黎籽秀 劉 博 徐凌麗 楊 琳 王慧君 周文浩

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高通量測序數(shù)據(jù)分析和臨床診斷流程的解讀

黎籽秀1劉 博2徐凌麗3楊 琳3王慧君4周文浩4

高通量測序技術(shù)也稱二代測序技術(shù)，可以一次對幾十至幾百萬條短序列片段同時進行測定。該技術(shù)的出現(xiàn)使研究者可以對一個物種的基因組、轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳組進行全面的分析?；蚪M二代測序可用于對全基因組、全外顯子組或感興趣的特定區(qū)域進行序列測定。通常，基因組二代測序的目的是檢測個體基因組范圍內(nèi)的遺傳變異，包括單堿基變異(SNVs)、插入缺失變異(Indels)、拷貝數(shù)變異(CNVs)和結(jié)構(gòu)變異(SVs)，并最終篩選出致病突變[1]。

近年來，基因組二代測序開始逐步應用于臨床分子診斷[2～8]，不僅能幫助醫(yī)生明確患者的遺傳學病因，指導治療及判斷預后，更重要的是可為遺傳咨詢提供明確的指導。根據(jù)患兒及其父母的遺傳信息，可判斷患兒致病成因是新生突變還是遺傳于父母，以此評估父母生育下一胎時的疾病遺傳風險，對家庭的“優(yōu)生”提供更好的指導。

基因組二代測序技術(shù)與傳統(tǒng)分子檢測技術(shù)不同，可以同時對大量基因進行檢測，一次性獲得海量的數(shù)據(jù)。因此，構(gòu)建一個基于遺傳性疾病診斷需要的基因組二代測序數(shù)據(jù)分析流程，以期從眾多變異中篩選出潛在致病突變，顯得尤為重要。復旦大學附屬兒科醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學中心團隊在美國貝勒醫(yī)學院人類與分子遺傳系的學習、交流和指導下，通過參閱既往數(shù)據(jù)分析相關(guān)文獻[1,2,9]以及建立流程的實際經(jīng)驗，建立一套高通量測序數(shù)據(jù)分析和臨床診斷流程(圖1)，包括測序數(shù)據(jù)預處理及變異檢測、變異注釋、變異篩選和變異分類等，清晰地向臨床醫(yī)生展現(xiàn)了變異篩選過程的概況，使研究者聚焦到更具有生物學意義、臨床相關(guān)的變異，并為國內(nèi)開展基于基因組二代測序技術(shù)的遺傳性疾病診斷思考提供了基本路線圖。復旦大學附屬兒科醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學中心應用該流程分析了87例多發(fā)畸形患兒的WES數(shù)據(jù)，得到的候選變異經(jīng)由遺傳?？漆t(yī)生進行分析，檢出的陽性率為25%，與目前認為WES的檢出陽性率一致。

圖1 高通量測序數(shù)據(jù)分析和臨床診斷流程

1 測序數(shù)據(jù)預處理及變異檢測

基因組二代測序初始數(shù)據(jù)是由熒光或電信號組成的圖像信息，圖像信息可通過相應測序平臺提供的軟件經(jīng)堿基識別(Base Calling)轉(zhuǎn)化成FASTQ或FASTA格式的原始序列數(shù)據(jù)(Raw data)。Raw data去除接頭以及低質(zhì)量的讀序后，采用BWA軟件[10]將其定位到人類基因組的參考序列上，通過picard

(http://picard.sourceforge.net)和SAMtools軟件[10]將建庫過程中由于PCR擴增產(chǎn)生的冗余信息去掉。最后用GATK[11,12]檢測變異，包括SNVs和Indels。目前，測序數(shù)據(jù)預處理及變異檢測已形成較為成熟的生物信息分析流程。大多數(shù)測序公司均能提供完成此流程的服務。

2 注釋

基因組二代測序技術(shù)產(chǎn)生了大量的遺傳變異數(shù)據(jù)，其中僅少數(shù)變異具有功能意義。為了從眾多變異中鎖定可能的致病突變，需要從不同層面對變異進行注釋。注釋過程主要通過ANNOVAR和VEP(Variant Effect Predictor)軟件及自行添加進行注釋。

ANNOVAR[13]是第一個對遺傳變異進行注釋的軟件。經(jīng)過ANNOVAR 的注釋，可對變異有多層面的了解，便于對其進行后續(xù)篩選。ANNOVAR對變異的注釋包括以下3個方面，①基因的注釋：注釋信息包括變異類型，引起蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)改變的情況等?？梢造`活地使用RefSeq基因、UCSC基因、ENSEMBL基因、GENCODE基因或其他基因定義系統(tǒng)進行位點-基因定位注釋；②區(qū)域的注釋：對變異位點所處的基因組環(huán)境進行注釋，位點的基因組環(huán)境包括位點的保守性、轉(zhuǎn)錄因子、非轉(zhuǎn)錄RNA結(jié)合強弱和表觀遺傳標記物靶向性等信息；③過濾的注釋：其注釋結(jié)果可對變異進行后續(xù)篩選，包括變異在不同群體頻率的注釋，變異位點在dbSNP的注釋，位點對蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)影響預測的注釋，位點與疾病關(guān)聯(lián)的注釋。

VEP[14]是Ensembel和Ensembel基因組最常用的工具之一，用以研究變異對基因、轉(zhuǎn)錄本、蛋白質(zhì)和調(diào)控區(qū)域所造成的影響。

雖同為變異注釋軟件，但VEP與ANNOVAR存在區(qū)別，①ANNOVAR選用NCBI的RefSeq參考序列注釋，VEP選用Ensembl的轉(zhuǎn)錄本集合作為參考序列注釋；②注釋策略存在差異，ANNOVAR注釋為同義突變的位點，VEP可能將其注釋為錯義突變。因此，2個注釋軟件針對同一個變異的注釋結(jié)果可進行相互補充。

除使用上述2個軟件進行注釋外，還有諸如蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(Swiss-Prot)、人類基因突變數(shù)據(jù)庫(HGMD)以及內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(in-house database)等提供的重要參考信息需要人工添加進行注釋。

2.1 基因注釋參考的數(shù)據(jù)庫

2.1.1 The Reference Sequence(RefSeq) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/。RefSeq是美國國家生物信息技術(shù)中心(NCBI)提供的具有生物學意義的非冗余的DNA、RNA和蛋白質(zhì)參考序列數(shù)據(jù)庫。RefSeq為基因注釋，突變及多態(tài)性分析，基因表達研究等提供了重要的參考標準[15]。RefSeq提供了基因的染色體號、基因所在染色體位置、基因轉(zhuǎn)錄起始終止位點、翻譯起始終止位點和各個外顯子的起始終止位置等信息。使用RefSeq對變異位點進行基因注釋可明確發(fā)生變異的基因，變異所處基因功能區(qū)域，變異類型以及氨基酸改變的情況。

2.1.2 蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)(Swiss-Prot) http://www.uniprot.org/。Swiss-Prot是一個人工注釋的、非冗余的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫。該數(shù)據(jù)庫中的所有條目均由分子生物學家和蛋白質(zhì)化學家通過計算機工具預測并查閱相關(guān)文獻進行仔細核實。Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫是目前最全面的注釋蛋白質(zhì)序列庫，其目的是對蛋白質(zhì)提供全面的已知相關(guān)信息。許多序列分析軟件被用于Swiss-Prot條目注釋。軟件分析結(jié)果通過人工評估后，被選擇性地加入條目注釋中。數(shù)據(jù)庫中每個條目均有詳細的注釋，包括蛋白質(zhì)、基因名字、蛋白質(zhì)功能、表達模式、結(jié)構(gòu)域、功能位點、跨膜區(qū)域、二硫鍵位置、翻譯后修飾、突變體及其與疾病的關(guān)系等。Swiss-Prot目前包含547 357例條目，并與其他30多個數(shù)據(jù)庫交叉引用，例如PDB、OMIM和PROSTITE等。

2.2 變異/基因與疾病關(guān)系注釋參考的數(shù)據(jù)庫

2.2.1 人類基因突變數(shù)據(jù)庫(HGMD)[16]http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php。HGMD由英國卡爾地夫醫(yī)學遺傳研究所構(gòu)建。HGMD用計算機和手工結(jié)合的方法從已發(fā)表在期刊中收集與人類遺傳疾病相關(guān)的突變信息，是目前收錄人類突變信息最全的數(shù)據(jù)庫。截至2014年12月18日，HGMD收錄疾病相關(guān)變異的數(shù)量在免費版本中為108 508個，在專業(yè)版本中為156 932個[17]。HGMD中記錄的突變信息包括突變類型列表、對應的疾病列表和相應的參考文獻。其中突變類型包括在編碼區(qū)、調(diào)控區(qū)和剪接區(qū)域中的大片段插入缺失、微片段插入缺失、基因組重組、重復變異、致病點突變、致病點移碼、致病點無義、影響可變剪接的變異和與疾病相關(guān)的多態(tài)性位點，包括在所研究的疾病組和對照組差異有統(tǒng)計學意義的位點和已被報道能影響基因表達或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的位點。HGMD的免費版本只能在線查找基因變異信息[16]。

HGMD根據(jù)變異位點和疾病的關(guān)聯(lián)程度以及位點的突變類型等信息對位點進行分類，包括①致病突變(DM)，即目前認為該突變能直接導致疾?。虎谝伤浦虏⊥蛔?DM?)，即該變異曾被認為是致病突變，但基于基因組/群體篩查或其他發(fā)現(xiàn)該突變可能與病理無關(guān)或為中性突變。隨著突變信息的累積，若該變異被確認不是DM，可能會被徹底從數(shù)據(jù)庫刪除; ③疾病相關(guān)的多態(tài)性變異(DP)，即疾病/表型顯著相關(guān)的多態(tài)性位點，根據(jù)位點復制、進化保守性等信息認為這些變異有一定的功能，但目前尚無功能實驗證實(如表達研究);④有功能證據(jù)支持的疾病相關(guān)多態(tài)性變異(DFP)，即有功能實驗證實(如：表達結(jié)果改變，mRNA研究等)的疾病/表型顯著相關(guān)的多態(tài)性位點；⑤體外/實驗室或體內(nèi)功能的多態(tài)性變異(FP)，即影響一個基因(或基因產(chǎn)物)的結(jié)構(gòu)、功能或表達，但目前尚未報道與疾病關(guān)聯(lián)的多態(tài)性位點；⑥移碼或truncating變異(FTV)，即被預測能引起基因編碼蛋白質(zhì)的改變或截短，但目前未報道與疾病關(guān)聯(lián)或致病的變異。

DP、DFP、FP和FTV類型的變異約占HGMD報道變異的5.5%，同時，這4種類型的變異直接致病性證據(jù)不強，所以WES流程篩選罕見遺傳性疾病的致病突變時應當優(yōu)先關(guān)注DM和DM?。

2.2.2 在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(OMIM)[18]http://omim.org/。OMIM是由美國約翰霍普金斯大學于1968年建立的關(guān)于人類基因和基因突變的數(shù)據(jù)庫。每日更新以提供全面而權(quán)威的基因遺傳和疾病表型信息，截至2014年12月15日，OMIM數(shù)據(jù)庫收錄了22 700個詞條；分子基礎(chǔ)已知的表型有5 369個，疾病基因有3 309個。OMIM條目包括基因和突變的文字描述、病例記錄、分子診斷、參考文獻和與其他數(shù)據(jù)庫的鏈接。

區(qū)別于HGMD提供基因所有的變異位點信息，大多數(shù)OMIM基因更關(guān)注疾病基因的第一個突變，對應表型最常見的突變以及具有不尋常特征的突變，包括特殊突變類型，特殊突變致病機制，特殊突變遺傳模式(如在相同基因中，部分突變?yōu)轱@性遺傳模式，部分為隱性遺傳模式)等。除此之外，OMIM提供較為全面的疾病臨床表型譜，為臨床醫(yī)生和研究者根據(jù)患者的表型信息對診斷疾病提供依據(jù)[19]。

OMIM數(shù)據(jù)庫存儲的疾病信息以孟德爾遺傳病為主，近年來也收錄了許多復雜疾病以及復雜疾病易感的多態(tài)性位點等信息[20]。因此，在研究罕見遺傳疾病時，需要對OMIM數(shù)據(jù)庫中的疾病分等級對待，具有OMIM號的單基因疾病優(yōu)先被考慮。

2.2.3 Clinvar[21]http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/。為了促進和加速對基因型與表型之間關(guān)系的研究，NCBI于2013年4月正式啟動ClinVar公共免費數(shù)據(jù)庫。ClinVar數(shù)據(jù)庫旨在整合NCBI以及各種遺傳變異和臨床表型數(shù)據(jù)庫，通過標準的命名法來描述疾病，將變異、臨床表型、實證數(shù)據(jù)和功能注解與分析4個方面的信息，通過專家評審，逐步形成一個標準的、可信和穩(wěn)定的遺傳變異-臨床表型相關(guān)的數(shù)據(jù)庫。

ClinVar數(shù)據(jù)庫與其他“變異/基因-疾病”數(shù)據(jù)庫的重要區(qū)別在于該數(shù)據(jù)庫有一系列的專家小組對大量數(shù)據(jù)進行評估和歸納，能更好地理解基因型和重要表型之間的關(guān)系。對于感興趣的變異，ClinVar除了列舉突變類型，突變與疾病對應關(guān)系等基本信息外，還包括該變異的臨床意義(分為9個類別，其中類別4和5在尋找罕見遺傳性疾病候選突變時應優(yōu)先考慮)，專家對變異與疾病關(guān)聯(lián)可信度的評價(分為4星級，變異和疾病的關(guān)聯(lián)可信度達到3星級以上則表明該變異已通過專家小組的評估審核，可明確變異和疾病存在關(guān)聯(lián)性)。2.3 突變頻率注釋參考的數(shù)據(jù)庫

2.3.1 千人基因組計劃(1000 Genome Project) http://www.1000genomes.org/ 。“千人基因組計劃”是2008年初由英國Sanger研究所、美國國立人類基因組和中國華大基因研究所共同啟動的、以二代測序技術(shù)為主導的人類基因組計劃三期工程。千人基因組的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，每個人平均攜帶250～300個未報道過的變異，其中50～100個變異與遺傳病有關(guān)[22]。千人基因組計劃項目的開展，不僅加速了對常見疾病易感性基因的發(fā)現(xiàn)，還將加深對人類基因組結(jié)構(gòu)差異的認識，為解釋人類重大疾病的發(fā)病機制，開展疾病個性化預測、預防和治療奠定了基礎(chǔ)。千人基因組計劃完成了基因組科學從基礎(chǔ)向應用過渡的關(guān)鍵戰(zhàn)略轉(zhuǎn)移，有效地推進了臨床轉(zhuǎn)化醫(yī)學的興起和發(fā)展[23]。

2.3.2 The Exome Aggregation Consortium(ExAC) http://exac.broadinstitute.org/。ExAC是一個專門研究外顯子組測序數(shù)據(jù)的聯(lián)盟機構(gòu)，整合了多個外顯子組測序計劃。截止于2014年12月3日，數(shù)據(jù)庫收錄了91 796個樣本的外顯子測序數(shù)據(jù)，其中包括61 486個獨立樣本的數(shù)據(jù)。為了更好地統(tǒng)計變異頻率，ExAC使用相同的測序數(shù)據(jù)預處理及變異檢測分析流程對外顯子測序數(shù)據(jù)進行處理，即以GRCH37/hg19基因組作為人類基因組參考序列，用dbSNP135對變異進行注釋。ExAC是目前收錄不包含嚴重兒童疾病樣本的最大數(shù)據(jù)庫，因此該數(shù)據(jù)庫能更好地作為研究兒童孟德爾遺傳病的對照[24]。

2.4 變異預測注釋參考的軟件

2.4.1 SIFT(Sorting Intolerant From Tolerant)[25,26]http://sift.jcvi.org/。SIFT是一種基于序列同源性對氨基酸的替換容忍度進行評分，以預測氨基酸替換是否影響表型的軟件。2001年，Ng和Henikoff發(fā)現(xiàn)重要的氨基酸位點在蛋白質(zhì)家族序列中較為保守，這些保守位點上發(fā)生的氨基酸替換更有可能影響蛋白質(zhì)功能?；谠摷僭O，Ng和Henikoff采用位置相關(guān)評分矩陣(PSSM)來描述序列保守性信息[27]，開發(fā)了預測錯義突變對蛋白質(zhì)功能影響的軟件SIFT。SIFT分數(shù)歸一化后范圍為0～1，其中，分數(shù)<0.05是有害替換(Deleterious)，≥0.05是可容忍的替換(Tolerate)。值得注意的是，應用SIFT軟件對錯義突變進行功能預測的前提是必須有足夠的同源序列，否則其預測精度將下降，甚至無法進行預測[28]。

2.4.2 Polyphen-2 (Polymorphism Phenotyping v2)[29]http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/。Polyphen-2是通過整合蛋白質(zhì)序列和蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)特征，來預測人類蛋白質(zhì)的氨基酸替換對結(jié)構(gòu)和功能影響的軟件。采用貪婪迭代算法，從19個基于序列和13個基于結(jié)構(gòu)的特征中，自動選取了8個基于序列和3個基于結(jié)構(gòu)的特征來進行預測。其中序列特征包括變異位點所處于在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域(Pfam)的位置信息，是否導致CpG位點發(fā)生轉(zhuǎn)換(Transition)等，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征包括溶劑可及性、SNP位點在 β鏈或活動區(qū)域的位置等。該方法有較高敏感度和特異度的前提是有可靠的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息進行參考。Pholyphen-2有HumVar和HumDiv兩種模型。在對于孟德爾遺傳病的診斷分析中，HumVar模型產(chǎn)生的分數(shù)更適用于診斷。運行Pholyphen-2算法進行打分后，分數(shù)的范圍為0～1。分數(shù)越高的替換意味著有越大的破壞蛋白功能的可能，如果分數(shù)在0.957～1，其相應的預測結(jié)果為“probably damage”，在0.453～0.956為“possible damage”，在0～0.452為“benign”。

2.4.3 MutationTaster[30]http://www.mutation-taster.org/。MutationTaster是通過使用進化保守性、剪切位點改變和mRNA水平的變化引起的蛋白質(zhì)特征丟失等信息，來評估序列變異帶來的致病可能性的軟件。HGMD專業(yè)版本中提供的390 000個已知致病突變位點信息作為陽性數(shù)據(jù)集，千人基因組計劃中>6 800 000個無致病突變的多態(tài)性信息作為陰性數(shù)據(jù)集，用貝葉斯分類算法對陰、陽性數(shù)據(jù)集建模，對感興趣的位點進行預測，預測結(jié)果的分數(shù)為0～1，分數(shù)越高意味著致病可能性越大，根據(jù)預測提示的分數(shù)及先驗信息校正后，軟件會對變異的致病可能性進行分類，具體說明如下：①A:disease_causing_automatic，變異在ClinVar中標記為致病性或者該變異是導致終止密碼子提前的無義突變；②D: disease_causing，變異被軟件預測為致病性突變；③N: polymorphism，變異被軟件預測為多態(tài)性；④P: polymorphism_automatic，變異在HapMap數(shù)據(jù)中存在3種基因型 AA、AB和BB或在千人基因組計劃數(shù)據(jù)集中顯示純合突變頻數(shù)>4。

3 篩選

3.1 質(zhì)量控制 針對某個特定位點，若覆蓋該位點的讀序總數(shù)小于覆蓋該位點變異和未變異堿基的讀序數(shù)目之和，則表明該位點的質(zhì)量未達標，應將其去除。該篩選過程可將小部分的SNVs和約一半的Indels篩除。

3.2 頻率篩選 基因變異程度可根據(jù)最小等位基因頻率(MAF)進行劃分。MAF值5%～50%的變異為常見變異，1%～5%為少見變異，<1%則為罕見變異[31]?；诤币娂膊∈怯珊币娮儺愃鶎е碌倪@一假說，在研究罕見疾病的致病變異時，應去除非罕見變異。

基于變異頻率的篩選方式為：① 變異已被HGMD報道，表明該變異更有可能與疾病相關(guān)，此時將注釋的公共數(shù)據(jù)庫的變異頻率篩選閾值設置為5%。②變異未被HGMD報道，此時將注釋的公共數(shù)據(jù)庫的變異頻率篩選閾值設置為1%[2]。③如果研究機構(gòu)擁有收錄不同疾病患者信息的內(nèi)部數(shù)據(jù)庫，若變異在內(nèi)部數(shù)據(jù)庫10%的家系中出現(xiàn)，則應當去除該變異；當內(nèi)部數(shù)據(jù)庫中無關(guān)個體數(shù)量達到1 000例時，篩選閾值可降至4%。使用內(nèi)部數(shù)據(jù)庫的優(yōu)勢在于：一方面內(nèi)部數(shù)據(jù)庫位點的變異頻率更符合中國人群的變異頻率，另一方面可去除由相同測序平臺導致的系統(tǒng)誤差。

3.3 分類篩選 根據(jù)所處基因組位置的不同，可將變異分為編碼區(qū)變異和非編碼區(qū)變異。研究發(fā)現(xiàn)，85%的致病突變都位于編碼區(qū)中，其中絕大部分位于外顯子上；極少數(shù)位于內(nèi)含子上，可通過影響基因的可變剪接致病[32]。沒有被HGMD報道的位于非編碼區(qū)的變異，或者距離外顯子區(qū)>5 bp的內(nèi)含子變異(不能影響mRNA的剪接)被篩選掉[2]。

保留下來的突變，根據(jù)突變對蛋白質(zhì)序列影響的不同，可以分為同義突變、錯義突變、無義突變、終止密碼突變、剪接位點突變、移碼突變和整碼突變。無義突變、剪接位點突變和移碼突變被稱為truncating突變，能造成蛋白質(zhì)缺失。同義突變不會引起蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的改變，整碼突變與終止密碼突變雖然一定程度上改變蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)，但由于保留了基因閱讀框的次序，所以一般情況下不會造成蛋白質(zhì)的功能缺陷。因此，尋找罕見疾病的候選致病突變優(yōu)先考慮能引起蛋白質(zhì)功能缺陷的變異。

4 變異分類

本文通過參閱ACMG(American College of Medical Genetics)[33]對變異的分類標準，并結(jié)合實際研究經(jīng)驗，基于基因是否在OMIM/HGMD中被報道為致病基因，同時考慮突變頻率和類型，既往報道和臨床表現(xiàn)，根據(jù)變異的臨床可信度對變異進行分類。

4.1 已報道致病突變位點 已經(jīng)被報道為致病突變，并且既往報道該變異導致疾病的表型譜和患者的臨床表型相符。

4.2 新突變但預測為致病突變 包括無義突變、終止密碼突變、起始密碼子(ATG)突變、移碼突變和剪接供體/受體突變。

4.3 新突變致病性不明確 包括剪接共有序列突變、錯義突變和整碼突變。

4.4 報道與臨床表型相關(guān)聯(lián)但致病性不明確 即通過全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)得到的與復雜疾病易感性相關(guān)的變異。

4.5 其他 不滿足上述4類的變異，如：尚不認為能導致疾病的新變異，新發(fā)的同義突變；已報道為中性突變的變異；在公共數(shù)據(jù)庫中有一定突變頻率的罕見變異，這類罕見變異部分可構(gòu)成常染色體隱性遺傳模式而致病。

5 結(jié)合遺傳模式和臨床綜合判斷

針對候選致病突變，應當進一步具體結(jié)合相關(guān)疾病的遺傳模式以及患者實際的臨床表型進行綜合判斷。

就單基因病的常染色體遺傳模式而言，如果疾病為常染色體顯性遺傳模式，則其致病基因一般僅發(fā)生單個位點的嚴重突變，且該突變在正常人群中極有可能為新發(fā)突變。如果疾病為常染色體隱性遺傳模式，則其致病基因上將發(fā)生至少2個嚴重突變。符合這種遺傳模式的突變，可在正常人群中有一定的突變頻率，但一般情況下不會出現(xiàn)純合子[2]。若在致病基因上發(fā)生的突變不符合相關(guān)疾病的遺傳模式(如疾病為常染色體隱性遺傳模式，但在該疾病相關(guān)基因上僅發(fā)生單位點雜合突變)，該突變位點應當被滯后考慮[38]。

對于患者的潛在致病突變，須將其臨床表型與突變基因?qū)谋硇妥V進行比對。收集諸如患者病歷、家族史等信息，將有助于明確患者的致病成因[1]。

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(本文編輯：張崇凡)

首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院2015年國家級繼續(xù)醫(yī)學教育項目(一)

10.3969/j.issn.1673-5501.2015.01.003

上海市衛(wèi)生局重要疾病攻關(guān)項目:2013ZYJB0015；上海市科委/醫(yī)學領(lǐng)域重點項目子課題：14411950402,14DJ1400103；上海市衛(wèi)計委項目：滬衛(wèi)計科教〔2013〕018號

1 復旦大學生物統(tǒng)計學與計算生物學系 上海，200433；2 華中農(nóng)業(yè)大學 武漢，430072；3 復旦大學附屬兒科醫(yī)院 上海，201102；4 上海市出生缺陷防治重點實驗室，復旦大學兒童發(fā)育與疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究中心，衛(wèi)生部新生兒疾病重點實驗室，復旦大學附屬兒科醫(yī)院 上海，201102

周文浩，E-mail：zwhchfu@126.com

2014-12-17

2015-01-20)