吳 霞，葉勇樹，王國才，李藥蘭*

(1.廣東藥學(xué)院 中心實驗室，廣東 廣州 510006；2.暨南大學(xué) 中藥及天然藥物研究所，廣東 廣州 510632)

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HPLC法測定陳皮水提物中三種活性成分含量

吳 霞1，葉勇樹2，王國才2，李藥蘭2*

(1.廣東藥學(xué)院 中心實驗室，廣東 廣州 510006；2.暨南大學(xué) 中藥及天然藥物研究所，廣東 廣州 510632)

目的：采用高效液相色譜(HPLC)法測定陳皮水提物中橙皮苷、川陳皮素和橘皮素含量。方法：采用HPLC法，以橙皮苷、川陳皮素和橘皮素為化學(xué)對照品，固定相：Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(4.6mm×250mm, 5μm)，流動相：乙腈和0.5%的醋酸水溶液，流速：1.0mL/min，檢測波長：283nm和330nm，柱溫：25℃。結(jié)果：橙皮苷、川陳皮素和橘皮素的保留時間在20.46～35.55min之間，平均回收率為97.5%～98.6%，RSD為2.1%～3.3%，精密度為0.97%～1.0%；同時測定了收集自不同產(chǎn)地和年份的10種陳皮的活性成分含量。結(jié)論：HPLC法適合陳皮中橙皮苷、川陳皮素和橘皮素含量的測定，該方法操作簡便，具有較高的靈敏度和精密度。

HPLC法；陳皮水提物；活性成分

陳皮為蕓香科植物橘(CitrusreticulataBlanco)及其栽培變種的干燥成熟果皮，主要分布于我國廣東、四川、福建、江西等地[1]。陳皮性溫，味苦、辛，具有燥濕化痰、理氣健脾的功效[2]，作為藥用和食用的歷史悠久，其保健功效早已被國內(nèi)外所認(rèn)同?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，陳皮水提物具有較好的藥理活性作用[3-5]，其中橙皮苷和多甲氧基黃酮川陳皮素及橘皮素為其有效成分[6-9]。陳皮中所含黃酮類成分以橙皮苷的含量最高，其次是多甲氧黃酮類成分，該類成分又以川陳皮素和橘皮素的含量居高[10-11]。因此，本實驗建立了HPLC法測定廣陳皮水提物中橙皮苷、川陳皮素和橘皮素三種有效成分含量的分析方法，同時測定了不同產(chǎn)地來源陳皮的有效成分含量。該方法可為陳皮在食品和藥品中的進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試劑

儀器：Agilent-1200 高效液相色譜系統(tǒng)；二極管陣列檢測器(DAD)；對照品：橙皮苷、川陳皮素、橘皮素(自制，經(jīng)1H-NMR、13C-NMR和MS等技術(shù)和理化性質(zhì)鑒定，用HPLC峰面積歸一法測定其純度在98%以上)；試劑：乙腈(色譜純，科密歐公司)，水為純凈水(怡寶食品飲料有限公司)，醋酸(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)。藥材：廣陳皮(S1)購于江門市新會區(qū)，經(jīng)暨南大學(xué)藥學(xué)院周光雄教授鑒定為茶枝柑Citrusreticulate'Chachi'的干燥成熟果皮；收集不同儲存時間、不同產(chǎn)地的陳皮樣品10批，經(jīng)暨南大學(xué)藥學(xué)院周光雄教授鑒定為陳皮。樣品保存于暨南大學(xué)藥學(xué)院。具體見表1。

表1 陳皮藥材(無限極有限公司提供)

2 實驗方法

2.1 檢測波長選擇

由紫外吸收色譜圖可以看出，橙皮苷在283nm處、川陳皮素和橘皮素在 330nm 處有較強(qiáng)吸收且基線平穩(wěn)，因此選擇283nm 作為橙皮苷的檢測波長，330nm作為川陳皮素和橘皮素的檢測波長，結(jié)果見圖1。

圖1 供試品溶液中橙皮苷(A)、川陳皮素(B)和橘皮素(C)紫外吸收色譜

2.2 流動相選擇與優(yōu)化

本實驗考察了甲醇-水、乙腈-水及在流動相中添加不同濃度的乙酸對樣品分離的影響。結(jié)果表明，采用乙腈-0.5%乙酸水系統(tǒng)對橙皮苷、川陳皮素和橘皮素的分離效果與甲醇-水系統(tǒng)相比有明顯改善，而乙酸濃度對樣品分離影響不大；同時，采用梯度洗脫能滿足樣品基線分離且保留時間適宜。因此，實驗采用乙腈-0.5%乙酸水系統(tǒng)作為流動相，洗脫方式為梯度洗脫。

2.3 提取方法考察

本實驗主要考察廣陳皮水提物中有效成分橙皮苷、川陳皮素和橘皮素的含量。實驗采用水加熱回流提取法，分別考察20倍量和30倍量水、提取次數(shù)對結(jié)果的影響。結(jié)果表明，30倍量水加熱回流提取三次，已接近提取完全。見表2。

2.4 色譜條件

優(yōu)化后色譜條件為：色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6mm×250mm, 5μm)；流動相：乙腈(B)-0.5%醋酸水(A)進(jìn)行梯度洗脫；流速：1.0mL/min；檢測波長：283nm(橙皮苷)，330nm(川陳皮素和橘皮素)；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10μL，見表3。

表2 水(30倍量) 加熱回流提取次數(shù)考察(峰面積)

表3 梯度洗脫條件

在上述色譜條件下，廣陳皮水提物中供試品及橙皮苷、川陳皮素和橘皮素色譜峰分離度良好，結(jié)果見圖2。

圖2 各樣品色譜

2.5 對照品溶液制備

精密稱取川陳皮素1.7mg、橘皮素1.5mg，加甲醇溶解，定容，得川陳皮素(0.34mg/mL)、橘皮素(0.30mg/mL)混合液。精密稱取橙皮苷2.0mg置于5mL容量瓶中，精密加入混合液1.0mL，加甲醇稀釋至刻度，搖勻制成每1mL含川陳皮素0.068mg、橘皮素0.06mg和橙皮苷0.4mg的混合對照品溶液。

2.6 供試品溶液制備

取廣陳皮藥材(S1)粉碎，過80目篩，混合均勻后，精密稱定約4.0g，置于500mL 圓底燒瓶中，加120mL水，直火加熱回流提取1h，放冷至約40～50℃，抽濾，重復(fù)提取3次，過濾，合并過濾液，濃縮，加水定容至250mL容量瓶中，搖勻即得。取1mL溶液過0.45μm微孔濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

分別精密吸取上述混合對照品溶液1、4、6、10、16、20μL注入液相色譜儀，按“2.4”項下色譜條件測定。以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，分別得到橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1668.4x+1.061，r=0.999 9(n=6)，川陳皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=3494.5x+16.712，r=0.999 8(n=6)，橘皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=3661.2x-0.3414，r=0.999 9(n=6)。結(jié)果表明橙皮苷、川陳皮素和橘皮素分別在0.8～8.0μg、0.136～1.36μg、0.12～1.2μg范圍內(nèi)質(zhì)量與峰面積線性關(guān)系良好。

2.8 精密度考察

精密吸取混合對照品溶液10μL，按“2.4”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積值，結(jié)果橙皮苷、川陳皮素和橘皮素的峰面積RSD值分別為1.0%、0.96%和0.97%，表明儀器精密度良好。

2.9 穩(wěn)定性考察

取廣陳皮(S1)供試品溶液于制備后0、2、8、16、24h，按“2.4”項下色譜條件進(jìn)樣，橙皮苷、川陳皮素、橘皮素的峰面積RSD值分別為2.80%、0.66%和0.80%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 重復(fù)性試驗

精密稱定廣陳皮粉末(S1)約4.0 g，平行5份，分別按“2.6”項下方法制備供試品溶液，并按照“2.4”項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積值，結(jié)果橙皮苷、川陳皮素和橘皮素的峰面積RSD分別為0.7%、1.1%和3.6%(n=5)，表明測定方法重現(xiàn)性良好。

2.11 加樣回收率考察

精密稱取廣陳皮(S1)粉末4.0g，平行操作5份，分別加入一定量的對照品，按“2.6”項下方法制備供試品溶液，并按照“2.4”項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積值，并計算各測得含量值。結(jié)果表明，橙皮苷、川陳皮素和橘皮素的平均回收率分別為97.5%、98.9%和98.6%，RSD分別為2.4%、2.1%和3.3%(n=5)，表明該方法準(zhǔn)確度良好。結(jié)果見表4。

表4 廣陳皮水提物加樣回收率試驗結(jié)果 (n=5)

3 含量測定

分別精密稱取不同產(chǎn)地陳皮粉末4.0g，按照“2.6”項下方法制備供試品溶液，并按照“2.4”項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積值，按照線性回歸方程，以1g廣陳皮中所含有效成分含量(mg)計算廣陳皮有效成分含量。結(jié)果見表5。

表5 不同產(chǎn)地不同年份陳皮有效成分含量測定結(jié)果

4 結(jié)果與討論

本實驗主要測定了陳皮水提物中三種有效成分的含量。供試品制備采用水加熱回流提取的方法，能較好地將有效成分提取出來，由于橙皮苷易溶于熱水，過濾時將提取液冷卻置40～50℃過濾，可減少損失。提取方法具有對環(huán)境無污染，操作簡便，適用于食品及藥品的生產(chǎn)利用。

實驗中考察了甲醇-水、乙腈-水及在流動相中添加不同濃度的乙酸對樣品分離的影響。結(jié)果表明，采用乙腈-0.5%乙酸水系統(tǒng)對橙皮苷、川陳皮素和橘皮素的分離效果與甲醇-水系統(tǒng)相比有明顯改善且乙酸濃度對樣品分離影響不大，同時，采用梯度洗脫能滿足樣品基線分離且保留時間適宜。

本實驗建立了HPLC法測定廣陳皮水提物中橙皮苷、川陳皮素和橘皮素的含量，同時，還對不同產(chǎn)地不同年份陳皮進(jìn)行分析測定，該方法簡便、準(zhǔn)確高效、穩(wěn)定性好，為陳皮的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

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(責(zé)任編輯：魏 曉)

Determination of Three Active Constituents in the Aqueous Extract of Citrus reticulata 'Chachi' by HPLC

Wu Xia1, Ye Yongshu2, Wang Guocai2, Li Yaolan2*

(1.Central Laboratory, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China;2.Institute of Traditional Chinese Medicine & Natural Products, College of Pharmacy, Jinan University, Guangzhou 510632, China)

Objective:To establish a HPLC method for determination of hesperidin, nobiletin and tangeretin in the aqueous extract of Citrus reticulata 'Chachi'.Methods:The HPLC analysis was conducted on Agilent-1200 with C18reversed-phase column (Agilent Zorbax SB, 4.6mm×250mm, 5μm). The gradient mobile phase consisted of 0.5% acetic acid and acetonitrile, and the flow rate is 1.0mL/min. The monitoring wavelengths were 283 nm and 330 nm, respectively. The column temperature was selected to be 25℃. Results:The retention times of hesperidin, nobiletin and tangeretin were ranged from 20.46～35.55 min, the average recoveries were 97.5%～98.6%, the relative standard deviations were 2.1%～3.3%, and the precision reached 0.97%～1.0%. Besides, the contents of hesperidin, nobiletin and tangeretin in the aqueous extract of Citrus reticulata 'Chachi' collected from differents places and different storage years were measured.Conclusion:The established method in the present study was simple, convenient and practicable.

HPLC; Aqueous Extract of Citrus Reticulata 'Chachi'; Active Constituents

2014-09-11

國家自然科學(xué)基金項目(81202429)

吳霞(1980-)，女，廣東藥學(xué)院助理研究員，研究方向為天然藥物活性成分研究與藥物分析。

李藥蘭(1963-),女，暨南大學(xué)教授，研究方向為天然藥物化學(xué)和生物活性研究。E-mail: tliyl@jun.edu.cn

R284

A

1673-2197(2015)03-0024-04

10.11954/ytctyy.201503010