離株鑒定為莫拉菌屬(40.14%)、動物潰瘍威克斯菌(21.86%)等。而Vitek2 Compact GN鑒定卡將血液和骨髓中分離株均鑒定為馬耳他布魯菌(99%、98%)。因兩種細菌鑒定系統(tǒng)結果不一致，將菌株送至軍事科學院復檢。因患者入院時正值重點防控禽流感時期，接觸史中僅明確無禽類接觸史，立刻詢問患者是否有牛羊接觸史，患者否認?；颊咴谑褂锰婵祭瓕幒篌w溫逐漸降低，目前體溫正常。臨床因報告疑似布魯菌，將抗菌藥物更改為米諾環(huán)素+利福平，但更改抗菌藥物后患者體溫持續(xù)升高，最高達40.4 ℃。后軍事醫(yī)學科學院回報經16S rRNA基因檢測確證為布魯菌。同時患者回憶起曾于1個月前清掃羊圈，誤將羊糞吸入口鼻，1周后出現(xiàn)發(fā)熱癥狀。在接觸史和病原學檢測結果明確后確診為布魯菌病，抗菌藥物更改為利福平膠囊+多西環(huán)素+復方磺胺甲噁唑片，3 d后患者體溫峰值出現(xiàn)下降趨勢，最高體溫降至37.8 ℃，5 d后體溫完全正常，未再反復。在患者確診為布魯菌病后，患者單位追查羊只去向，查得部分羊只已死亡，并被掩埋，剩余羊只均未檢出布魯菌，也未有新的病例發(fā)生。

1.2 標本來源 2013年廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院一名發(fā)熱患者的血液和骨髓。

1.3 儀器及試劑 BACT/ALERT 3D240血培養(yǎng)儀，質控菌株：銅綠假單胞菌(ATCC 27853)；西門子Walkaway 40(軟件版本V3.0)，NC31鑒定藥敏復合板(批號20120922)，質控菌株：大腸埃希菌(ATCC 25922)、銅綠假單胞菌(ATCC 27853)；梅里埃Vitek2 Compact(軟件版本5.04),GN鑒定卡 (批號241254040)，質控菌株：嗜麥芽窄食單胞菌(ATCC 17666)。

1.4 菌株分離培養(yǎng) 取陽性培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液三區(qū)劃線接種于血瓊脂平板，分別置于35 ℃孵箱和5%CO2孵箱孵育，每日觀察平板生長狀況及菌落形態(tài)。

1.5 16S rRNA基因檢測 送至軍事醫(yī)學科學院進行基因測序。

2 討 論

布魯菌被誤鑒定為動物潰瘍威克斯菌或其他細菌是非常危險的。(1)誤鑒定會導致實驗室工作人員無法采取正確的防護措施。世界衛(wèi)生組織將布魯菌列為危險度3級的病原微生物，最低防護要求至少在BSL-2實驗室中使用Ⅱ級生物安全柜進行相關操作。而WalkAway 40的鑒定藥敏復合板為開放型，檢測孔均裸露在外且必須使用手工加樣、上板、下板。其上板、下板等操作無法在生物安全柜中完成，在病原菌不明的情況下大大增加了工作人員被感染的概率。相對而言，Vitek2 Compact使用的鑒定卡完全密封，并且采用全自動封閉真空加注系統(tǒng)，自動進行鑒定卡的進樣、封口、上卡、退卡，安全性明顯高于WalkAway 40。(2)該患者入院初期相關接觸史不明確，起病過程不典型，呈持續(xù)發(fā)熱表現(xiàn)，而非典型的波浪熱，也未有關節(jié)疼痛等相關癥狀，從而增加了臨床診斷的難度，如果誤鑒定為動物潰瘍威克斯菌或莫拉菌屬等，則錯誤的診斷和病情的延誤將難以避免，這會使患者經歷錯誤的抗菌藥物治療，失去早期治療的最佳時機而發(fā)展為慢性全身性感染[3]。(3)如不能及時處理患有布魯菌病的羊只，流入市場或將布魯菌傳染給其他羊只或密切接觸人群，導致布魯菌病爆發(fā)。

自動化細菌鑒定系統(tǒng)對布魯菌的誤鑒定已有相關報道，分析原因可能有如下幾點:布魯菌的生化反應不活潑,鑒定系統(tǒng)缺乏布魯菌的相關數(shù)據(jù)庫，缺少對應的鑒定卡，加樣讀數(shù)等因素導致某些生化反應速度產生差異等。雖然Vitek2 Compact鑒定布魯菌的文獻報道很多，但亦有誤鑒定的報道。楊婧等[4]報道2011～2012年有3株布魯菌在首次鑒定中被誤鑒定為支氣管敗血鮑特菌(1株)和人蒼白桿菌(2株)，而在第2次鑒定中均鑒定為布魯菌。基于生化方法的不確定性，越來越多的實驗室使用分子生物學方法來鑒定布魯菌。目前，通過16S rRNA 的聚合酶鏈反應擴增及其產物測序，可以進行快速診斷，能夠區(qū)分不同種源的布魯菌，可用于布魯菌種屬的快速鑒定和流行病學調查，具有良好的特異性、靈敏度和穩(wěn)定性[5-6]。

布魯菌病的發(fā)生、發(fā)展和轉歸比較復雜，其臨床表現(xiàn)往往不典型，很難以一種癥狀來確診，易引起漏診、誤診[7]。對布魯菌病的診斷需結合接觸史、臨床表現(xiàn)和病原學檢查來做出綜合判斷。特別是在非布魯菌病流行區(qū)，在缺乏明顯的流行病學接觸史，沒有典型的臨床表現(xiàn)時，病原學檢查就顯得尤為重要。實驗室工作人員應加強和臨床醫(yī)生的溝通，對和動物有密切接觸史的患者應高度重視布魯菌的檢出。如果該病因延誤治療而進入慢性期，會對患者造成不可逆轉的損害，甚至可能造成終身殘疾?；谧詣踊毦b定系統(tǒng)易出現(xiàn)誤鑒定的情況，使用這類系統(tǒng)檢出動物潰瘍威克斯菌、支氣管敗血鮑特菌、人蒼白桿菌等罕見細菌時，應該使用分子生物學方法進行確證，降低布魯菌被誤鑒定成其他細菌的可能性。

[1]Yagupsky P,Peled N,Press J,et al.Rapid detection of Brucella melitensis from blood cultures by a commercial system[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis,1997,16(8):605-607.

[2]楊銘，汪定成，邵海連，等．全自動血培養(yǎng)儀中布魯菌陽性報警時間及與其他病原菌的比較[J]．中國感染控制雜志，2013，12(6)：451-453．

[3]劉俊賢，韓國毅，梁占魁．492例布氏菌病患者臨床特點分析[J]．中國地方病防治雜志，2007，22(4)：306-307．

[4]楊婧，任曉慶，褚美玲，等．細菌自動鑒定儀3例布魯氏菌誤鑒定及文獻復習[J]．國際檢驗醫(yī)學雜志，2012，33(20)：2491-2494．

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[6]姜鳳華，于剛．布魯氏菌PCR快速檢測方法的建立[J]．現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2008(2)：4-5．

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10.3969/j.issn.1672-9455.2015.04.065

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1672-9455(2015)04-0575-02

2014-05-11

2014-09-18)