張璐 李煥娟 潘婷 楊元 許舒婭 陳唯 彭平 石任兵
遠志湯來源于《圣濟總錄》卷五十五,由遠志、石菖蒲(1∶1)配比組成,具有寧心安神、抗抑郁、改善記憶的作用。
本研究運用藥物成分藥代動力學(xué)—藥效動力學(xué)與相互作用關(guān)聯(lián)性研究方法學(xué)體系(pharmacokineticspharmacodynamics-drug interactions,PK-PD-DI)[1],采用嗅球損毀復(fù)制大鼠抑郁模型[2],以抗抑郁藥效為指標,基于藥物體系三大特性:自然性、協(xié)同性、親和性發(fā)現(xiàn)與確定遠志湯抗抑郁的藥物體系[3]。研究發(fā)現(xiàn)以西伯利亞遠志糖A5、西伯利亞遠志糖A6、香草酸、遠志酮Ⅲ、3,6’-二芥子?;崽?、β-細辛醚、α-細辛醚為其緊密關(guān)聯(lián)的部分藥物成分,并以此建立了同時測定遠志湯藥物制備物7 種有效指標性成分的含量的HPLC 測定分析方法,并通過其藥學(xué)—藥效質(zhì)量表征關(guān)聯(lián)分析[4-5],確定出遠志湯的最佳藥物制備物形式,并基于自然藥學(xué)觀對創(chuàng)造最佳抗抑郁藥物途徑進行探索[6]。
Waters e2695 高效液相色譜儀,Empower Pro 軟件系統(tǒng),2998PDA 二極管陣列檢測器;METTLERAE240 型電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司);KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。RE-52A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);HH-S6 數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州普天儀器制造有限公司)。
香草酸(批號120915,純度≥98%)、α-細辛醚(批號100298-201203,純度100%)均購自北京方程生物科技有限公司,β-細辛醚(批號00011017-T9K,純度95%)購自天津一方科技有限公司,西伯利亞遠志糖A5(批號:121102,純度≥98%)、西伯利亞遠志糖A6(批號:121102,純度≥98%)、遠志酮Ⅲ(批號:1210928,純度≥98%)、3,6’-二芥子酰基蔗糖(批號:120929,純度≥96%)、乙腈(色譜級,F(xiàn)isher Scientific 公司),甲醇(AR 分析純,北京化工廠),磷酸(AR 分析純,北京化學(xué)試劑公司);娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司),其余試劑均為分析純。
鹽酸氟西汀(美國禮來公司,生產(chǎn)批號:0745A);利血平(天津金耀藥業(yè)有限公司,國藥準字H12020905);去甲腎上腺素(NE)、5-羥色胺(5-HT)試劑盒,購自北京環(huán)亞泰克生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司。
遠志飲片(產(chǎn)地:陜西)購自GAP 基地,石菖蒲飲片(產(chǎn)地:湖南)購自北京同仁堂藥材有限責任公司。
遠志湯藥物制備物:按照基于藥物體系的遠志湯藥物制備工藝對全方飲片進行水提取、稀醇提取和大孔吸附樹脂純化,分別得到水提取物、稀醇提取物和富集物(由稀醇提取物富集獲得),分別保存?zhèn)溆谩?/p>
SPF 級ICR,體質(zhì)量為18 ~20 g,雌雄各半,許可證號:SCXK(京)2012-0001,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。
采用SPSS 16.0 統(tǒng)計分析,運用單因素方差分析(One-Way ANOVA)進行多組間的比較,組間兩兩比較采用LSD。
2.1.1 混合對照品溶液的配制 精密稱取西伯利亞遠志糖A5、西伯利亞遠志糖A6、香草酸、遠志酮Ⅲ、3,6’-二芥子?;崽?、β-細辛醚、α-細辛醚對照品適量,純甲醇溶解并定容至棕色容量瓶中。配成濃度為0.0072 mg/mL、0.0143 mg/mL、0.0215 mg/mL、0.0286mg/mL、0.0358 mg/mL、0.0430 mg/mL 的西伯利亞遠志糖A5,配成濃度為0.0059 mg/mL、0.0119 mg/mL、0.0178 mg/mL、0.0238 mg/mL、0.0297 mg/mL、0.0356 mg/mL 的西伯利亞遠志糖A6,配成濃度為0.0043 mg/mL 香草酸、0.0054 mg/mL遠志酮Ⅲ、0.0237 mg/mL3,6’-二芥子?;崽恰?.2760 mg/mL β-細辛醚、0.0147 mg/mL α-細辛醚的對照品溶液。0.45 μm 微孔濾膜濾過,備用。
2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取遠志湯醇提取物100.11 mg,置于10 mL 容量瓶中,加入70%甲醇超聲使充分溶解,定容至刻度,搖勻,用0.45 μm微孔濾膜濾過,備用。
2.1.3 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 Thermo Hypersil GOLD(C18)液相色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm),流動相乙腈(A)-0.05%磷酸水(B),洗脫梯度(0 ~5 分鐘,0% ~5%A;5 ~10 分鐘,5% ~10%A;10 ~15 分鐘,10% ~12%A;15 ~30 分鐘,12%A;30 ~55 分鐘,12% ~25%A;55 ~65 分鐘,25% ~40%A;65 ~75 分鐘,40% ~70%A;75 ~90 分鐘,70% ~75%A),流速1.0 mL/min,柱溫25℃,檢測波長西伯利亞遠志糖A5、西伯利亞遠志糖A6、3,6’-二芥子?;崽菫?30 nm,香草酸、遠志酮Ⅲ、β-細辛醚、α-細辛醚為256 nm。
依據(jù)上述色譜條件,分別吸取各對照品溶液及供試品溶液,進樣。在對照品溶液和供試品溶液色譜圖相應(yīng)位置上,有相同保留時間的色譜峰,在各自檢測波長處與其他成分分離良好,見圖1。
圖1 遠志湯對照品(A)及供試品(B、C、D)HPLC 色譜圖
分別吸取各對照品適量,繪制標準曲線,各有效指標性成分線性關(guān)系良好。精密吸取供試品溶液進行精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性考察,計算RSD 均小于3%,表明精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性良好。另精密稱取已知含量的供試品溶液6 份,分別加入各對照品溶液適量,按2.1.2 方法制備供試品溶液。進液相色譜儀,測色譜峰面積,并分別計算回收率,結(jié)果:西伯利亞遠志糖A5、西伯利亞遠志糖A6、香草酸、遠志酮Ⅲ、3,6’-二芥子酰基蔗糖、β-細辛醚、α-細辛醚平均加樣回收率分別為100.01%(RSD =2.04%)、96.68%(RSD =1.17%)、101.72% (RSD= 2.33%)、102.94% (RSD = 1.30%)、100.59%(RSD = 1.81%)、100.66% (RSD = 2.96%)、97.29%(RSD=1.45%)。該方法的加樣回收率合格,符合定量分析。
2.2.1 基于含量表征 分別精密稱取遠志湯復(fù)方飲片、水提取物、稀醇提取物和富集物適量,按上述所建的含量測定方法測定遠志湯各制備物中有效指標性成分的含量[7],結(jié)果見表1。由表1可知,遠志湯中7 種有效指標性成分從水提物到醇提物到富集物含量有增大趨勢。
表1 不同藥物制備物形式中7 種有效指標性成分的平均含量(%;n=3)
2.2.2 基于出膏率的質(zhì)量表征 遠志湯水提取物、稀醇提取物和富集物的出膏率及其參比富集物的相對比值結(jié)果見表2。由表2可知,相同生藥量下,遠志湯富集物的出膏率最小,約為水提物和稀醇提取物的1/3.2。
表2 基于藥物制備物出膏率的遠志湯藥物制備物的質(zhì)量表征
2.2.3 基于相對量的質(zhì)量表征 遠志湯各制備物制備過程中,7 種有效指標性成分的相對量會不同程度的減小。以飲片中7 種有效指標性成分的量為1,根據(jù)含量測定和出膏率結(jié)果,得到相同生藥量的遠志湯不同藥物制備物形式中7 種有效指標性成分的相對量(相對量用含量×出膏率表示),結(jié)果見表3。由表3可知,隨著遠志湯的制備過程,7 種有效指標性成分的量會不同程度的減少。
表3 不同藥物制備物形式中7 種有效指標性成分的相對量
表4 不同藥物制備物形式中6 種有效指標性成分含量的相對比值
2.2.5 基于抗抑郁藥效作用的質(zhì)量表征 本文采用利血平致小鼠抑郁動物模型[8],除空白組不作處理外,其余各組動物均予以腹腔注射利血平(4 mg/kg)注射液。造模后,給藥組灌胃相應(yīng)藥液,空白組和模型組灌胃等體積蒸餾水。灌胃30 分鐘后將小鼠豎起,觀察實驗動物2 分鐘內(nèi)眼瞼下垂情況,根據(jù)眼瞼下垂情況評分,評分標準為:全睜為1分,眼閉2/4 為0.5 分,眼閉3/4 為0.25 分,全閉為0 分。灌胃1 小時后小鼠斷頭于冰臺上取腦組織,分離海馬,放免法檢測海馬組織中5-HT、NE 的含量。以5-HT、NE 含量為檢測指標,研究遠志湯在相同生藥量下各制備物的藥物量對抑郁的治療作用。數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,運用單因素方差分析(One-Way ANOVA)進行多組間的比較,組間兩兩比較差異采用LSD,結(jié)果見表5。由表5可知,與正常組相比,模型組各指標含量均顯著降低,二者有極顯著性差異(P <0.01)。遠志湯富集物組5-HT、NE 與模型組有極顯著性差異(P <0.01),眼瞼下垂程度有顯著性差異(P <0.05),綜合分析結(jié)果顯示其對抗抑郁有顯著藥效作用。遠志湯醇提物也具有一定的抗抑郁作用,而遠志湯水提物抗抑郁作用不明顯。三種制備物的藥效大小為:富集物>醇提物>水提物;與陽性藥相比,遠志湯富集物組NE 的含量明顯高于陽性藥組,體現(xiàn)其對NE 的調(diào)節(jié)作用特性。
表5 遠志湯制備物抗抑郁藥效結(jié)果
2.3.1 基于有效指標性成分含量的藥學(xué)—藥效質(zhì)量表征關(guān)聯(lián)分析 遠志湯藥物制備物中的7 種有效指標性成分從水提物到醇提物到富集物依次增加,見圖2。其中,富集物中7 種有效指標性成分的含量增加幅度最大,稀醇提取物次之,水提物最弱,與抗抑郁藥效結(jié)果:富集物>稀醇提取物>水提取物相一致。提示在設(shè)計優(yōu)化制備工藝過程中,應(yīng)重點關(guān)注增幅大的各指標性成分,保證其具有較高含量。結(jié)合藥學(xué)和藥效關(guān)聯(lián)分析,發(fā)現(xiàn)在遠志湯藥物制備物中,隨著藥物體系各指標性成分含量和純度的提高,抗抑郁作用顯著提高。說明有效指標性成分的含量變化與藥效呈正相關(guān)。
圖2 遠志湯藥物制備物中7 種有效指標性成分含量變化
2.3.2 基于有效指標性成分含量相對比值的藥學(xué)—藥效質(zhì)量表征關(guān)聯(lián)分析 以遠志酮Ⅲ含量為參比(含量相對比值為1),將不同藥物制備物形式中7 種有效指標性成分含量與遠志酮Ⅲ含量的比值予以表征。其中,富集物與醇提物中的7 種有效指標性成分含量相對比值相似,與水提物差別較大,見圖3。關(guān)聯(lián)藥效推測,遠志湯藥物內(nèi)部各類成分以一定的比例存在時,藥效最佳。可見遠志湯藥物制備物中,除有效成分含量增量外,藥物體系組成中有效成分之間的比例,同樣對藥效產(chǎn)生較大影響。
圖3 遠志湯藥物制備物中有效指標性成分含量相對比值的變化
2.3.3 基于藥物制備物的出膏率的藥學(xué)—藥效質(zhì)量表征關(guān)聯(lián)分析 由表2可知,在相同生藥量下,遠志湯藥物制備物的出膏率大幅度減小,約為水提物、稀醇提取物的1/3.2,為全方飲片的1/10。關(guān)聯(lián)遠志湯抗抑郁藥效質(zhì)量表征,發(fā)現(xiàn)遠志湯富集物的服用量最小,但藥效卻最強。說明在中藥藥物制備中,藥物成分合理富集是提高藥效的關(guān)鍵因素之一。
2.3.4 基于有效指標性成分的相對制備量的藥學(xué)—藥效質(zhì)量表征關(guān)聯(lián)分析 遠志湯中各類成分的制備量隨著制備工藝過程的損失,在全方飲片、稀醇提取物和富集物中逐漸減少,見圖4。與相同生藥量藥效結(jié)果進行關(guān)聯(lián),發(fā)現(xiàn)在一定藥物成分轉(zhuǎn)移率范圍內(nèi),藥物成分在藥物制備物中制備量的適當降低,未顯現(xiàn)出對藥物藥效的關(guān)聯(lián)影響。
圖4 遠志湯藥物制備物各類成分相對量的變化
綜上,基于藥物體系的基本組成,制備物中藥成分的含量及相對比值是遠志湯抗抑郁作用的關(guān)鍵因素。即在相同生藥量下,其富集物藥物服用量大大減少,由于仍保持藥物體系組成成分完整,且藥物純度較高,各類成分的相對比值更為合理,因而顯示出藥效得以提高,具有最強的抗抑郁作用,故確定遠志湯富集物為其最佳藥物制備物形式。
本研究通過運用藥物藥代動力學(xué)—藥效動力學(xué)與相互作用關(guān)聯(lián)性研究方法(PK-PD-DI)所發(fā)現(xiàn)的藥物體系,結(jié)合遠志湯的藥學(xué)-藥效質(zhì)量表征,考量出遠志湯的最佳藥物制備物形式,為抗抑郁中藥復(fù)方藥物的進一步研制奠定基礎(chǔ)?;谥苽湮镔|(zhì)量表征關(guān)聯(lián)分析得出,在藥物制備過程中,基于藥物體系的基本組成,有針對性地提高有效指標性成分的含量與優(yōu)化其組成比例是提升藥物質(zhì)量的關(guān)鍵。
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