賈坤靜，艾 雪，賈天柱，2*，鞠成國,2

(1.遼寧中醫(yī)藥大學 藥學院，遼寧 大連 116600； 2.遼寧省中藥炮制工程技術研究中心，遼寧 大連 116600)

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桑螵蛸炮制前后蛋白質(zhì)和多糖及脂類成分比較

賈坤靜1，艾 雪1，賈天柱1，2*，鞠成國1,2

(1.遼寧中醫(yī)藥大學 藥學院，遼寧 大連 116600； 2.遼寧省中藥炮制工程技術研究中心，遼寧 大連 116600)

目的：比較桑螵蛸炮制前后蛋白質(zhì)提取率及多糖和脂類的含量差異。方法：采用考馬斯亮藍法測定桑螵蛸生制品蛋白質(zhì)提取率，硫酸苯酚法和減重法分別測定桑螵蛸生制品中多糖和總脂的含量，抗壞血酸-鉬藍光度法測定磷脂的含量，并進行分析對比。結(jié)果：蛋白質(zhì)提取率和多糖含量均為生品>鹽炒品>蒸品，總脂含量為蒸品>鹽炒品>生品，磷脂含量生品>蒸品>鹽炒品。結(jié)論：桑螵蛸經(jīng)過鹽炒和蒸制后，蛋白質(zhì)提取率以及多糖和磷脂含量均下降，總脂含量升高。

桑螵蛸；蛋白質(zhì)；多糖；脂類

桑螵蛸是一味傳統(tǒng)中藥，有著悠久的藥用歷史。其味甘、咸、平，歸肝、腎經(jīng)，具有固精縮尿、補腎助陽的功效[1]。查閱中外文獻后發(fā)現(xiàn)，關于桑螵蛸炮制前后的化學成分比較未見報道。炮制對中藥的化學成分有重要影響，而炮制前后化學成分的變化必然引起中藥藥效的變化。有關桑螵蛸的蛋白類成分，國內(nèi)研究較少。桑螵蛸的主要成分為蛋白質(zhì)，約占桑螵蛸重量的58.5%[2]。桑螵蛸蛋白質(zhì)中含有18種氨基酸，其中有8種是人體必需氨基酸[3]?，F(xiàn)代研究已證實，多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、降血糖、抗凝血、抗血栓等作用[4]。磷脂是構(gòu)成神經(jīng)組織, 特別是腦脊髓的主要成分; 同時也是構(gòu)成血球及其它細胞膜的重要物質(zhì)。本實驗對桑螵蛸炮制前后蛋白質(zhì)和多糖以及脂類成分進行了比較，以期找出桑螵蛸炮制前后的成分差異，為桑螵蛸的臨床應用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材

桑螵蛸，采自大連莊河。經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學王冰教授鑒定為“團螵蛸”(螳螂科昆蟲大刀螂Tenodera sinensis Saussure的干燥卵鞘)。

蒸桑螵蛸：取桑螵蛸置于蒸鍋中，加適量清水蒸至“圓氣”后繼續(xù)用文火蒸10min，取出，晾干，即得。

鹽炒桑螵蛸：每100g桑螵蛸藥材用30mL鹽水(含2.5g鹽)悶潤1h，在100℃下文火炒10min，取出放涼，即得[2]。

1.2 試劑

小牛血清(純度>98%,由sigma公司提供)； 無水葡萄糖(天津市光復精細化工研究所，批號：20130910)；考馬斯亮藍G-250；磷酸；石油醚；95%乙醇；活性炭；氯仿；正丁醇；苯酚；濃硫酸；磷酸二氫鉀；鉬酸銨；濃硝酸；抗壞血酸；過氧化氫；冰醋酸；酚酞；所用試劑均為分析醇，實驗用水為超純水。

1.3 儀器

電磁爐，RE-52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；B-220恒溫水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠)；SHZ-D(III)循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責任公司)；DFT-200手提式高速萬能粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)；Alpha4冷凍干燥機(Christ北京思達興業(yè)儀器有限公司)；離心機；T6新世紀紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；HZ-A6002電子天平(瑞安市金訊貿(mào)易有限公司)；METTLER AE240型十萬分之一分析天平(瑞士METTLER)；FA1004B型電子天平(上海精密科學儀器有限公司)；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)；pH 計(上海儀電科學儀器股份有限公司)；Multiskan-MK3型酶標儀(賽默飛世爾儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 考馬斯亮藍法測定蛋白提取率

2.1.1 標準曲線繪制 精密稱取牛血清蛋白凍干粉10mg,加入適量水溶解，于10 mL容量瓶定容，得到濃度為1.031 mg/mL的對照品溶液。分別精密吸取牛血清蛋白對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于試管中，加水稀釋至1mL。另取一試管加入1mL水作為空白對照管，各試管中加入考馬斯亮藍G-250顯色劑4.0mL，混勻，室溫下顯色30min，于595nm處測定吸光度，以OD值為縱坐標，濃度為橫坐標，得回歸方程y=0.4184x+0.1688(r=0.999)。

2.1.2 Tris-cl緩沖液配制 稱量60.5g Tris置于燒杯中，加入約400mL水，充分攪拌溶解，加入濃HCl調(diào)節(jié)pH=9，作為提取蛋白的緩沖液。

2.1.3 脫脂 取桑螵蛸生品、鹽炒品和蒸品粉碎，過60目篩。稱取桑螵蛸生制品粉末，以固液比1∶8(g/mL)加入石油醚，超聲提取3次，每次30min，過濾，脫脂粉末干燥備用。

2.1.4 蛋白提取 精確稱取生品、鹽炒品、蒸品脫脂粉，每份5g。根據(jù)前期單因素試驗優(yōu)選條件，以固液比1∶15加入pH=9的Tris-cl緩沖液，在40℃的條件下提取18h，5 000r離心15min，取上清液，于595nm處測吸光度，根據(jù)標準曲線計算蛋白濃度。

2.1.5 結(jié)果 相同提取條件下的生品，鹽炒品和蒸品的蛋白提取率均降低，桑螵蛸生制品蛋白提取率均值見表1。

表1 桑螵蛸生品蛋白提取率 (n=6)

2.2 硫酸苯酚法測定多糖含量

2.2.1 多糖的提取 稱取“2.1.3”項所得桑螵蛸生制品脫脂粉各20g，加入10倍量的水回流煎煮1.5h，濾過，藥渣再重復回流提取2次，合并3次所得濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓濃縮至30mL，加入160mL 95%乙醇，使混合后溶液的乙醇濃度達到80%。攪拌均勻之后放入4℃冰箱中一夜。第二天可見白色沉淀析出，3000r/min離心10min，棄去上清液，收集沉淀得粗多糖。

2.2.2 活性炭除色素 將粗多糖溶于純水中，加入活性炭粉末攪拌后抽濾，反復幾次，直到濾液變得澄清無色。

2.2.3 Sevage法除蛋白 將氯仿和正丁醇以5∶1的比例混合，將除去色素后的溶液倒入分液漏斗中，加入氯仿和正丁醇混合液，劇烈搖晃后靜置分層，在水相和有機相的交界面可看到變性的蛋白質(zhì)析出，棄去有機層和蛋白質(zhì)層。如此反復多次，直到無蛋白層出現(xiàn)。

2.2.4 供試品溶液制備 將除去蛋白的粗多糖溶液于25mL容量瓶定容待測。

2.2.5 對照品溶液制備 取105 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖對照品，精密稱定，加水溶解并于10mL容量瓶中稀釋定容，配制成每1mL含葡萄糖1.081mg的對照品溶液。

2.2.6 選擇測定波長 分別精密吸取對照品溶液和粗多糖溶液各1mL于試管中，加入1mL苯酚溶液和濃硫酸5mL，放入沸水浴中加熱15min，取出冷卻至室溫，于200～800nm區(qū)間掃描，對照品與供試品均在490nm處有最大吸收峰，因此選擇490nm為測定波長。

2.2.7 標準曲線繪制 精密吸取葡萄糖對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于干凈試管中，補加水至1.0mL。然后分別加入1.0mL 5%的苯酚，再緩慢加入5.0mL濃硫酸,輕輕搖晃使其混合均勻。另取一只試管，加入1.0mL純水，1.0mL 5%的苯酚和5.0mL濃硫酸作為空白對照，搖勻。置沸水浴中加熱15min，取出冷卻至室溫，于490nm處測定吸光度值，以吸光度為縱坐標，糖濃度為橫坐標，得到回歸方程：y=0.5225x+1.8703，r=0.999。

2.2.8 精密度實驗 取同一供試品溶液1.0 mL，按“2.2.7”項方法測定6次，計算得RSD=1.13%，表明精密度良好。

2.2.9 重復性實驗 稱取桑螵蛸生品粉末6份，按“2.2.1”項和“2.2.4”項方法制備供試品溶液并測定吸光度，得多糖平均含量為1.59%，RSD=1.35%。

2.2.10 穩(wěn)定性實驗 取桑螵蛸生品供試液，按“2.1.7”項方法測定吸光度，每5min測定1次，共測定6次。RSD=2.07%，表明桑螵蛸中多糖在30min內(nèi)顯色情況基本穩(wěn)定。

2.2.11 加樣回收率實驗 精密稱取已知含量的生品粉末6份，每份1g。按“2.2.1”項和“2.1.4”項方法制備供試品溶液，各加入葡萄糖標準品15.6mg，并按照“2.1.7”項方法測定吸光度，計算得多糖回收率為99.30%，RSD=2.33%。

2.2.12 結(jié)果 稱取桑螵蛸生品、鹽炒品、蒸品粉末按“2.2.1”項和“2.2.4”項方法制備供試品溶液并測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算，得總多糖平均含量，見表2。

表2 桑螵蛸生制品多糖含量 (n=6)

2.3 減重法測定總脂含量

桑螵蛸生品、鹽炒品和蒸品粉碎，過60目篩。稱取生制品粉末各20g,以石油醚作為提取溶劑，固液比1∶8回流2h后過濾。共回流提取3次，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，減重法得總脂。桑螵蛸經(jīng)炮制后總脂的含量均明顯升高，平均含量如表3所示。

表3 桑螵蛸生制品總脂含量 (n=6)

2.4 抗壞血酸-鉬藍光度法測定磷脂含量

采用抗壞血酸-鉬藍光度法，用混酸濕法消化油樣, 然后以硫酸調(diào)節(jié)反應酸度，加入鉬酸銨溶液并以抗壞血酸作為還原劑，75℃水浴反應20min后在820nm處測定吸光度，計算磷脂含量[5]。

2.4.1 磷標準使用液配制 取105℃干燥至恒重的無水磷酸二氫鉀，精密稱定，加水溶解并于100mL容量瓶中稀釋定容，配制成每1mL 含磷0.1mg的標準使用液。

2.4.2 標準曲線的繪制 按文獻[5]測定標準曲線的條件和步驟測定出的標準曲線為：y=28.325x+0.0038(y為磷濃度，x為吸光度，r=0.999)。

2.4.3 樣品消化及磷脂含量測定 稱取“2.3”項所得桑螵蛸生品、鹽炒品和蒸品油樣各1.0g，按照文獻[5]的方法進行消化并測吸光度，根據(jù)標準曲線計算得桑螵蛸生制品磷脂的含量。桑螵蛸經(jīng)過炮制后磷脂含量較生品均有所下降，磷脂平均含量見表4。

表4 桑螵蛸生制品磷脂含量 (n=6)

3 討論

桑螵蛸富含蛋白質(zhì)，對治療遺尿具有顯著療效。從中藥成分與藥效的相關性來看，桑螵蛸的藥理作用很有可能與其所含的蛋白質(zhì)有關。緩沖液法提取蛋白質(zhì)簡單易行，且提取效率較高，因此作者采用Tris-cl緩沖液作為提取試劑，來比較桑螵蛸生制品的蛋白提取率。實驗結(jié)果表明， 桑螵蛸經(jīng)加熱炮制后蛋白提取率較生品有所下降，這與蛋白加熱后變性，在緩沖液中溶解度減小有關。

多糖作為一種生物活性物質(zhì), 在很多方面發(fā)揮著不可替代的作用, 在醫(yī)學方面應用也越來越廣泛。近年來，隨著分子生物學的興起和發(fā)展, 多糖在生命過程中所起的重要作用也被越來越深入地發(fā)現(xiàn)和挖掘出來。研究表明，桑螵蛸對免疫器官有增強作用[ 6 ]，能提高機體的免疫機能。桑螵蛸鹽炒品和蒸品的多糖含量均低于生品，說明鹽炒和蒸制會導致桑螵蛸多糖含量降低。

桑螵蛸經(jīng)炮制后，鹽炒品和蒸品的總脂含量都遠遠大于生品，這是由于高溫可以破壞細胞,有利于脂類從細胞中出來。此外，脂蛋白在昆蟲體內(nèi)普遍存在，高溫可使蛋白質(zhì)變性，脂類聚集，降低了黏度和表面張力，更利于脂類的釋放。

磷脂具有重要的生理意義, 它是細胞中脂肪酸新陳代謝的中間產(chǎn)物，是構(gòu)成細胞生物膜脂雙層的基本骨架，也是構(gòu)成各種脂蛋白的主要組成成分，大腦和神經(jīng)細胞的組成中磷脂必不可少。磷脂能調(diào)節(jié)人體代謝、消除大腦疲勞、提高人體記憶力、防止動脈粥樣硬化。桑螵蛸中磷脂含量豐富, 有磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰肌醇及溶血磷脂酰膽堿等[7]?？箟难?鉬藍分光光度法顯色快速, 操作簡便,不需要特殊試劑，且顏色穩(wěn)定,是一種快速、安全、準確測定磷含量的方法[8]。本實驗采用抗壞血酸-鉬藍分光光度法測定桑螵蛸生制品中的磷脂含量，結(jié)果穩(wěn)定可靠。磷脂不耐熱，在高溫條件下極不穩(wěn)定，易發(fā)生分解。桑螵蛸經(jīng)過鹽炒和蒸制的高溫后，磷脂含量下降，鹽炒品和蒸品均較生品低。

查閱歷年關于桑螵蛸的文獻, 其化學成分方面多集中在粗成分的研究，關于生品及炮制品的對比研究則是少之又少。中藥炮制對于中藥的化學成分和藥理作用有顯著影響。隨著科學技術的發(fā)展和人們對藥物研究認識的深入，對桑螵蛸炮制前后化學成分和藥理作用的進一步研究可以為臨床用藥提供參考，具有重要意義和廣闊的發(fā)展前景。

[1] 國家藥典委員會.中國藥典[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2010:281-282.

[2] 張保國,張大祿.動物藥[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2003: 523-529.

[3] 楊會全,程地蕓,葉玉蘭.3種桑螵蛸的氨基酸含量分析[J].基層中藥雜志,1999,13(3):16-17.

[4] 吳笳笛.多糖的作用及其研究進展[J].沈陽師范大學學報：自然科學版,2008(2):221-223.

[5] 萬楚筠,黃鳳洪,李文林.抗壞血酸-鉬藍光度法測定油脂中磷脂含量的研究[J].中國油脂,2006(4):46-49.

[6] 譚正懷,雷玉蘭,張白嘉,等.?？~峭的藥理比較研究[J].中國中藥雜志,1997，22(8):496.

[7] 許益明,王永珍.桑螵蛸磷脂及游離氨基酸成分分析[J].中藥材,1989,12(8):24-25.

[8] 黃城,周燕,曾淦寧,等.抗壞血酸-鉬藍分光光度法測定海藻中磷的研究探討[J].海洋環(huán)境學,2009(1):76-78.

(責任編輯：余 婷)

Comparision of Protein and Polysaccharide and Lipids in Antis Egg-case before and after Processing

Jia Kunjing1,Ai Xue1,Jia Tianzhu1,2*,Ju Chengguo1,2

(1.Pharmacy College，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Dalian 116600, China; 2.Chinese Materia Medica Processing Engineering Center of Liaoning Province, Dalian 116600, China)

Objective:Compare polysaccharide and lipids in antis egg-case before and after processing.Methods:Use phenol sulfuric acid method and weight loss method to determine the content of polysaccharide and total fat in antis egg-case before and after processing,and ascorbic acid-molybdenum blue method for determining the content of phosphatide.Results:The content of protein and polysaccharide from high what is the non-processde sample ,the salt-fride sample and the water-steamde sample. The content of total fat from high what is the water-steamde sample,the salt-fride sample and the non-processde sample.The content of phosphatide from high what is the non-processde sample,the water-steamde sample,the salt-fride sample.Conclusion:The content of polysaccharide and phosphatide are declined after processing,and the content of total fat is rised.

Antis Egg-case;Protein;Polysaccharide;Lipids

2015-07-15

國家中醫(yī)藥管理局行業(yè)專項(201107007)

賈坤靜(1989-)，女，遼寧中醫(yī)藥大學碩士研究生，研究方向為中藥炮制原理。

賈天柱(1951-)，男，遼寧中醫(yī)藥大學教授、博士生導師，研究方向為中藥炮制原理。

R284.1

A

1673-2197(2015)23-0015-03

10.11954/ytctyy.201523007