劉明 陳紹紅 鐘贛生 柳海艷 趙桐

酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是因長期大量攝入酒精而造成的肝臟損傷疾病。隨著酒精攝入量的增加，該疾病呈漸進性發(fā)展，可從最初的酒精性脂肪肝發(fā)展為酒精性肝炎、酒精性肝纖維化及酒精性肝硬化［1］。隨著生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的變化，人們社交應(yīng)酬增多以及生存競爭壓力增大，酗酒和酒精中毒呈日益增多趨勢。在歐美發(fā)達國家，酒精性肝病的發(fā)病形式主要以酒精性脂肪肝為主;在中國，酒精性疾病的發(fā)生率也與日俱增，主要以酒精性肝炎為主［2］。乙醇及其代謝產(chǎn)物和代謝過程中產(chǎn)生的代謝混亂是導(dǎo)致酒精性肝病的重要原因［3］。在古代文獻記載中，葛花枳椇子是最具有代表性的解酒藥對，葛花功用為解酒醒脾，枳椇子具有清熱利尿，解酒毒的功效，二者也較少用于其他疾病的治療。實驗組前期通過借助現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)方法與手段，進行了葛花和枳椇子不同比例配伍(1∶1、1∶2、和2∶1)，不同的提取方法(水提和醇提)對大鼠慢性酒精性肝損傷的防治研究，結(jié)果表明葛花枳椇子2∶1比例配伍采用傳統(tǒng)水提解酒保肝效果最佳［4］。本實驗在此基礎(chǔ)上，通過研究酒后血中乙醇質(zhì)量濃度和肝中乙醇脫氫酶活性，探討不同劑量的葛花枳椇子2∶1比例配伍后解酒保肝是否存在量-時-效關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

選取健康雄性Wistar 大鼠，體質(zhì)量180 ～200 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。許可證編號為SCXK(京)2012-0001。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，按體重隨機分為6 組:空白組、模型組、東寶甘泰組、配伍低劑量組、配伍中劑量組、配伍高劑量組，其中空白組30 只，模型組、東寶甘泰組、配伍各劑量組每組各50 只。

1.2 實驗藥物與試劑

1.2.1 實驗藥物 葛花為豆科植物野葛Pueraria lobata (Willd.)Ohwi 的花。枳椇子為鼠李科植物枳椇Hovenia dulcis Thunb 的干燥成熟種子。兩種藥材均購自北京本草方源藥業(yè)有限公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)方藥系李偉老師鑒定均為優(yōu)質(zhì)藥材。

葛花枳椇子混合煎液的制備:將葛花、枳椇子按2∶1的比例混合浸泡0.5 小時，第一次加10 倍量水煎煮提取1.5 小時，第二次加8 倍量水煎煮1 小時。濾過，合并濾液，濃縮至一定濃度。使用時，加去離子水配制成含生藥12 g/mL、6 g/mL、3 g/mL 濃度的藥液。

東寶肝泰藥液的制備:使用時用去離子水配成0.036 g/mL 濃度的藥液。

1.2.2 主要實驗試劑 56°紅星二鍋頭酒:購自北京紅星股份有限公司;東寶甘泰片:吉林通化東寶藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號為:090503;生理鹽水:山東齊都藥業(yè)有限公司;組織乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase，ADH)測定試劑盒:南京建成科技有限公司生產(chǎn)，批號為:20130412;無水乙醇:北京化工廠生產(chǎn)，批號為:20130320;肝素鈉:優(yōu)級純。中國醫(yī)藥公司北京公司;鹽酸氨基脲:國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號為:20111215;甘氨酸:北京東勝泰博科技有限公司;焦磷酸鈉:國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號為:F20110503;氫氧化鈉:北京化工廠生產(chǎn)，批號為:20121120;高氯酸:北京化工廠生產(chǎn);乙醇脫氫酶:SIGMA 公司進口;氧化型輔酶Ⅰ:SIGMA公司進口

1.3 主要實驗儀器

臺式高速冷凍離心機:型號為TGL-16A，長沙平凡儀器儀表有限公司;恒溫水浴鍋:北京光明醫(yī)療儀器廠;快速混勻器:型號為SK-1，江蘇國華儀器廠;微量移液器:北京青云航空儀表有限公司;752-C 紫外光柵分光光度計:上海第三分析儀器廠;電子分析天平:型號為AEL-160，日本產(chǎn)。

1.4 造模與給藥方法

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后開始造模，用56°紅星二鍋頭白酒灌胃，第1 周每天給酒8 mL/kg，1 次灌胃，連續(xù)2 周;第3 周每天給酒10 mL/kg，以后每周稱重，根據(jù)體重計算給酒量，連續(xù)12 周。除正常喂養(yǎng)外，空白組每天給予去離子水，灌胃體積為10 mL/kg，模型組給予56°紅星二鍋頭白酒灌胃，配伍各劑量組每日上午先給予相應(yīng)濃度的藥液，給藥體積為10 mL/kg，下午給予白酒灌胃。連續(xù)12 周，每周給大鼠稱重，自由進食進水。

1.5 對慢性酒精性肝損傷大鼠血中乙醇濃度的影響

1.5.1 制作標準曲線 (1)用生理鹽水將新鮮正常大鼠全血(經(jīng)抗凝處理)稀釋，配成含乙醇量分別為25 mg/dL、50 mg/dL、100 mg/dL、200 mg/dL、400 mg/dL、800 mg/dL 的溶液。(2)上述各管加入3.4%高氯酸4 mL，混勻，于3000 r/min 離心5分鐘，取上清液作為標準液。(3)取6 只試管，分別加入乙醇脫氫酶(ADH)-氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD +)液4.9 mL;其中一支加蒸餾水0.1 mL，作為對照;其余五支各加0.1mL 標準液，室溫放置60 分鐘。用752-C 紫外可見分光光度計于340 nm 測各管吸收度，繪制標準曲線?；貧w方程為y =1806x +3.6398，R2=0.9976

1.5.2 樣品測試 大鼠280 只，按體重隨機分為6組:空白組、酒精組、東寶甘泰組、配伍低劑量(生藥3 g/kg)+酒精組、配伍中劑量(生藥6 g/kg)+酒精組、配伍高劑量(生藥12 g/kg)+酒精組?？瞻捉M30 只，其余各組各50 只。實驗分別在4 周末、8 周末、12 周末取材，取材前所有大鼠均禁食不禁水12小時，用10%水合氯醛350 mg/kg 腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，取少量新鮮血液，經(jīng)抗凝處理。在取血同時另取肝左葉約0.2 g，立即放入液氮中冷凍，之后置于-70℃冰箱中冷藏，備測乙醇脫氫酶活性(ADH)。

從每管抗凝血中取出0.25 mL，加生理鹽水0.75 mL，再經(jīng)去蛋白處理，余步驟與制作標準曲線相同。根據(jù)吸光度，用標準曲線求出乙醇質(zhì)量濃度。

1.6 乙醇脫氫酶檢測

測試時用手動勻漿器將肝組織在冰水中制成10%勻漿，4℃3000 轉(zhuǎn)/分鐘離心10 分鐘，提取上清液，備檢測。將測定ADH 試劑盒內(nèi)的試劑混勻，37℃預(yù)溫10 分鐘，加入待測液0.05 mL，加入樣本的同時開始計時，充分混勻，15 秒時340 nm 處，0.5 cm光徑，測定OD 值A(chǔ)1，迅速將反應(yīng)液置于37℃水浴鍋中，10分鐘15 秒時取出，測定OD 值A(chǔ)2。

計算公式為:肝組織勻漿中的ADH 活力(U/mgprot)=［測定(A2-A1)-空白(A2-A1)］÷ (6.22 ×0.5)×［反應(yīng)液總體積(mL)÷樣本量(mL)］÷反應(yīng)時間×1000÷10%組織勻漿蛋白含量(mgprot/mL)

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 11.5 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。各項檢測指標的數(shù)據(jù)均采用均值±標準差(±s)來表示，方差齊性檢驗采用Levene 檢驗，多組均數(shù)間的比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩兩均數(shù)間比較采用LSD 法，P ＜0.05 提示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。為保證檢測指標的客觀真實性，統(tǒng)計數(shù)據(jù)時剔除不符合正態(tài)分布原則的界外值。

2 結(jié)果

2.1 葛花枳椇子2∶1配伍對酒精性肝損傷大鼠血中乙醇質(zhì)量濃度的影響

與模型組比較，給藥4 周后，各給藥組大鼠血中乙醇濃度均有所降低，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。給藥8 周后，各給藥組大鼠血中乙醇濃度均明顯降低，有顯著性差異，且配伍低劑量組血中乙醇濃度最低，與中劑量組相比(P ＜0.001)，有統(tǒng)計學(xué)差異，與高劑量組相比(P ＜0.01)，比較有統(tǒng)計學(xué)差異。給藥12 周后，各給藥組大鼠血中乙醇濃度亦均明顯降低，均有顯著性差異(P ＜0.001)，且配伍低劑量組血中乙醇濃度最低，與中劑量組和高劑量組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P ＜0.01)，見表1。

表1 葛花枳椇子配伍對酒精性肝損傷大鼠血中乙醇濃度的影響

2.2 葛花枳椇子2∶1配伍對酒精性肝損傷大鼠肝中乙醇脫氫酶活性的影響

與空白組比較，模型組白酒灌胃4 周(P ＜0.05)、8 周(P ＜0.001)和12 周(P ＜0.001)后，肝中ADH 活性逐漸降低，均有統(tǒng)計學(xué)差異。與模型組比較，給藥4 周后，各給藥肝中ADH 活性增強，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，其中低劑量組ADH 較高。給藥8 周后，東寶肝泰組(P ＜0.05)和配伍低劑量組(P ＜0.01)ADH 活性增強，有顯著性差異。給藥12 周后，配伍低劑量組(P ＜0.01)ADH 活性增強，有顯著性差異，見表2。

表2 葛花枳椇子配伍對酒精性肝損傷大鼠肝中ADH 的影響

3 討論

肝臟是酒精代謝的重要場所，攝入體內(nèi)的乙醇98% ～90%在肝臟內(nèi)氧化，2% ～10%由呼吸道、尿液和汗腺以原形排出;肝臟代謝的乙醇80%通過乙醇脫氫酶轉(zhuǎn)化為乙醛，約20%通過微粒體乙醇氧化酶轉(zhuǎn)化為乙醛，乙醛再經(jīng)乙醛脫氫酶轉(zhuǎn)化為乙酸，進入三羧酸循環(huán)，氧化成二氧化碳和水(CH3CH2OH→CH3CHO →CH3COOH →CO2+ H2O)［5］。目 前ADL 的發(fā)病機制尚不明確，但認為與多種因素有關(guān)［6］。

口服乙醇90% ～98%是通過以下3 個途徑代謝［7］:飲酒后，首先啟動0 級經(jīng)典途徑，即通過胞質(zhì)內(nèi)的乙醇脫氫酶和過氧化小體內(nèi)的過氧化氫酶進行代謝;當(dāng)血液中乙醇濃度過高時，也啟動1 級代謝途徑，即通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的復(fù)合氧化酶系統(tǒng)進行代謝，通過這3 種途徑將乙醇氧化分解為乙醛。乙醛對肝臟有直接毒性作用，可以造成肝細胞脂肪變性壞死等一系列變化。其中ADH 乙醇氧化體系在乙醇代謝中起重要作用。乙醇的肝毒性是由于乙醇脫氫酶介導(dǎo)過度產(chǎn)生還原型腺嘌呤二核苷酸及有高度毒性的乙醛的結(jié)果。肝細胞內(nèi)乙醇代謝有三個主要通路，其中之一是胞漿質(zhì)的ADH 通路。乙醇氧化過程中會同時伴隨2 分子的氧化性輔酶I(NAD+)轉(zhuǎn)化為還原型輔酶I(Nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)，這樣導(dǎo)致NADH/NAD 比值增高，進而影響了NAD +依賴的過程，嚴重干擾了細胞新陳代謝，使三羧酸循環(huán)受到抑制［8］。此外，乙醇還會在代謝過程中促進氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生，同時伴隨攝入不足等導(dǎo)致體內(nèi)抗氧化物減少，促發(fā)氧化應(yīng)激［9］。產(chǎn)生的自由基會抑制脂肪酸氧化，致使肝細胞脂肪蓄積。這是引起酒精性脂肪肝的主要原因。NADH 在340 nm 有吸收峰，故本實驗采取測定單位時間內(nèi)生成的NADH 引起的吸收度變化率的方法，測定ADH 活性的變化。

正常情況下，ADH 在肝臟中含量最高，血清中的ADH 活性是恒定的，只有當(dāng)肝細胞受損時，ADH由肝細胞內(nèi)釋放入血，從而引起ADH 含量升高，所以檢測血清中的ADH 活性是診斷某些肝臟疾病的指標之一。本研究觀察了葛花枳椇子配伍對酒后血中乙醇質(zhì)量濃度和肝中乙醇脫氫酶活性的影響。從本實驗的結(jié)果可以看出，模型組大鼠肝組織中乙醇脫氫酶的活性較空白組明顯降低。與模型組比較，給藥4 周后，各給藥組肝中ADH 活性增強，但無統(tǒng)計學(xué)差異;給藥8 周和12 周后，配伍低劑量組ADH 活性增強，有顯著性差異。

有研究表明乙醇脫氫酶活性的變化可以影響到血中乙醇的濃度。當(dāng)乙醇脫氫酶活性受到抑制或下降時，導(dǎo)致機體對乙醇的吸收提高，從而加重乙醇對肝、腎、腦等臟器的損害。本實驗另一研究結(jié)果表明隨著大鼠白酒灌胃時間的延長，血中乙醇濃度逐漸升高。給藥治療8 周和12 周后，葛花枳椇子各劑量配伍組均可明顯降低血中乙醇濃度，且至第12 周末，配伍低劑量組血中乙醇濃度最低，顯示一定的治療優(yōu)勢，提示隨著給藥時間的延長治療效果越好。

結(jié)合大鼠酒后血中乙醇質(zhì)量濃度和肝中乙醇脫氫酶活性的改變，可以看出給藥8 周和12 周后低劑量組大鼠肝中ADH 活性增強，血中乙醇濃度明顯降低。并且隨著給藥時間的延長，低劑量組可以通過增強乙醇脫氫酶活性加強肝臟對乙醇的代謝，降低對肝臟的損傷而起到一定的保肝效果。

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