封小強(qiáng)　梁傳棟　郭非　郭韜

嗎啡暴露對(duì)貓神經(jīng)元線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響

封小強(qiáng)梁傳棟郭非郭韜

【摘要】目的觀察嗎啡暴露對(duì)貓腦神經(jīng)元線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響，為嗎啡暴露造成的神經(jīng)毒性和腦功能受損機(jī)制研究提供支持。方法將12只家貓隨機(jī)分成對(duì)照組(n=3)、嗎啡暴露組(n=9)。嗎啡暴露組行鹽酸嗎啡貓背部皮下注射，用嗎啡劑量遞增法，連續(xù)給藥5 d。對(duì)照組則在對(duì)應(yīng)時(shí)間、對(duì)應(yīng)部位注射相同體積的0.9%氯化鈉溶液。觀察嗎啡暴露組與對(duì)照組貓腦神經(jīng)元線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果嗎啡暴露組貓腦神經(jīng)元線粒體超微結(jié)構(gòu)在數(shù)量、形態(tài)、內(nèi)部膜結(jié)構(gòu)、基質(zhì)內(nèi)包涵體各方面發(fā)生改變，對(duì)應(yīng)嗎啡損害不同時(shí)期，呈現(xiàn)多樣變化。結(jié)論嗎啡造成的線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷，可作為腦細(xì)胞能量代謝功能障礙并最終導(dǎo)致各項(xiàng)腦功能活動(dòng)紊亂的始發(fā)機(jī)制。

【關(guān)鍵詞】嗎啡;線粒體;超微結(jié)構(gòu)

作者單位: 050400河北省平山縣人民醫(yī)院腫瘤科(封小強(qiáng)) ;河北省人民醫(yī)院功能神經(jīng)外科(梁傳棟、郭韜) ;河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院康復(fù)科(郭非)

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嗎啡濫用成癮，戒斷反應(yīng)嚴(yán)重，并且復(fù)吸率高。解決嗎啡類藥物的成癮、戒除不僅是迫切的社會(huì)問題，也對(duì)現(xiàn)代神經(jīng)生物學(xué)、病理學(xué)、毒理學(xué)提出挑戰(zhàn)。在本課題系列中，我們已研究并報(bào)道了嗎啡成癮貓模型的建立及腦電圖、神經(jīng)病理學(xué)特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀察嗎啡暴露對(duì)貓腦神經(jīng)元線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響，并進(jìn)行病理變化的生理、生化層面的對(duì)照分析，為嗎啡暴露造成的神經(jīng)毒害和腦功能受損的機(jī)制研究提供支持。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年健康雄性家貓12只(河北省人民醫(yī)院臨床提供)，體重2～3 kg。其中嗎啡暴露組9只，對(duì)照組3只。

1.2實(shí)驗(yàn)藥品沈陽第一制藥廠生產(chǎn)的鹽酸嗎啡注射液。國藥準(zhǔn)字: H21022436，麻醉藥品和精神藥品生產(chǎn)定點(diǎn)批件號(hào): TD2006-0028?？嫡?湖南)制藥有限公司生產(chǎn)的鹽酸納絡(luò)酮往射液。批準(zhǔn)文號(hào):國藥準(zhǔn)字H20033435，產(chǎn)品批號(hào)20070113。

1.3嗎啡成癮貓模型(1)嗎啡暴露組貓分別于每日8∶00、12∶00、16∶00行鹽酸嗎啡背部皮下注射。按劑量逐日遞增原則，連續(xù)給藥5 d。對(duì)照組貓?jiān)趯?duì)應(yīng)時(shí)間、對(duì)應(yīng)部位注射相同體積的0.9%氯化鈉溶液。(2)給藥劑量:第1天嗎啡單次用量2.5 mg/kg，第2天5 mg/kg，第3天7.5 mg/kg，第4天10 mg/kg，第5天12.5 mg/kg，嚴(yán)格按時(shí)、按次注射。(3)戒斷誘發(fā)實(shí)驗(yàn):第6天8∶00實(shí)驗(yàn)組以0.5 mg/kg納洛酮誘發(fā)戒斷癥狀。依照Maldonado等［1］的戒斷癥狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)定戒斷癥狀。對(duì)照組給予相同程序的等體積0.9%氯化鈉溶液皮下注射。通過評(píng)定貓的戒斷癥狀，以判定嗎啡成癮貓模型是否建立成功。詳細(xì)過程參見文獻(xiàn)［2］。

1.4病理學(xué)檢查2組實(shí)驗(yàn)貓分別于造模成功后3周行腦組織取材。先將貓用3%戊巴比妥以1 ml/kg腹腔注射麻醉。之后剪開胸前壁，暴露心臟，經(jīng)升主動(dòng)脈先灌入0.9%氯化鈉溶液250 ml，然后用含4%多聚甲醛的PBS液灌注。待貓軀體僵硬后開顱，分別取額、顳、頂、枕葉皮質(zhì)組織。將組織切成1 mm3左右小塊，2.5%戊二醛固定。制成超薄切片，JEM-1230(JEOL Electron Microscope，Japan)透射電鏡下觀察照相。拍攝含細(xì)胞核的正常貓腦神經(jīng)元和嗎啡暴露貓神經(jīng)元各60個(gè)圖像，分別作為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組觀察分析。

2　結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)組電鏡下嗎啡暴露貓皮質(zhì)神經(jīng)元大多呈凋亡狀態(tài)，神經(jīng)元胞體內(nèi)，胞漿胞核電子密度增加，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹擴(kuò)張、線粒體腫脹、空泡樣變性。亦可見神經(jīng)元變性壞死，表現(xiàn)為線粒體瘠消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，細(xì)胞器減少，排列混亂，核周間隙擴(kuò)張，核膜模糊不清，染色質(zhì)邊集。各部位貓腦神經(jīng)元超微病理學(xué)改變類型、病變程度相同。見圖1。

圖1　神經(jīng)元凋亡。核電子密度增加，核周隙擴(kuò)張(TEM×5 K)

2.2嗎啡暴露貓神經(jīng)細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化包括數(shù)量、形態(tài)、結(jié)構(gòu)的改變及包涵物的形成，可能代表了嗎啡損害不同時(shí)期的線粒體。

2.2.1數(shù)量:多數(shù)神經(jīng)元線粒體數(shù)量明顯增多，且分布不均勻。部分顯示線粒體數(shù)量減少或變化不明顯。見圖2。

2.2.2形態(tài):線粒體有明顯的形態(tài)改變，彌漫腫脹呈球形甚至不規(guī)則形，并可見線粒體互相融合而成的巨大線粒體。少數(shù)出現(xiàn)線粒體體積變小，內(nèi)腔皺縮，嵴萎縮，基質(zhì)電子密度增高。見圖3。

圖2　神經(jīng)元內(nèi)線粒體增多、腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體擴(kuò)張(TEM×10 K)

圖3　線粒體腫脹，可見線粒體互相融合成巨大線粒體(TEM×6K)

2.2.3結(jié)構(gòu):多數(shù)線粒體嵴結(jié)構(gòu)模糊，排列紊亂，有的呈同心圓樣排列，線粒體基質(zhì)電子密度明顯降低。少數(shù)線粒體發(fā)生退變，表現(xiàn)為雙層膜間隙不清，可呈多囊狀，部分中央?yún)^(qū)空泡化。甚至其內(nèi)充滿電子致密物或雙層膜消失，外膜斷裂、內(nèi)部結(jié)構(gòu)溶解，只殘留有一層膜性結(jié)構(gòu)，呈空泡樣改變，僅存殘跡。見圖4。

圖4　線粒體嵴結(jié)構(gòu)模糊，排列紊亂，基質(zhì)電子密度明顯降低(TEM×10 K)

2.2.4包涵體:基質(zhì)內(nèi)可見類糖原顆粒、結(jié)晶狀包涵體，部分可觀察到小泡樣包涵體。見圖5。

圖5　線粒體局部腫脹變形、稀少，內(nèi)見結(jié)晶狀包涵體(TEM×12 K)

2.3對(duì)照組對(duì)照組貓的電鏡顯示腦組織神經(jīng)元細(xì)胞核電子密度均勻，細(xì)胞核核膜無皺縮，染色質(zhì)密度正常。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)正常，線粒體嵴清晰，排列整齊，其他細(xì)胞器豐富。未見實(shí)驗(yàn)組上述改變。見圖6。

圖6　對(duì)照組腦組織細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整，排列整齊(TEM ×6 K)

3　討論

嗎啡對(duì)中樞神經(jīng)有嚴(yán)重的毒性損傷，但損害作用機(jī)制仍不明確。線粒體是生成三磷酸腺苷(ATP)的場(chǎng)所，是真核細(xì)胞內(nèi)最重要的細(xì)胞器之一，對(duì)細(xì)胞的正常生命活動(dòng)發(fā)揮重要作用。神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)、外環(huán)境條件的異常，均可引起線粒體結(jié)構(gòu)和功能改變，造成能量供應(yīng)障礙，導(dǎo)致其他細(xì)胞器及整個(gè)細(xì)胞的損害。腦細(xì)胞活動(dòng)的能源供應(yīng)不足必將會(huì)造成腦神經(jīng)中樞各項(xiàng)功能活動(dòng)衰減。所以線粒體變化可作為嗎啡暴露造成的神經(jīng)毒性和腦功能受損的評(píng)判指標(biāo)［3］。

本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，嗎啡暴露貓神經(jīng)元線粒體超微結(jié)構(gòu)變化明顯。首先是數(shù)量的變化。病理學(xué)認(rèn)為，線粒體增生分為真性增生和假性增生，真性增生是線粒體膜成分與線粒體氧化酶成比例的增生;假性增生是指線粒體膜成分增生而線粒體氧化酶無改變或改變不明顯［4］。結(jié)合本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果及文獻(xiàn)我們認(rèn)為，嗎啡通過血腦屏障，作用于線粒體這個(gè)對(duì)毒物敏感的細(xì)胞器，與線粒體氧化呼吸鏈傳遞復(fù)合體中含巰基的酶結(jié)合，使這些酶活力受到抑制，呼吸鏈電子傳遞氧化過程受阻，氧化磷酸化脫耦聯(lián)，ATP合成減少，導(dǎo)致了能量代謝、合成功能障礙。而腦是重要的耗能器官，為維持腦細(xì)胞功能活動(dòng)，線粒體必將在一定時(shí)期依靠數(shù)量上的代償性增多，提高能量供給。但這種代償性增多是短暫的，效果也是微不足道的，不能改變神經(jīng)元因能量缺乏而死亡、崩解的結(jié)局(線粒體數(shù)量減少)。因此本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果線粒體數(shù)量明顯增多，屬于線粒體假性增生。

文獻(xiàn)證實(shí)，急性細(xì)胞損傷時(shí)，線粒體嵴被破壞，多表現(xiàn)為嵴斷裂、排列紊亂;慢性亞致死性細(xì)胞損傷或營養(yǎng)缺乏時(shí)，由于線粒體的蛋白合成受阻，不能再形成新的嵴，而呈現(xiàn)嵴結(jié)構(gòu)不清甚至消失［5］。我們也觀察到本組兩種線粒體形態(tài)的變化:一種為線粒體腫脹變圓，出現(xiàn)空泡化，線粒體基質(zhì)電子密度明顯降低。我們認(rèn)為這是在線粒體急性損傷、腫脹成為不可恢復(fù)之損傷后的失代償表現(xiàn)。提示線粒體的功能狀態(tài)下降，代表線粒體基質(zhì)中與三羧酸循環(huán)、丙酮酸氧化和脂肪酸等有關(guān)的各種酶系、核糖體、DNA、RNA、基質(zhì)顆粒等減少。另一種形態(tài)表現(xiàn)是線粒體濃縮變性，嵴萎縮、內(nèi)腔皺縮、體積變小，基質(zhì)蛋白質(zhì)濃縮且電子密度增高，部分線粒體雙層膜間填充電子致密物。我們認(rèn)為這是細(xì)胞趨于壞死、線粒體崩解的結(jié)果，是不可復(fù)性損傷的表現(xiàn)。

本組電鏡還觀察到，嗎啡損害早期，線粒體可單純的表現(xiàn)為數(shù)量增多或者合并線粒體嵴排列紊亂或嵴逐漸崩解并形成空泡。嗎啡中期損害可以出現(xiàn)兩個(gè)相鄰的異常線粒體相互融合，形成多囊狀結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步溶解，中央空化。而線粒體的雙層膜消失代之以單層膜性結(jié)構(gòu)，基質(zhì)內(nèi)包涵體形成，線粒體崩解、數(shù)量減少則是嗎啡損害晚期線粒體的終末改變。綜合分析，說明多種形式的線粒體變化、損害表現(xiàn)，代表不同時(shí)期的線粒體損傷，并且可以共存。

研究表明，嗎啡還能誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體呼吸鏈的Ndufab1、Ndnfb2、Ndufa12等基因下調(diào)，干擾能量物質(zhì)ATP的產(chǎn)生［6］。線粒體功能障礙又可進(jìn)一步導(dǎo)致自由基產(chǎn)生增多，過多的氧自由基可引起生物膜結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)過氧化，從而造成線粒體膜損傷，線粒體形態(tài)和結(jié)構(gòu)發(fā)生病理改變。本組超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)線粒體以內(nèi)膜的破壞為主，而外膜相對(duì)完整。我們認(rèn)為這是由線粒體內(nèi)膜功能復(fù)雜、多樣和嗎啡的廣泛細(xì)胞毒性決定的。首先，線粒體內(nèi)膜和嵴膜的結(jié)構(gòu)與線粒體的功能密切相關(guān)。線粒體內(nèi)膜是進(jìn)行電子傳遞和氧化磷酸化的部位，細(xì)胞可通過增加線粒體內(nèi)膜和嵴膜的表面積來提高ATP的產(chǎn)量，生產(chǎn)較多的ATP可以提高細(xì)胞對(duì)代謝損傷和凋亡過程的保護(hù)作用;其次，線粒體內(nèi)膜上還有許多特異性離子通道和非選擇性的孔結(jié)構(gòu)，如線粒體ATP敏感的鉀通道、Ca2+單向轉(zhuǎn)運(yùn)體、線粒體Ca2+敏感鉀通道等;再者，腺苷酸轉(zhuǎn)位酶也位于線粒體內(nèi)膜上，將線粒體內(nèi)合成的ATP轉(zhuǎn)運(yùn)到胞漿內(nèi)，把胞漿內(nèi)的ADP轉(zhuǎn)入線粒體內(nèi)進(jìn)行氧化磷酸化，維持線粒體和胞漿能量平衡。由此可見線粒體內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的破壞，將影響線粒體的正常功能，最終造成整個(gè)細(xì)胞能量的產(chǎn)生障礙。最終，腦細(xì)胞供能減少，腦神經(jīng)細(xì)胞Na+-K+泵活動(dòng)減弱，維持神經(jīng)傳遞的生物電不能良好的建立，致使神經(jīng)遞質(zhì)的合成、釋放以及信息的傳遞延遲，腦的功能活性進(jìn)一步抑制。這或許就是嗎啡致腦中樞各項(xiàng)功能障礙的始動(dòng)因素。

另外，線粒體內(nèi)晶格狀包涵體(mitochondrial inclusionbodies，MIBs)的主要成分是線粒體肌酸激酶(mitochondrial creatine kinase，M-iCK)。線粒體基質(zhì)內(nèi)晶格狀包涵體的形成，就是由于線粒體ATP生成障礙，M-iCK出現(xiàn)功能代償而過度表達(dá)，導(dǎo)致酶活性較低的M-iCK堆積的結(jié)果。MIBs代表著M-iCK失活的終末階段［7］。包涵物的形成，是由于反應(yīng)代謝障礙，正常呼吸鏈?zhǔn)艿揭种?，氧化磷酸化過程受到破壞引起的，線粒體內(nèi)結(jié)晶狀包涵體的形成，說明細(xì)胞的能量基本代謝單位受到損害。是嗎啡造成線粒體不可逆性損害的標(biāo)志。

總之，嗎啡能夠造成神經(jīng)元線粒體超微結(jié)構(gòu)損害，引起呼吸功能和能量代謝功能障礙。線粒體損傷可作為嗎啡致腦細(xì)胞毒性和腦功能受損的始發(fā)機(jī)制。

參考文獻(xiàn)

1Maldonado R，Negus S，Koob GF.Precipitation of morphine withdrawal syndrome in rats by administration of mudelta and kappa-selective opioid antagonists.Neuropharmacology，1992，31: 1231-1241.

2郭韜，杜亞麗，張素芳，等.嗎啡急性成癮暴露貓模型的建立.腦與神經(jīng)疾病雜志，2008，16: 711-712.

3Sangar MC，Bansal S，Avadhani NC.Bimodal targeting of microsomal cytochrome P450s to mitochondria: implications in drug metabolism and toxicity.Expert Opin Drug Metab Toxicol，2010，6: 1231-1251.

4郭韜，康進(jìn)生，鄭杰，等.嗎啡急性成癮暴露貓腦電圖及神經(jīng)病理特點(diǎn).中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2011，10: 137-141.

5朱筑霞，吳澤江，王旭東，等.胚胎期和生長期子代大鼠砷暴露對(duì)腦細(xì)胞線粒體功能和超微結(jié)構(gòu)的影響.環(huán)境與健康雜志，2011，8: 488-490.

6Nadanaciva S，Will Y.New insights in drug-induced mitochondrial toxicity.Curr Pharm Des，2011，17: 2100-2112.

7Bansal S，Srinivasana S，Anandasadagopans，et al.Additive effects of mitochondrion-targetedcytochrome CYP2E1 and alcohol toxicity on cytochromec oxidase function and stability of respirosome complexes.J Biol Chem，2012，287: 1584-1597.

(收稿日期:2014－11－20)

通訊作者:郭韜，050051石家莊市，河北省人民醫(yī)院功能神經(jīng)外科;

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.10.028

【文章編號(hào)】1002－7386(2015) 10－1526－04

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【中圖分類號(hào)】R 996.5