白 歌，張國(guó)治，黃紀(jì)念，蘆 鑫

（1.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.河南省農(nóng)科院 農(nóng)副產(chǎn)品加工研究所，河南 鄭州 450002）

0 引言

花生一般含粗脂肪46%～53%、粗蛋白25%～30%，不僅是重要的油料資源，也是重要的蛋白資源[1].目前，我國(guó)花生消費(fèi)的利用比例大致為：榨油50%～60%，直接作為原料加工成食品占15%～25%，而用于花生深加工的只占10%左右[2].制油過程中會(huì)產(chǎn)生大量的花生餅粕，主要用作飼料、肥料，其中的蛋白資源未得到充分利用.花生蛋白質(zhì)具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是一種完全蛋白，含有人體必需的8 種氨基酸，而且其功能性與大豆蛋白接近，但比大豆蛋白質(zhì)更易于吸收[2].

制備花生蛋白的方法有:堿溶酸沉、水酶法和醇洗等.但由于現(xiàn)有的制油工藝中存在高溫、高壓處理，花生蛋白會(huì)發(fā)生一定程度的變性，水溶性降低，限制了花生蛋白的提取和后續(xù)利用.新興的亞臨界萃取制油技術(shù)為制備低變性花生蛋白奠定了基礎(chǔ).亞臨界流體萃取相比其他分離方法的最大優(yōu)點(diǎn)是非熱加工，對(duì)熱敏性物質(zhì)破壞小.作者以亞臨界萃取花生油的副產(chǎn)品花生粕為原料，用混合溶劑洗脫掉小分子可溶性糖和殘油，通過優(yōu)化混合溶劑制備蛋白的工藝，得到高純度的蛋白產(chǎn)品，并分析混合溶劑制備亞臨界花生蛋白和堿溶酸沉法制備花生蛋白的功能性差異.

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑

亞臨界花生粕:由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞臨界設(shè)備制得，以液化氣為萃取劑，在亞臨界狀態(tài)下，固定萃取次數(shù)3 次，萃取條件為:壓力1.0 MPa，溫度50 ℃，料液比1∶3，萃取時(shí)間2 h，固液分離后得到亞臨界花生粕，組成見表1.

表1 亞臨界花生粕的化學(xué)組分Table 1 Chemical composition of subcritical peanut meal

高溫花生分離蛋白（High temperature peanut protein，HTPP）：以高溫花生粕為原料，加入水使料液比為1 ∶9，調(diào)節(jié)pH 為9.0，采用 60 ℃水浴1 200 r/min 攪拌90 min 后，5 000 r/min 離心30 min，棄去沉淀.在上清液中加入2 mol/L HCl 溶液至pH值穩(wěn)定在4.5，磁力攪拌1 200 r/min 至混合均勻，5 000 r/min 離心30 min，回收沉淀，冷凍干燥，樣品低溫密封保存.樣品中粗蛋白含量為85.56%，殘油率4.89%.

天然花生分離蛋白（Natural peanut protein，NPP）：以脫脂后的天然花生為原料，料液比1∶9，60℃水浴，加入2 mol/L NaOH 溶液使pH 值穩(wěn)定在9.0，1 200 r/min 攪拌90 min 后，5 000 r/min 離心30 min，留取上層溶液.在上層溶液中加入2 mol/L HCl 溶液至pH 值穩(wěn)定在4.5，磁力攪拌1 200 r/min 至混合均勻，5 000 r/min 離心30 min，倒掉上層溶液，冷凍沉淀，凍干后備用.粗蛋白含量84.69%，殘油率5.78%.

亞臨界花生粕二次醇洗蛋白 (Peanut protein prepared by double ethanol washing，PPEW)：以亞臨界花生粕為原料，料液比1∶16，水浴40 ℃，1 200 r/min 攪拌30 min，以V正己烷:V乙醇∶V水=5∶16∶4 為混合溶劑浸提兩次，然后5 000 r/min 離心30 min，上層溶液回收備用，揮發(fā)下層沉淀中殘留的有機(jī)溶劑，經(jīng)過凍干備用.粗蛋白含量為65.39%，殘油率0.45%.

無水乙醇、正己烷、硫酸、硫酸鉀、硫酸銅、硼酸、鹽酸等試劑均為分析純：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司.

1.2 主要試驗(yàn)設(shè)備和儀器

全自動(dòng)凱氏定氮儀：上海晟聲儀器有限公司；DF-101S 集熱磁力加熱攪拌器：金壇市醫(yī)療儀器廠；DGX-9243 型鼓風(fēng)干燥箱：上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DL-5-B 離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；XS205 電子天平：瑞士梅特勒-托利多公司.

1.3 方法

1.3.1 混合有機(jī)溶劑提取制備花生蛋白

稱取一定量經(jīng)粉碎過80 目的亞臨界花生粕置于圓底燒瓶中，配比定量的正己烷-水-乙醇溶液進(jìn)行洗脫并進(jìn)行1 200 r/min 磁力攪拌30 min，經(jīng)過5 000 r/min 離心30 min 后，棄去上清液，固體通過真空干燥機(jī)60 ℃干燥得到濃縮花生蛋白，密封低溫保存.根據(jù)相關(guān)研究和前提試驗(yàn)已知，料液比、提取液組成、提取溫度和時(shí)間是影響蛋白提取效果的重要因素[3]，所以以花生蛋白的純度和提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，將以上4 個(gè)因素采用二水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分析不同條件對(duì)花生蛋白的純度和提取效果的影響.樣品中蛋白含量和提取率的計(jì)算見公式（1）和（2）.

四因素二水平試驗(yàn)的結(jié)果表明，液料比為顯著因素，為此對(duì)液料比進(jìn)行單因素試驗(yàn)：選取提取溫度40 ℃，提取液組分比（正己烷∶80%乙醇）2.13，提取時(shí)間30 min 時(shí)，考察當(dāng)選用不同液料比10∶1、12∶1、14∶1、16∶1、18∶1、20∶1 時(shí)，花生蛋白的純度和提取率.

為了分析提取液組成對(duì)花生蛋白提取的影響，采用正己烷（X1）、乙醇（X2）和水（X3）組分0～100%的全范圍混料試驗(yàn).

1.3.2 花生餅粕成分測(cè)定方法

粗蛋白測(cè)定參照GB/T 14489.2—2008，轉(zhuǎn)換系數(shù)為5.46；粗脂肪測(cè)定參照GB/T 14772—2008；水分測(cè)定參照GB 5009.3—2010；灰分測(cè)定參照GB 5009.4—2010；NSI 測(cè)定參照AACC International Method 46—23；非氮化合物測(cè)定采用還原法，非氮化合物=（1-水分-灰分-粗蛋白-粗脂肪）×100%.

1.3.3 吸水性的測(cè)定

分別準(zhǔn)確稱取含0.5 g 花生蛋白的HTPP、NPP、PPEW，加入10 mL 蒸餾水，攪拌均勻，室溫下放置30 min，2 000 r/min 離心10 min，去除澄清水，稱質(zhì)量.吸水性為每克蛋白結(jié)合水的克數(shù)[5].

1.3.4 吸油性的測(cè)定

分別準(zhǔn)確稱取含2.0 g 花生蛋白的HTPP、NPP、PPEW，加入8 mL 一級(jí)大豆油，攪拌5 min，3 000 r/min 下離心20 min，棄去上層未吸附油，稱質(zhì)量.吸油性為每克蛋白吸附油脂的克數(shù)[5].

1.3.5 乳化性及乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

分別準(zhǔn)確稱取含3.0 g 花生蛋白的HTPP、NPP、PPEW，溶解于50 mL 蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH 至7.0，加入50 mL 一級(jí)大豆油，以10 000～12 000 r/min均質(zhì)2 min，移入50 mL 離心管中，在1 500 r/min下離心5 min，根據(jù)乳化層高度計(jì)算乳化性，見公式（3）.然后置于50 ℃水浴中靜置30 min，用自來水冷卻至室溫，在1 500 r/min 下離心5 min，記錄乳化層高度和總體高度，計(jì)算乳化層穩(wěn)定性[5-6]，見公式（4）.

1.3.6 起泡性及起泡穩(wěn)定性的測(cè)定

分別準(zhǔn)確稱取含1.0 g 花生蛋白的HTPP、NPP、PPAW 溶于50 mL、pH 7.0 磷酸緩沖液，攪拌10 min，用組織搗碎器10 000 r/min 攪打2 min，立刻傾入150 mL 量筒，記錄其總體積，按公式（5）計(jì)算膨脹率.間隔30 min 后再記錄其總體積以及泡沫體積[7－8]，按公式（6）計(jì)算泡沫穩(wěn)定性.

1.3.7 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

無特殊說明，試驗(yàn)平行測(cè)定3 次.采用MINITAB 16 和SAS 9.2 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，顯著水平為0.1，高度顯著水平為0.05.

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件對(duì)花生蛋白提取效果的影響

以液料比、提取液組成、提取時(shí)間和提取溫度為考察因素，花生蛋白純度和提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)的四因素二水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表2，方差分析見表3.

表2 四因素二水平試驗(yàn)的設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of the four factors and two levels experiment

由表3 可知，蛋白純度模型顯著（p=0.071<0.1），這表明四因素二水平試驗(yàn)的結(jié)果可以真實(shí)客觀反映實(shí)際結(jié)果.當(dāng)分析因素影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)液料比和組分比為顯著影響因素，且液料比的影響（p=0.016）要強(qiáng)于組分比的影響(p=0.076)，而提取時(shí)間和提取溫度為非顯著影響因素.同時(shí)，蛋白提取率模型顯著（p=0.085<0.1），說明四因素二水平試驗(yàn)的結(jié)果可以真實(shí)客觀反映蛋白提取率的變化情況.分析因素影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)液料比和溫度為顯著影響因素，并且溫度的影響（p=0.049）要強(qiáng)于液料比的影響（p=0.072），提取時(shí)間和組分比為非顯著影響因素.

液料比和組分比對(duì)花生蛋白純度的影響見圖1（a），固定液料比，單獨(dú)增加提取液中正己烷的比重會(huì)降低花生蛋白的純度，這是由于正己烷濃度過高不利于花生餅粕在提取液中的分散，從而削弱脫脂效果，且高正己烷組成會(huì)使提取液極性太弱，導(dǎo)致花生餅粕中糖類等極性物質(zhì)不溶于提取液中，從而降低了花生蛋白的純度.固定組分比，增加液料比可以提高花生蛋白的純度，顯然這是由于高的液料比意味著提取液體積更大，有利于形成更大的濃度梯度，促進(jìn)油脂、糖類進(jìn)入提取液中，從而提高花生蛋白的純度.液料比和提取溫度對(duì)花生蛋白提取率的影響見圖1（b），固定液料比，提高提取溫度降低了花生蛋白的提取率，由于提高溫度有利于蛋白溶解，導(dǎo)致更多的蛋白質(zhì)進(jìn)入提取液中，所以降低了花生蛋白提取率.固定提取溫度，增加料液比可以提高花生蛋白的提取率，因?yàn)樵黾右毫媳瓤梢韵吹舾嗟臍堄秃托》肿犹牵蕴岣吡嘶ㄉ鞍椎奶崛÷?

表3 四因素二水平試驗(yàn)的方差分析Table 3 Variance analysis of the four factors and two levels experiment

圖1 料液比、組分比和溫度對(duì)醇提亞臨界花生餅粕中蛋白的影響Fig.1 Effect of liquid to material ratio,component ratio and temperature on protein extraction from subcritical peanut meal by the mixed solvent

2.2 液料比單因素試驗(yàn)

四因素二水平試驗(yàn)的結(jié)果表明，液料比從6到12 過程中，增加液料比有利于提高蛋白純度，因此在液料比單因素試驗(yàn)中，考察更大液料比對(duì)花生蛋白提取的影響，即液料比取10∶1、12∶1、14∶1、16∶1、18∶1、20∶1，結(jié)果見圖2.

圖2 液料比對(duì)花生蛋白純度和提取率的影響Fig.2 Effect of liquid to material ratio on peanut protein purity and extraction rate

由圖2 可知，當(dāng)液料比從10 增加到14 的過程中，花生蛋白純度上升；隨后繼續(xù)增加液料比，蛋白純度雖然也在增加，但增加幅度趨于平緩.通過單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，液料比大于14 以后無顯著性差異.隨著液料比的增加，提取率先增大后減小，方差分析發(fā)現(xiàn)液料比為12、16 與14 時(shí)無顯著性差異.因此，兼顧蛋白提取率和純度，液料比選取1∶16，粗蛋白含量為59.25%，提取率為98.34%.

2.3 提取液組成對(duì)花生蛋白提取的影響

因?yàn)樗囊蛩囟皆囼?yàn)中，組分比不夠全面，所以考察提取液中正已烷、乙醇、水所占比重分別從0～100%的混料回歸試驗(yàn).試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4，方差分析見表5、表6.

由表4 可知，本試驗(yàn)中影響因素是3 個(gè)組分含量，蛋白純度的相關(guān)系數(shù)R2=0.894，蛋白純度的回歸方程高度顯著（p<0.05），表明可以客觀反映出3 個(gè)組分對(duì)花生蛋白純度的影響.花生蛋白純度的回歸方程式如下：

表4 混料回歸試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Regression experiment design and results

Y1=53.29X1+51.68X2+14.85X3-14.42X1X2-12.18X1X3+67.19X2X3+380.24X1X2X3.

花生蛋白提取率的相關(guān)系數(shù)R2=0.964，提取率的回歸方程高度顯著（p<0.05），說明這3 個(gè)組分可以反映出對(duì)花生蛋白提取率的影響，花生蛋白提取率的回歸方程如下：

Y2=96.2X1+92.2X2+10.8X3-17.6X1X2-127.9X1X3+520.5X1X2X3.

從表5 可知，線性部分和二次項(xiàng)、立方項(xiàng)分布高度顯著（p<0.05），表明混合溶劑組成會(huì)對(duì)花生蛋白純度有顯著影響.在交互作用中乙醇×水和正己烷×乙醇×水為高度顯著，正己烷×乙醇和正己烷×水不顯著.這表明水和乙醇的交互影響較大.

由表6 可知，線性和二次項(xiàng)分布高度顯著，說明3 個(gè)組分對(duì)花生蛋白的提取率有顯著影響.二次項(xiàng)中除了正己烷×乙醇以外均為高度顯著.

為了得到更高的蛋白純度，利用MINITAB 響應(yīng)優(yōu)化器，最佳組分比為正己烷∶乙醇∶水為0.25∶0.49∶0.26，花生蛋白純度60.62%，提取率97.05%.再進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，花生蛋白純度為（60.34±0.29）%，提取率（96.89±0.31）%，由此可見采用混料試驗(yàn)優(yōu)化得到的醇洗提取蛋白工藝準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值.

表5 花生蛋白純度的回歸方程的方差分析Table 5 Variance analysis of regression equation of peanut protein purity

表6 花生蛋白提取率的回歸方程的方差分析Table 6 Variance analysis of regression equation of peanut protein extraction rate

本試驗(yàn)一次醇洗就能達(dá)到與劉玉蘭等[9]相似的結(jié)果，表明適宜的三元混合溶劑提高了除去花生蛋白中雜質(zhì)的效率.本試驗(yàn)減少了混合溶液的使用量，縮短了提取時(shí)間，簡(jiǎn)化了提取工藝，降低了生產(chǎn)成本，有利于推動(dòng)醇洗花生蛋白產(chǎn)業(yè)的發(fā)展.

2.4 不同蛋白的功能性的比較

分析高溫花生粕堿溶酸沉提蛋白、天然花生堿溶酸沉提蛋白和亞臨界花生粕醇洗制備蛋白的功能性質(zhì)差異，試驗(yàn)結(jié)果見表7.

表7 不同蛋白的功能性比較Table 7 Functions comparison of different proteins

從表7 可知，在吸水性的檢測(cè)中，HTPP 的吸水性最弱，這是因?yàn)楦邷貢?huì)導(dǎo)致疏水基團(tuán)的暴露，導(dǎo)致HTPP 的吸水性最弱；NPP 和PPEW 經(jīng)過方差分析無明顯差異.在NSI 的檢測(cè)中，HTPP 的NSI 較低，是因?yàn)榻?jīng)過高溫處理，花生蛋白變性程度較大，水溶性下降，造成NSI 較低，同時(shí)高溫能促成二硫鍵的斷裂，形成疏水性的巰基.PPEW 的NSI低，可能是因?yàn)楦邼舛纫掖几淖兞薖PEW 的次級(jí)結(jié)構(gòu)，破壞了PPEW 中原有的氫鍵，導(dǎo)致NSI 降低[10].

在吸油性的檢測(cè)中，HTPP 的吸油性最弱，可能因?yàn)樵诟邷剡^程中蛋白不可逆轉(zhuǎn)的變性，破壞了疏水基團(tuán)，使HTPP 的吸油性最弱；NPP 和PPEW 經(jīng)過方差分析無明顯差異.在乳化性及其穩(wěn)定性的檢測(cè)中，HTPP 的乳化性最弱，是因?yàn)樵诟邷剡^程中親水基團(tuán)和疏水基團(tuán)被破壞，降低了其在油相和水相中形成乳化液的能力；PPEW 的乳化性及其穩(wěn)定性優(yōu)于NPP.起泡性及泡沫穩(wěn)定性的檢測(cè)中，NPP 的起泡性好，PPEW 的起泡性最弱，泡沫穩(wěn)定性與其負(fù)相關(guān).

3 結(jié)論

以亞臨界萃取制油的副產(chǎn)品花生粕為原料，用混合溶劑制備蛋白，混合溶劑組分最佳配比為正己烷∶乙醇∶水=0.25∶0.49∶0.26，液料比16∶1，溫度為40 ℃，浸提時(shí)間30 min，在此條件下一次醇洗的蛋白純度為60.62%（干基），提取率97.05%，比較多次醇洗的方法，本試驗(yàn)優(yōu)化得出的一次醇洗工藝，有節(jié)約成本、減少對(duì)環(huán)境破壞的優(yōu)點(diǎn)，而且更加適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn).

亞臨界花生粕混合溶劑制備的蛋白在功能性上與堿溶酸沉法制備的蛋白進(jìn)行比較，結(jié)果為：兩者有著相同能力的吸水性和吸油性，亞臨界花生粕混合溶劑制備的蛋白有較強(qiáng)的乳化性，但溶解度較低.

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