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正常大鼠體內女貞子紅景天苷制備物藥代動力學表征研究

2015-04-21 08:03彭平趙麗敏劉斌姜艷艷馮朵孫道涵楊書娟朱乃亮石任兵
環(huán)球中醫(yī)藥 2015年3期
關鍵詞:女貞子紅景天血藥濃度

彭平 趙麗敏 劉斌 姜艷艷 馮朵 孫道涵 楊書娟 朱乃亮 石任兵

紅景天苷為中藥紅景天特性功效成分。現(xiàn)代藥理學研究表明,紅景天苷及其苷元酪醇均具有抗炎、抗腫瘤、保護心腦血管及其它臟器等作用[1-3]。為了解決基于紅景天苷的藥物開發(fā)資源問題,本課題組研究建立了基于堿轉化大孔吸附樹脂分離富集,由女貞子制備紅景天苷系列制備物的工藝方法與質量控制體系,經放大驗證工藝經濟穩(wěn)定簡便可行[4-9],從而為基于紅景天苷的藥物創(chuàng)新提供了藥原支撐。目前已報道了諸多體內外紅景天苷的含量測定方法,但對其代謝產物酪醇含量的同時測定方法只有超高效液相色譜-串聯(lián)質譜(UPLC-MS/MS)[10-11],使得分析條件因儀器昂貴而受到一定的限制,鑒于此,筆者建立UPLC-PDA 同時測定制備物紅景天苷及酪醇體內外含量的分析方法,并成功應用于制備物質量控制與藥物動力學表征及其類藥特性的系統(tǒng)研究,在研究中發(fā)現(xiàn)了制備物、紅景天苷與酪醇以及所構建的有關藥物體系體內表征特性,體現(xiàn)出藥物體系的三大基本特性:自然性、協(xié)同性、親和性[12-13]。研究結果為深入系統(tǒng)進行制備物藥物研究奠定了基礎,同時亦為基于紅景天苷的藥物創(chuàng)新提供研究思路與分析方法學借鑒。

筆者擬陸續(xù)系統(tǒng)報道有關研究結果,本文首先報道所建立的UPLC-PDA 同時測定大鼠血清中制備物紅景天苷及酪醇的含量分析方法,與應用于藥代動力學表征及其類藥特性的研究結果。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters ACQUITY 超高效液相色譜儀,PDA 檢測器,Empower 工作站,自動進樣;Waters ACQUITY UPLC H-CLASS T3 色譜柱(50 mm ×2.1 mm,1.8 μm),METTLER TOLEDO XS204(METTLER TOLEDO,瑞士),METTLER TOLEDO XP26(METTLER TOLEDO,瑞士),sigma 1-14 小型臺式離心機(sigma,德國),Labconco ? CentriVap 離心濃縮儀(LABCONCO,美國),渦旋混合器(其林貝爾,中國),0.2 μm 微孔濾器。

1.2 藥品與試劑

紅景天苷對照品(北京方程生物科技有限公司,批號130426;含量99.9%)、水楊苷對照品(北京方程生物科技有限公司,生產批號121118;含量99.9%)、酪醇對照品(北京方程生物科技有限公司,批號120927;含量99.9%)、高氯酸(分析純,天津市鑫源化工有限公司)、色譜乙腈(色譜純,F(xiàn)isher公司)、哇哈哈純凈水。

女貞子紅景天苷制備物:取女貞子藥材(浙江產地)70%乙醇提取,經堿轉化后,大孔樹脂分離富集制備而得。(批次:20130926,由課題組制備,樣品經高效液相色譜法測定,紅景天苷含量64.5%,酪醇含量0.2%),

1.3 實驗動物

健康Sprague-Dawley(SD),雌性,大鼠,體質量200 ~220 g,由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供,許可證編號:SCXK(京)2012-0001。

2 方法

2.1 女貞子紅景天苷制備物給藥方案與樣品采集

采用單次正常大鼠口服灌胃100 mg/kg 制備物(樣品中紅景天苷含量64.5%,酪醇含量0.2%),并于給藥后2 分鐘、5 分鐘、10 分鐘、15 分鐘、30 分鐘、45 分鐘、1 小時、1.5 小時、2 小時、3 小時、4 小時、8 小時、12 小時、24 小時時間點(每時間點5 只大鼠)腹主動脈取血,每次5 mL,4000 r/min 離心10 分鐘,分離血清,即為含藥血清,于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 血樣處理方法

取300 μL 含藥血清,置于2 mL 離心管內,準確加入50 μL 質量濃度為100 μg/mL 的內標水楊苷溶液,渦旋30 秒,加0.4 mol/mL 高氯酸180 μL,渦旋30 秒,靜置15 分鐘,14800 r/min 高速離心15 分鐘,取上清液200 μL 加1 μL 50%NaOH 調pH 到6 ~7,過0.22 μm 微孔濾器,供UPLC-PDA 檢測分析。

2.3 體內分析方法建立及液相色譜條件及系統(tǒng)適用性

2.3.1 對照品溶液的配制 精密稱取紅景天苷、酪醇、水楊苷對照品各10 mg,分別置于10 mL 容量瓶中用流動相溶解并定容至10 mL,得質量濃度均為1 mg/mL的母液,用時用流動相稀釋至所需濃度。

Waters ACQUITY 超高效液相色譜儀,PDA 檢測器,Empower 工作站,ACQUITY UPLC H-CLASS T3色譜柱(50 mm ×2.1 mm,1.8 μm);流動相:乙腈-水(3 ︰97),流速為0.3 mL/min;柱溫為25℃;進樣體積為10 μL,檢測波長276 nm。

血清中雜質對成分測定無干擾,且紅景天苷、酪醇和水楊苷分離效果良好,具有較好的專屬性,分析條件可行,色譜圖見圖1。

圖1 空白血清和含藥血清UPLC 色譜對比圖

2.3.2 線性關系與靈敏度考察 取空白血清加入紅景天苷和酪醇混合對照品溶液,配制成紅景天苷濃度分別為1、5、10、25、50、100、200 μg/mL,酪醇濃度分別為0.5、1、5、10、25、50、100 μg/mL 的血清樣品,按血樣處理方法處理并測定,以紅景天苷或酪醇與內標濃度比(X)為橫坐標,紅景天苷或酪醇與內標峰面積之比(Y)為縱坐標繪制標準曲線。紅景天苷體內濃度回歸方程為:Y =1.1958X-0.1421,R=0.9996(n=7),線性范圍為1 ~200 μg/mL,酪醇體內濃度回歸方程為:Y =2.6114X-0.0323,R =0.9996(n =7),線性范圍為0.5 ~100 μg/mL。配制已知濃度的紅景天苷、酪醇對照品溶液測得方法最低檢測限(S/N =3)分別為0.5 μg/mL、0.25 μg/mL,最低定量限(S/N = 10)分別為1 μg/mL、0.5 μg/mL。

2.3.3 回收率與精密度考察 取空白血清加入紅景天苷和酪醇混合對照品溶液配制成低、中、高濃度血清樣品(紅景天苷質量濃度分別為5、25、100 μg/mL,酪醇質量濃度分別為1、10、50 μg/mL)各5 份,按血清處理方法處理測定,每一濃度進行5份樣本分析,連續(xù)測定3 天,根據(jù)標準曲線計算相對回收率(n=5)、絕對回收率(n =5)、日內RSD(n =5)和日間RSD(n=3),見表1。

表1 紅景天苷及酪醇體內含量測定回收率與精密度考察結果

2.3.4 穩(wěn)定性考察 取空白血清加入紅景天苷和酪醇混合對照品溶液,配制成低、中、高濃度的血清樣品(紅景天苷質量濃度分別為5、25、100 μg/mL,酪醇質量濃度分別為1、10、50 μg/mL)各3 份,一份于常溫(24℃)放置24 小時(測定時間為放置0、4、8、12、24 小時),一份于-20 ℃放置30 天(測定時間為放置1、8、15、22、30 天),一份于-80 ℃反復凍融5 次(測定時間為凍融次數(shù)1、2、3、4、5),于相應測定時間測定各血樣中紅景天苷和酪醇的濃度。結果表明紅景天苷和酪醇在-20℃放置及反復凍融條件下穩(wěn)定性較好,見表2。

表2 紅景天苷及酪醇體內含量測定穩(wěn)定性考察結果(n=5)

3 結果

3.1 血藥濃度測定結果

取各組血清樣品制備測定,并計算口服制備物各時間點紅景天苷血藥濃度,結果見表3。在制備物血藥濃度檢測中,于0.5 小時、0.75 小時、1 小時時間點可檢測到酪醇的吸收峰,并計算血藥濃度分別約為0.30 ± 0.03 μg/mL、0.32 ± 0.04 μg/mL、0.21 ±0.03 μg/mL。

表3 紅景天苷制備物給藥后不同時間點紅景天苷的血藥濃度(μg/mL)

3.2 藥代動力學表征分析

采用生物學統(tǒng)計軟件PKSolver 計算得紅景天苷制備物大鼠體內主要成分紅景天苷的藥代動力學參數(shù),見表4,其體內動態(tài)變化藥時曲線見圖2。

表4 制備物紅景天苷大鼠體內藥代動力學參數(shù)

圖2 制備物紅景天苷大鼠體內藥-時曲線

3.3 紅景天苷及酪醇體內外含量相對比值分析

以紅景天苷含量為參比,計算體內外制備物中成分酪醇含量與紅景天苷含量比值,即體外制備物成分含量比值為:酪醇︰紅景天苷;體內成分血藥濃度比值為:酪醇︰紅景天苷,結果見表5。

表5 體內外制備物紅景天苷與酪醇動態(tài)含量比值

結果顯示,以紅景天苷含量為參比,酪醇與紅景天苷含量比值排序為:制備物體外<體內0.5 小時<體內0.75 小時<體內1 小時;在大鼠體內酪醇與紅景天苷含量比值較制備物增大了5.03 ~9.65倍,且從給藥后0.5 小時到1 小時持續(xù)了0.5 小時的增量動態(tài)變化。

4 討論

本研究建立了UPLC-PDA 同時測定大鼠血清中紅景天苷及酪醇的含量分析方法,并成功應用于女貞子紅景天苷制備物藥代動力學表征及其類藥特性研究。研究發(fā)現(xiàn)女貞子紅景天苷制備物在正常大鼠體內類藥成分主要以紅景天苷原型存在,其藥代動力學表征為:吸收快、生物利用度較高;而酪醇表征為體內最大血藥濃度出現(xiàn)相對滯后,且與紅景天苷的血藥濃度比值較制備物成分含量比值呈明顯增高,并與紅景天苷具有部分共血藥與協(xié)同吸收時間。因此,酪醇的體內表征及其來源是制備物中的微量酪醇在體內以原型存在?還是制備物中紅景天苷由機體“有意”所為的代謝產物,而與紅景天苷構成藥物體系,從而對其藥物屬性特性產生協(xié)同性?這引起課題組的高度關注,并系統(tǒng)探究其原委,揭示出其藥物體系基本表征特性。以制備物及其在正常大鼠體內紅景天苷及酪醇含量、含量比值動態(tài)變化與藥代動力學表征關聯(lián)分析,揭示了女貞子紅景天苷制備物類藥特性,為對其進行深入創(chuàng)新藥物研究奠定了基礎,同時亦為有關藥物研究提供了思考以及技術與方法學支撐。

正常狀態(tài)下大鼠女貞子紅景天苷制備物體內藥代動力學表征研究結果發(fā)現(xiàn),大鼠體內可同時存在紅景天苷和酪醇成分,但酪醇成分血藥濃度在正常狀態(tài)下僅達到檢測限,但在課題組系統(tǒng)研究中發(fā)現(xiàn),在有關病理模型狀態(tài)下大鼠體內酪醇成分血藥濃度明顯增高,高出最低定量限,并應用本分析方法成功研究了女貞子紅景天苷制備物的有關藥物體系及其藥物屬性與特性,有關實驗結果將進一步報道。

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[2]張明發(fā),沈雅琴.紅景天苷及其苷元酪醇的心血管保護作用[J].中國新藥雜志,2012,21:2521-2525.

[3]謝卉,朱大會.紅景天苷對神經系統(tǒng)疾病藥理作用的研究進展[J].中國中藥雜志,2012,37(17):2505-2509.

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[5]石任兵,周文娟,田恒康,等.一種從女貞子中制備高純度紅景天苷的方法:中國,CN101279992[P].2008-10-08.

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