尚 林，李建菊，尚 軍(.青海省紅十字醫(yī)院，青海 西寧 80008；.青海省黃河水電新能源分公司，青海 西寧 80008；3.青海師范大學(xué) 青藏高原環(huán)境與資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 80008)

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HLPC法測(cè)定青海不同產(chǎn)區(qū)冬蟲(chóng)夏草腺苷含量

尚 林1，李建菊2，尚 軍3*
(1.青海省紅十字醫(yī)院，青海 西寧 810008；2.青海省黃河水電新能源分公司，青海 西寧 810008；3.青海師范大學(xué) 青藏高原環(huán)境與資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810008)

目的：評(píng)價(jià)青海省不同產(chǎn)地冬蟲(chóng)夏草藥材的內(nèi)在質(zhì)量。方法：以高效液相色譜法測(cè)定來(lái)源于10個(gè)產(chǎn)地的冬蟲(chóng)夏草腺苷的含量。結(jié)果：10個(gè)產(chǎn)地冬蟲(chóng)夏草的腺苷含量范圍在0.011%～0.065%，其中玉樹(shù)冬蟲(chóng)夏草腺苷含量最高為0.065%，其次是果洛為0.041%，化隆、民和及互助三地產(chǎn)冬蟲(chóng)夏草腺苷含量稍高于2010版《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)論：不同產(chǎn)地冬蟲(chóng)夏草的腺苷含量不同，以玉樹(shù)、果洛兩地冬蟲(chóng)夏草品質(zhì)較優(yōu)。

冬蟲(chóng)夏草；腺苷；HLPC

冬蟲(chóng)夏草(Cordycepssinensis)又名中華蟲(chóng)草，簡(jiǎn)稱蟲(chóng)草，是麥角菌科真菌冬蟲(chóng)夏草寄生在蝙蝠蛾科昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)上的子座及幼蟲(chóng)尸體的復(fù)合體，是一種傳統(tǒng)的名貴滋補(bǔ)中藥材，有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能、抗腫瘤、抗疲勞等多種功效[1-3]。腺苷是一種遍布人體細(xì)胞的內(nèi)源性核苷，可直接進(jìn)入心肌經(jīng)磷酸化為腺苷酸，參與心肌能量代謝，同時(shí)還參與擴(kuò)張冠脈血管，增加血流量。腺苷對(duì)心血管系統(tǒng)和機(jī)體的許多其他系統(tǒng)及組織均有生理作用。腺苷是冬蟲(chóng)夏草主要有效成分之一，也是蟲(chóng)草中功效成分的重要指標(biāo)，2010年版《中國(guó)藥典》將其作為指標(biāo)成分應(yīng)用于冬蟲(chóng)夏草的質(zhì)量控制，規(guī)定腺苷含量不得少于0.010%。

青海省冬蟲(chóng)夏草數(shù)量和質(zhì)量居全國(guó)之冠，其中玉樹(shù)、果洛占青海省總產(chǎn)量的85%以上，以玉樹(shù)產(chǎn)量為最高；此外，海南藏族自治州所屬的興?？h、同德縣、貴德縣，黃南藏族自治州所屬的同仁縣、河南縣，海東地區(qū)的化隆縣、互助縣、民和縣腦山地區(qū)也有分布，但數(shù)量較少[4,5]。近年來(lái)由于冬蟲(chóng)夏草價(jià)格漲勢(shì)迅猛，人們?yōu)樽非蠼?jīng)濟(jì)利益，每年幾乎在全省冬蟲(chóng)夏草分布區(qū)都有采挖，為了闡明青海省不同產(chǎn)地冬蟲(chóng)夏草的藥材道地性及其品質(zhì)特點(diǎn)，本文采用HPLC 法分析了10個(gè)產(chǎn)地的冬蟲(chóng)夏草中主要有效成分腺苷的含量。

1 儀器與藥品

1.1 儀器

Waters600 高效液相色譜儀系列(Waters公司)；Pl202-L梅特勒-托利多分析天平。

1.2 藥品

腺苷標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%，美國(guó)進(jìn)口)，甲醇為色譜純，其它試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)水均為三級(jí)去離子水。冬蟲(chóng)夏草在2013年5月收購(gòu)于產(chǎn)地農(nóng)民，新鮮冬蟲(chóng)夏草去泥沙后于-86℃保存。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

以SunfireTM C18柱(250mm×4.6mm，5μm) 為固定相，磷酸鹽緩沖液(pH6.5) (取0.01moL·L-1磷酸二氫鈉68.5mL與0.01moL·L-1磷酸氫二鈉31.5 mL混合)-甲醇(85∶15)為流動(dòng)相，流速1.0mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm。理論塔板數(shù)按對(duì)照品峰計(jì)算，應(yīng)不低于2 000[1]。在以上條件下，樣品分離狀況良好，見(jiàn)圖1、圖 2。

2.2 樣品前處理

取1～10號(hào)冬蟲(chóng)夏草樣品，分別粉碎，過(guò)三號(hào)篩，精密稱取1.00g，置于25mL具塞比色管中，加入90%甲醇約20mL，密塞超聲30min，放至室溫后90%甲醇定容至25mL，經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾，濾液吸入進(jìn)樣小瓶作為待測(cè)樣液。

2.3 線性關(guān)系考察

準(zhǔn)確稱取腺苷樣品10mg于10mL比色管中，用水—甲醇(85∶15)溶解并定容于10mL，即為1mg/mL的儲(chǔ)備液。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，將其分別稀釋為0.0、10.0、20.0、30.0、50.0μg/mL不同濃度的溶液，每個(gè)濃度進(jìn)樣2次，進(jìn)樣體積為10μL，取平均峰面積得到不同的響應(yīng)值，如圖3所示；以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為y=32 561x+6 929.8，R2=0.999 8，腺苷在10～50μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

圖1 冬蟲(chóng)夏草腺苷標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜

2.4 精密度試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，每次10μL，對(duì)照品峰面積RSD 為0.11%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液在0、2、4、6、8h分別進(jìn)樣10μL，記錄峰面積，結(jié)果5次進(jìn)樣腺苷峰面積RSD為1.75%，表明對(duì)照品溶液在8h內(nèi)較穩(wěn)定。

圖2 冬蟲(chóng)夏草1號(hào)樣品腺苷高效液相色譜

圖3 腺苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取冬蟲(chóng)夏草1號(hào)樣品，精密稱定1.21g，按“2.2”樣品制備方法，平行操作制備6份，以上述色譜條件測(cè)定，根據(jù)外標(biāo)法以峰面積進(jìn)行定量，RSD為0.46%。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱定已知腺苷含量的樣品0.5g，添加腺苷對(duì)照品適量，按含量測(cè)定項(xiàng)下方法測(cè)定，5次測(cè)定的結(jié)果為(98.12±2.05)%。

2.8 含量測(cè)定

精密吸取“2.2”制備的1～10號(hào)冬蟲(chóng)夏草樣本待測(cè)液10μL，按上述色譜條件測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 青海省不同產(chǎn)地冬蟲(chóng)夏草中腺苷含量

3 討論

由表1 可見(jiàn)，產(chǎn)區(qū)不同，冬蟲(chóng)夏草的腺苷含量不同。玉樹(shù)產(chǎn)冬蟲(chóng)夏草中腺苷含量要高于青海其他地區(qū)產(chǎn)冬蟲(chóng)夏草中腺苷含量；以腺苷含量為指標(biāo)評(píng)價(jià)冬蟲(chóng)夏草藥材的內(nèi)在質(zhì)量，玉樹(shù)和果洛產(chǎn)冬蟲(chóng)夏草質(zhì)量要優(yōu)于青海其他產(chǎn)區(qū)冬蟲(chóng)夏草。這與傳統(tǒng)認(rèn)為玉樹(shù)和果洛冬蟲(chóng)夏草品質(zhì)優(yōu)于青海其他地區(qū)的觀點(diǎn)一致[6]。上述10個(gè)產(chǎn)地的冬蟲(chóng)夏草腺苷含量均大于0.010%，符合 2010 年《中國(guó)藥典》冬蟲(chóng)夏草項(xiàng)下要求。但對(duì)冬蟲(chóng)夏草還需要考慮與冬蟲(chóng)夏草品質(zhì)相關(guān)的其他成分，如蟲(chóng)草多糖、氨基酸、核苷類物質(zhì)、甾醇類物質(zhì)、脂肪酸、維生素以及礦質(zhì)元素等的含量[7,8]。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì)，中華人民共和國(guó)藥典[M].一部.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:27.

[2] 漆偉,雷偉,嚴(yán)亞波,等.冬蟲(chóng)夏草藥理學(xué)作用的研究進(jìn)展[J].環(huán)球中醫(yī)藥,2014,7(3):227-230.

[3] 許國(guó)彩.青海冬蟲(chóng)夏草及有效成分對(duì)免疫調(diào)節(jié)作用的研究進(jìn)展[J].高原醫(yī)學(xué)雜志,2012,22(4):62-64.

[4] 于斌,梁留科,李湘豫,等.青海省冬蟲(chóng)夏草資源特征分析[J].植物分類與資源學(xué)報(bào),2012,34(5):478-482.

[5] 李芬,吳志豐,徐翠,等.三江源區(qū)冬蟲(chóng)夏草資源適宜性空間分布[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2014,35(5):1318-1325.

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(責(zé)任編輯：魏 曉)

Contents Determination of Adenosine in Different Origins Cordyceps Sinensis by HPLC

Shang Lin1，Li Jianju2，Shang Jun3*
(1.Qinghai Red Cross hospital，Xining 810008, China 2.Qinghai Huanghe Hydropower Development Co. Ltd. New Energy Branch，Xining 810008,China；3.Key Laboratory of Education Ministry on Environment and Resources in Qinghai and Tibet Plateau,Qinghai Normal University，Xining 810008,China)

Objective:In order to evaluate ten different origin cordycepssinensis’ immanent quality in Qinghai.Methods:we took HPLC as the detection.Results:the ten different origin cordyceps adenosine’s content were in the range of 0.011 ～ 0.065%, and Yu Shu cordyceps adenosine’s content were up to 0.065%, and the second was Guo-Luo which cordyceps adenosine’s content were 0.041%, while Hua-Long, Min-He and Hu-Zhu，these three place’scordyceps adenosine content are slightly higher than the "Chinese pharmacopoeia(2010)" regulation. This article implied that cordyceps adenosine’s content is different in different producing areas,Yu-Shu and Guo-Luo’scordycepssinensis quality better than the other place in Qing-Hai.

Cordyceps Sinensis；Adenosine；HLPC

2015-03-12

青海省藥用動(dòng)植物資源研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(2013-Z-Y10)

尚林(1963-)，男，青海省紅十字醫(yī)院主管藥師，研究方向?yàn)樘烊凰幬镅芯俊?/p>

尚軍(1975-)，男，青海師范大學(xué)副教授，研究方向?yàn)樘烊凰幬锘瘜W(xué)。E-mail：shjun2004@126.com

R284

A

1673-2197(2015)15-0029-02

10.11954/ytctyy.201515011