王欣玲　孫建琴　羅霞

不孕不育患者解脲脲支原體培養(yǎng)及耐藥性研究

王欣玲孫建琴羅霞

【摘要】目的針對不孕不育患者展開臨床研究，了解患者解脲脲支原體感染情況以及對藥物作用的耐藥性，旨在優(yōu)化臨床藥物使用。方法選取我院近兩年來收治的不孕不育患者共280例作為不孕不育組，同時選取270例已生育正常人作為已生育組。對兩組研究對象展開解脲脲支原體的細胞材料培養(yǎng)并實施體外藥敏試驗，對比解脲支原體檢測結果，了解不同類型支原體構成比與分離率、解脲支原體生物分群情況以及女性感染情況。結果550例標本中共分離出了210株支原體，Uu(解脲脲支原體)分離率為26.37%; Mh(人支原體)分離率為0.91%; Uu+Mh分離率為10.91%。由此可見解脲脲支原體感染率最高。而不孕不育組經解脲脲支原體培養(yǎng)后結果為47.62%的女性為陽性，39.29%的男性結果為陽性;已生育組9.23%的男性為陽性，7.14%的女性為陽性，比較差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。同時對210株支原體進行藥敏試驗后發(fā)現(xiàn)，解脲脲支原體耐藥性最強的為環(huán)丙沙星，敏感性最高的則為普那美素。結論對于不孕不育患者而言，解脲脲支原體感染是主要因素，因此需重視對解脲脲支原體的檢測與篩查，同時依據患者藥敏試驗結果選擇最合適的抗生素，以降低不孕不育發(fā)生率。

【關鍵詞】解脲脲支原體;不孕不育;耐藥菌株;藥敏分析

作者單位: 442000湖北省十堰市，湖北醫(yī)藥學院附屬太和醫(yī)院門診服務中心

隨著人們生活習慣以及飲食習慣的變化，越來越多人出現(xiàn)了不孕不育現(xiàn)象，影響到了正常生活。不孕不育并非單一因素作用的結果，其通常受到多種因素的影響，在綜合作用下導致無法受孕或精子能力降低［1，2］。在眾多因素之中，微生物造成的患者生殖道感染是導致患者出現(xiàn)不孕不育的重要因素，在近年來統(tǒng)計中占較大比例。解脲脲支原體是微生物的一種，屬于原核細胞類型，多出現(xiàn)于泌尿生殖道。解脲支原體不侵入機體組織與血液，而是在泌尿生殖道上皮細胞黏附并定居后，通過不同機制引起細胞損傷，如獲取細胞膜上的脂質與膽固醇造成膜的損傷，釋放神經(外)毒素、磷酸酶及過氧化氫等。由此，預防支原體感染，篩查敏感藥物已經成為了各大醫(yī)院研究的重點課題。本院基于這一背景，采用實驗方式研究了我院近年來收治的不孕不育患者解脲脲支原體培養(yǎng)及其耐藥性，報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2012年6月至2014年6月來我院接受治療的280例不孕不育患者作為不孕不育組，其中男112例(占40.0%)，年齡22～43歲，平均年齡(30.7±2.4)歲;不孕不育癥狀已經持續(xù)2～12年，平均(7.8±1.3)年，112例男性患者經檢驗后精液處于正常狀態(tài);女168例(占60.0%)，年齡21～39歲，平均(29.4±1.9)歲;不孕不育癥狀持續(xù)3～11年，平均(7.1±1.1)年。168例女性患者均排除先天性不孕不育、排卵存在障礙以及內分泌失調現(xiàn)象嚴重等癥狀。選擇2012年6月至2014年6月已生育正常人270例作為已生育組，其中男130例，年齡21～42歲，平均(31.5±2.4)歲。130例健康男性的配偶妊娠時間均已超過5個月;女140例，年齡22～38歲，平均年齡(31.2±1.8)歲。140例健康女性均已分娩最少1個孩子，且孩子身體健康。2組患者在一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，具有可比性。取所有男性的精液、前列腺液、尿道分泌物或者中段尿液作為標本送檢，女性則取其陰道或者宮頸處分泌物即可，取后立即送檢。

1.2方法

1.2.1采集方法:采集方式根據患者性別的不同，在操作上也存在差異性。本次研究中支原體培養(yǎng)、藥敏試驗以及鑒定相關操作均按照試劑說明書嚴格完成，在對結果的判斷上也需保障細胞材料獲取的有效性，避免細胞材料獲取不當影響對結果的判斷。對不同性別患者的細胞材料獲取操作如下:

1.2.1.1女性采集:首先將患者外陰部位使用沾有消毒水的棉簽清潔干凈，將外陰處分泌物徹底清潔。使用陰道窺鏡將患者陰道部位擴張，讓陰道便于標本的采集。使用無菌棉球將其宮頸部位的分泌物擦拭干凈，以沒有粘連的分泌物為主。將無菌棉拭子深入到患者宮頸之中，深度大約在1～2 cm即可。深入后旋轉一圈(360°，保障無菌棉拭子上細胞材料獲取的充分性)，讓宮頸壁上的分泌物充分粘在無菌棉拭子上。在將無菌棉拭子取出后，將其接種到轉送液培養(yǎng)基里面，輕微攪拌后將棉拭子丟棄。

1.2.2.2男性采集:首先使用沾有消毒水的棉簽將患研究對象尿道口部位的分泌物仔細清潔干凈，之后采用積壓方式，將管道中原本存在的分泌物擠出。擠壓可由患者自行操作，數次之后看到有分泌物流出則可開始擦拭，直到無分泌物溢出為止。在有效清潔之后，使用無菌棉拭子，將其緩慢深入患者尿道之中，注意手法需輕微仔細，伸入后將無菌棉拭子輕輕旋轉一圈(360°，保障無菌棉拭子上細胞材料獲取的充分性)。旋轉之后需停留10～20 s，保障細胞材料的有效獲取。在將無菌棉拭子取出后，將其接種到轉送液培養(yǎng)基里面，輕微攪拌后將棉拭子丟棄。除上述方法外，也可在消毒前列腺之后采用按摩方式，在適當按摩下將患者精液或是中段尿液留取，制成標本之后立即送檢實驗。這種方式需要保障檢驗的及時性，即在獲取到標本后立即開始檢驗，才能夠保障支原體培養(yǎng)的有效性。而采用無菌棉拭子的方式可不必立即送檢，但也要注意培養(yǎng)基的有效保存。

1.3觀察指標使用交沙霉素、美滿霉素、普那美素、阿奇霉素、紅霉素、多西環(huán)素、司帕沙星以及左氧氟沙星等13種藥物進行解脲支原體耐藥敏試驗，結果解脲支原體對這些藥物的敏感度、中介度與耐藥率。

1.4統(tǒng)計學分析應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計數資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1已生育和不孕不育患者的解脲支原體檢測結果對比已生育男、女性解脲支原體檢出率低于不孕不育者(P＜0.05)。見表1。

表1　已生育和不孕不育患者的解脲支原體檢測結果對比%(例)

2.2不同類型支原體構成比與分離率不同類型支原體構成中Uu所占比例最大，其次為Uu+Mh，Uu分離率最高，其次為Uu+Mh。見表2。

表2　不同類型支原體構成比與分離率

2.3對210株解脲支原體藥敏試驗結果分析解脲支原體敏感藥物分別為交沙霉素素、普那美素、多西環(huán)素，其中普那美素敏感性最高為98.57%，而紅霉素、環(huán)丙沙量耐藥率均＞50%，其中環(huán)丙沙量耐藥最高為58.10%。見表3。

表3　210株解脲支原體藥敏試驗結果分析

2.4不孕不育女性感染情況在本研究中有168例女性患者，其中合并衣原體感染患者有80例，91例則合并患有陰道炎、宮頸炎等其他婦科疾病。癥狀出現(xiàn)時間不等，約在7 d～1年，發(fā)病具有反復性或者持續(xù)性。臨床癥狀主要為陰道分泌物出現(xiàn)不同程度的增加，同時伴隨有較嚴重的灼熱感或者陰道內部痛感劇烈;腹部或者腰骶部均出現(xiàn)較強烈的疼痛感或者不適感。宮頸炎會導致患者分泌出一種黏液，形態(tài)為Q型，阻礙精子穿透。而子宮內膜炎則會對受精卵著床造成不利影響。

2.5解脲支原體生物分群情況將45株菌株放置于PCR反應情況下，發(fā)現(xiàn)其出現(xiàn)擴增現(xiàn)象，且產生目的條帶，同時部分解脲支原體株分群出現(xiàn)電泳現(xiàn)象。具體如下: 32株為Parvo生物群，其出現(xiàn)的bp條帶數量為403，所占比例為71.11%;而剩余13株則屬于T960生物群，出現(xiàn)的bp條帶數量為448，較Parvo生物群要多，所占比例為28.89%。此外，在PCR反應情況下并未發(fā)現(xiàn)Parvo和T960生物群出現(xiàn)混合感染現(xiàn)象。

3　討論

支原體屬于存在于病毒與細菌之間，能夠在人體中獨立存活的原核狀態(tài)微生物。支原體的生存環(huán)境主要在于人體泌尿系統(tǒng)以及生殖道部位，容易造成這兩個部分產生炎癥，繼而造成患者無法孕育［3］。研究發(fā)現(xiàn)，支原體感染并不會對患者血液以及人體組織產生影響，只會附著在其泌尿道或是呼吸道的上皮細胞表層，其生存依賴于宿主細胞，通過吸收營養(yǎng)獲取膽固醇以及脂質。在這種情況下，患者細胞會受損，釋放出存在毒素的代謝物。在解脲脲支原體中，含有一種尿素酶，會將尿素水解產生大量氨元素，氨元素會毒害健康細胞，對患者生殖功能產生影響［4－6］。

研究發(fā)現(xiàn)，解脲脲支原體會從多層面對人體生育能力造成損傷。隨著這類型支原體感染比例的不斷上漲，臨床上使用的抗菌類型藥物無論是劑量還是種類都有所增加，繼而使得耐藥菌株數量也呈上漲趨勢［7－9］。且國內外資料提示，不孕癥夫婦的宮頸黏液、精液中解脲支原體培養(yǎng)陽性率高達50%以上，由此可見，解脲支原體感染與不孕癥的發(fā)生有相關關系。解脲支原體感染造成的女性生殖器官病理性改變，是不孕不育的重要原因。對解脲支原體的培養(yǎng)方面，營養(yǎng)要求比一般細菌高，除基礎營養(yǎng)物質外還需加入10%～20%人或動物血清以提供支原體所需的膽固醇。最適合酸堿值在7.8～8.0，低于7.0則死亡，但解脲支原體最適pH值6.0～6.5。大多數兼性厭氧，有些菌株在初分離時加入5%二氧化碳生長更好。生長緩慢，在瓊脂含量較少的固體培養(yǎng)基上孵育2～3 d出現(xiàn)典型的“荷包蛋樣”菌落:圓形(直徑10～16 μm)，核心部分較厚，向下長入培養(yǎng)基，周邊為一層薄的透明顆粒區(qū)。此外，支原體還能在雞胚絨毛尿囊膜或培養(yǎng)細胞中生長。其繁殖方式多樣，主要為二分裂繁殖，還有斷裂、分枝、出芽等方式，蓋因缺乏細胞壁造成分裂時二個子細胞大小均所致。同時，支原體分裂和其DNA復制不同步，可形成多核長絲體。

在患者出現(xiàn)不孕不育癥狀時，其產生原因可能在于以下幾點: (1)解脲脲支原體造成患者出現(xiàn)急性輸卵管炎癥，部分研究者在體外實驗中得知，解脲脲支原體會造成動物(實驗動物為牛)輸卵管纖維毛產生脫落，周圍細胞壞死影響卵子存活［10］。(2)解脲脲支原體容易造成患者出現(xiàn)慢性宮頸炎癥，讓宮頸部分分泌黏液。這種黏液會在一定程度上阻擋精子的穿透，成為“Q型黏液”，造成女性患者不易受精。(3)解脲脲支原體會分泌出一種“N-氨酸酶”［11］類型物質，影響受精卵的正常發(fā)育，在早期將其殺死。(4)解脲脲支原體會引起患者子宮內膜產生炎癥，即使精子進入到子宮內部與卵子結合，也不易在子宮壁著床。(5)解脲脲支原體容易對細胞產生不良影響，或是讓精子形態(tài)畸形，讓原本健康的精子活力下滑或是減少男性患者精子數量，對受精產生影響。在實驗中使用電鏡觀察患者精子中段部位存在解脲脲支原體［12］。由此可見，這類型支原體屬于造成患者不孕不育的重要因素。

在本研究中共有550例標本中，分離出了210株支原體，總感染率為38.19%(210/550)。其中Uu(解脲脲支原體)構成比為69.05%，分離率為26.37%; Mh(人支原體)構成比為2.38%，分離率為0.91%; Uu+Mh構成比為28.57%，分離率為10.91%。由此可見解脲脲支原體感染率最高。而不孕不育組經解脲脲支原體培養(yǎng)后結果為47.62%的女性為陽性，已生育組7.14%的女性為陽性，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05) ;不孕不育組39.29%的男性結果為陽性，已生育組9.23%的男性為陽性，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。由此可見解脲脲支原體是導致不孕不育、早產以及自然流產的主要因素。同時對210株支原體進行藥敏試驗后發(fā)現(xiàn)，解脲脲支原體耐藥性最強的為環(huán)丙沙星、紅霉素以及羅紅霉素，敏感性最高的則為普那美素、多西環(huán)素以及交沙霉素。由于臨床濫用抗菌藥物，再加之支原體自身對于細胞壁的缺乏，致使對青霉素這類干擾細胞壁的合成抗生素缺乏敏感性，因此需選取敏感性較高的藥物予以治療，摒棄傳統(tǒng)的經驗型用藥方法，采用聯(lián)合用藥法。此外，在168例不孕不育女性中，有80例合并衣原體感染，91例患者則合并其他婦科疾病，這也是導致不孕不育的重要影響因素之一，因此女性要注意陰道清潔，一旦發(fā)現(xiàn)不適癥狀應立即就診，避免導致不孕不育。本研究還將45株菌株放置于PCR反應情況下，發(fā)現(xiàn)有71.11%的為Parvo生物群，28.89%的屬于T960生物群。對于女性泌尿生殖道而言，Parvo生物群是一種優(yōu)勢群，而T960生物群則極容易導致女性患者出現(xiàn)泌尿生殖道感染現(xiàn)象，且Parvo生物群也有可能是作為定植菌群而存在。

綜上所述，解脲脲支原體感染是造成患者不孕不育的重要因素，臨床檢驗中應重視對這類支原體的篩查與檢驗。同時注重對患者的藥敏試驗，根據實驗結果選擇合適的抗生素類藥物，提升藥物作用有效性。

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·科教管理·

(收稿日期:2014－11－18)

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.10.049

【文章編號】1002－7386(2015) 10－1578－03

【文獻標識碼】A

【中圖分類號】R 518.9