趙云燕，李 中，陳丹妮，雷清鋒，何 露，韋 睿

1)中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院神經(jīng)科，廣州510655；2)深圳大學(xué)光電工程學(xué)院，深圳518060

【生物工程 / Bioengineering】

γ-氨基丁酸受體基因的系統(tǒng)性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

趙云燕1，李 中1，陳丹妮2，雷清鋒1，何 露1，韋 睿1

1)中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院神經(jīng)科，廣州510655；2)深圳大學(xué)光電工程學(xué)院，深圳518060

提出一種多學(xué)科交叉結(jié)合的策略，試圖初步獲得系統(tǒng)性調(diào)控γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid, GABA)受體基因的轉(zhuǎn)錄因子線索. 利用基于功能基因組學(xué)方法的DNA元件百科全書計(jì)劃已發(fā)表的數(shù)據(jù)，系統(tǒng)性地獲得GABA受體基因的開放染色質(zhì)序列，并以此作為固相化探針，捕獲與其特異性相互作用的蛋白質(zhì)分子，并利用質(zhì)譜分析鑒定蛋白. 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)不同腦區(qū)獲得的核蛋白，探針都能捕獲到同樣的特異性條帶，然而，作為對(duì)照的天門冬氨酸(N-methyl-D-aspartate, NMDA)受體基因相關(guān)的開放染色質(zhì)探針，在不同腦區(qū)中并未檢獲上述特異信號(hào)，說明結(jié)合蛋白是特異的. 質(zhì)譜分析表明，與GABA受體基因相關(guān)的開放染色質(zhì)特異相互作用的蛋白是核膜血影重復(fù)蛋白-1(nuclear envelop spectrin repeatprotein-1, Nesprin-1)，又稱synaptic nuclear envelope-1(SYNE-1). 進(jìn)一步的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)生物信息學(xué)分析表明，Nesprin-1可能與MAFA、IRX2、BCL6、CEBPA以及RP58等轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合物，并與GABA受體基因GABRA5、GABRA6、GABBR1和GABBR2等共表達(dá). 表明GABA受體基因在不同腦區(qū)是通過相同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制進(jìn)行表達(dá)的，Nesprin-1可能與MAFA、IRX2、BCL6、CEBPA以及RP58等轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合物進(jìn)而調(diào)控GABA受體基因表達(dá)，該特異的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有望用于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞或是前體細(xì)胞直接分化為GABA能神經(jīng)元.

分子生物學(xué)；γ-氨基丁酸受體；開放性染色體；轉(zhuǎn)錄調(diào)控；轉(zhuǎn)錄因子；核膜血影重復(fù)蛋白

γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid, GABA) 能系統(tǒng)是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)最主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng). 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，大約有20%～50%的突觸為GABA能突觸. GABA受體作為該系統(tǒng)最重要的組成部分，參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)正常生理功能的維持[1]. 在神經(jīng)、精神病理情況下都可以觀察到GABA受體的分布或功能的異常，如癲癇、卒中、阿爾茨海默癥、精神分裂癥、抑郁和焦慮等[2]. GABA受體是臨床藥理上重要的藥物靶標(biāo)，應(yīng)用于癲癇、焦慮、抑郁、精神分裂、強(qiáng)迫癥、成癮癥以及疼痛等疾病[3]. 目前，多數(shù)的研究主要著眼于GABA受體的分子結(jié)構(gòu)以及藥理特性等方面，對(duì)于GABA受體基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制方面卻較少研究. GABA受體基因的正確表達(dá)有賴于精確的調(diào)控系統(tǒng)，從而使GABA受體在特定的部位表達(dá)特定的數(shù)量. GABA受體相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位的相互作用是這一系統(tǒng)的重要組成部分，不同轉(zhuǎn)錄因子對(duì)外界環(huán)境的各種刺激或不同發(fā)育階段的各種信號(hào)做出反應(yīng)，結(jié)合于轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，激活或抑制該基因的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控GABA受體基因表達(dá)的部位以及水平. 目前仍未確定可精確調(diào)控GABA受體基因特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，因此，本研究將對(duì)GABA受體基因調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究.

圖1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及流程Fig.1 Design and flow chart of experiment

隨著2012年DNA元件百科全書(encyclopedia of DNA elements, ENCODE)數(shù)據(jù)庫的發(fā)布，徹底顛覆了“人類基因組中90%以上的序列都是垃圾DNA”的結(jié)論，使得基因組中“垃圾DNA”片段處于活性狀態(tài)時(shí)所處染色質(zhì)區(qū)域結(jié)構(gòu)變得開放可及，形成對(duì)DNase I超敏感的開放染色質(zhì)結(jié)構(gòu)(open chromatin)，直接反映了基因組上的活性功能區(qū)域，并可作為標(biāo)志物來挖掘不同狀態(tài)下細(xì)胞的基因或功能元件[4]. 基于功能基因組學(xué)數(shù)據(jù)，將由生物信息學(xué)預(yù)測(cè)得到的DNA序列通過最新的DNA偶聯(lián)蛋白富集實(shí)驗(yàn)(DNA-pull down assay)探索其相互作用蛋白(圖1). 相比傳統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控方法，如電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)和染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序(CHIP-chip/seq)，DNA-pull down assay法更便捷可信，且具可重復(fù)性[5].

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要試劑

HEPES、氯化鉀、氯化鎂、氯化鈉、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)、苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)、蛋白酶抑制劑混合劑(protease inhibitor cocktail，PIC)、聚脫氧肌苷-脫氧胞苷酸鈉鹽(poly (deoxyinosinic-deoxycytidylic) acid sodium salt，Poly dI dC)、TEMED和甘油為美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)；二硫蘇糖醇(dithiotreitol，DTT)由Invitrogen公司生產(chǎn)；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒、鏈親和素瓊脂糖樹脂由Pierce公司生產(chǎn)；QIAamp?血液DNA提取試劑盒由QIAgen公司生產(chǎn)；pMD-T Vector 試劑盒由Takara公司生產(chǎn)；丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺由Bio-Rad公司生產(chǎn).

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

熒光/化學(xué)發(fā)光分析儀(酶標(biāo)儀)由美國(guó)Bio-Tek公司生產(chǎn)；PCR儀由美國(guó)Thermo公司生產(chǎn)；凝膠掃描成像系統(tǒng)由美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn).

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

野生型正常BALB/c小鼠3只，3月齡，雌性，由香港大學(xué)宋又強(qiáng)教授惠贈(zèng).

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 生物信息學(xué)與基因組學(xué)預(yù)測(cè)分析

為發(fā)掘潛在的GABA受體基因轉(zhuǎn)錄控制因子，基于生物信息學(xué)與基因組學(xué)的最新進(jìn)展，在最新的ENCODE數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，采取以下步驟進(jìn)行分析：① 根據(jù)在神經(jīng)元細(xì)胞中不同的組蛋白修飾情況確定核心啟動(dòng)區(qū)域；② 根據(jù)在神經(jīng)組織細(xì)胞中open chromatin以及絕緣子的分布情況，在GABA受體基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)周圍確定最近端的調(diào)控區(qū)；③ 參考不同細(xì)胞系中在此區(qū)段上各種轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合情況(ChIP-seq數(shù)據(jù))確定可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)間；④ 作為對(duì)照組，運(yùn)用上述方法對(duì)NMDA受體基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行預(yù)測(cè)分析.

2.2 小鼠不同腦區(qū)核蛋白提取

頸椎脫臼法處死小鼠后剪刀斷頭，用鑷子掀開頭蓋骨后將腦移到盛有預(yù)冷PBS的培養(yǎng)皿(直徑為60 mm)中. 剝離大腦膜，沖洗干凈后在解剖鏡下沿中線切開大腦，精細(xì)鑷分離腦區(qū)：前額葉皮質(zhì)、海馬紋狀體及小腦. 將解剖得到的小鼠不同腦區(qū)(前額葉皮質(zhì)和小腦)各約0.5 g置于EP管中，洗去多余血跡后，每管加入500 μL胞漿蛋白裂解液(含50 μL 100 mmol/L HEPES(pH=7.9)、50 μL 100 mmol/L KCl、50 μL 10 mmol/L MgCl2、50 μL 1 mmol/L EDTA、5 μL 100 mmol/L DTT、50 μL 10 mmol/L PMSF、5 μL 100× PIC及240 μL雙蒸水(distillation-distillation H2O, ddH2O)并充分磨碎組織. 將組織勻漿放置冰上并加入NP-40 裂解液50 μL，強(qiáng)烈震蕩10 s后，使用胰島素針上下抽吸組織勻漿20次. 4 000 r/min離心1 min后，棄上清，加入500 μL預(yù)冷PBS溶液，重懸，取3 μL混合物滴于載玻片上，在高倍顯微鏡下觀察細(xì)胞是否膜裂解完全. 再以4 000 r/min離心1 min，棄上清后加入500 μL胞漿蛋白裂解液，重復(fù)3次. 重懸細(xì)胞核后加入100 μL核裂解液(含20 μL 100 mmol/L HEPES(pH=7.9)、10 μL 4.2 mol/L NaCl、10 μL 15 mmol/L MgCl2、20 μL 1 mmol/L EDTA、25 μL甘油、0.5 μL 100 mmol/L DTT、5 μL 10 mmol/L PMSF、1 μL 100× PIC及8.5 μL ddH2O)，置于冰上30 min后高速(13 000 r/min)離心1 min. 將上清移至新的1.5 mL EP管后各取5 μL 上清用于BCA法蛋白濃度測(cè)定；剩余的核蛋白中加入體積分?jǐn)?shù)為15%的甘油，混合充分，按10 μL/管分裝，凍存于-80 ℃，避免反復(fù)凍融破壞核蛋白活性.

2.3 GABA和NMDA受體基因探針合成及生物素標(biāo)記

使用Primer Premier 5.0軟件對(duì)預(yù)測(cè)得到的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)間DNA序列設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，分別在上游/下游引物5′端加入4個(gè)腺嘌呤脫氧核苷酸/胸腺嘧啶脫氧核苷酸，引物序列見表2，對(duì)PCR條件進(jìn)行優(yōu)化后(退火溫度60 ℃，38個(gè)循環(huán)反應(yīng))，將得到的DNA片段分別克隆進(jìn)pMD20-T Vector，經(jīng)由大腸桿菌DH5α表達(dá)后獲得包含有DNA探針序列的質(zhì)粒. 將7個(gè)GABA能探針質(zhì)粒及5個(gè)NMDA能探針質(zhì)粒分別等量混合，并以此作為模板，加入共同引物(pMD?20-T Vector_上游引物5′-TTTTTGGATCTACTAGTCATATGGA-3′，pMD?20-T Vector_下游引物5′-TTTTTCTCGGTACCCGGGGATCCGA-3′)在PCR擴(kuò)增過程中(退火溫度60 ℃，38個(gè)循環(huán)反應(yīng))進(jìn)行Biotin-14-dATP標(biāo)記，使得同種受體探針在同一體系中標(biāo)記. 采用DNAmate核酸共沉淀劑試劑盒對(duì)上述PCR產(chǎn)物純化，以便進(jìn)行后續(xù)DNA pull-down實(shí)驗(yàn).

2.4 DNA pull-down實(shí)驗(yàn)

將80 μL的鏈親和素瓊脂糖樹脂與1 mL DNA-鏈親和素瓊脂糖樹脂結(jié)合緩沖液(10 mmol/L Tris溶液、50 mmol/L KCl，pH=7.4)混勻后，3 000 r/min離心10 s(重復(fù)1次)，棄上清，再加入100 μL DNA-鏈親和素瓊脂糖樹脂結(jié)合緩沖液，重懸后平均分為2份，各3 000 r/min離心10 s(重復(fù)1次)，然后棄上清，每管分別加入40 μL DNA-鏈親和素瓊脂糖樹脂結(jié)合緩沖液重懸. 之后，將生物素標(biāo)記并純化后的GABA受體探針和NMDA受體探針各10 μL分別加入上述懸液中，55 ℃反應(yīng)過夜. 取出上述兩管過夜反應(yīng)生物素探針-鏈親和素瓊脂糖樹脂混合物3 000 r/min離心10 s(重復(fù)1次)，棄上清，各加入80 μL 10 g/L BSA后冰浴30 min. 之后再次3 000 r/min離心10 s(重復(fù)1次)，棄上清，分別加入200 μL結(jié)合緩沖液(8 mmol/L HEPES、100 mmol/L KCl、0.08 mmol/L EDTA、2 mmol/L MgCl2，pH=7.9)重懸后將每管懸液各均分為兩管，3 000 r/min離心10s(重復(fù)1次)后棄上清，按照不同的組別分別配制100 μL反應(yīng)體系(每個(gè)反應(yīng)體系含20 μL PolydIdC、0.5 μL DTT、10 μL 500 mmol/L Protease Inhibitor Cocktail、8 μL Glycerol、6.6 μL核蛋白抽提物及54.9 μL ddH2O)，之后4 ℃滾動(dòng)反應(yīng)過夜. 取出上述過夜反應(yīng)混合物，3 000 r/min離心10 s(重復(fù)1次)后棄上清，各加入1 mL 1×結(jié)合緩沖液，重懸后3 000 r/min離心10 s (重復(fù)1次)，棄上清，將上述洗滌過程重復(fù)2次.然后，用胰島素針將殘余于管內(nèi)的緩沖液吸盡，再加入15 μL 3×loading buffer重懸. 100 ℃水浴15 min后，14 500 r/min離心5 min，將上清移至新的1.5 mL管內(nèi)，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis, SDS-PAGE)及銀染檢測(cè).

2.5 質(zhì)譜分析

將銀染后SDS-PAGE膠的目的條帶在解剖顯微鏡下分離出來，送至香港大學(xué)李嘉誠(chéng)醫(yī)學(xué)院基因研究中心進(jìn)行質(zhì)譜分析檢測(cè).

2.6 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)生物信息學(xué)分析

基于生物信息學(xué)方法，采用Transfac/JASPAR在線數(shù)據(jù)庫對(duì)DNA探針區(qū)段進(jìn)行預(yù)測(cè)，確定可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(transcription factor binding site，TFBS)及與之相作用的轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor).通過文獻(xiàn)挖掘，利用已有知識(shí)確定上述因子可能與GABA調(diào)控以及信號(hào)通路之間的關(guān)系，并除去非神經(jīng)組織表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子. 然后利用HPRD/BIOGRID中的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行擴(kuò)展分析，挖掘能夠與候選轉(zhuǎn)錄因子直接相互作用的中間因子，從而構(gòu)建出完整的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò).

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 生物信息學(xué)與基因組學(xué)預(yù)測(cè)分析結(jié)果

依據(jù)生物信息學(xué)與基因組學(xué)的最新進(jìn)展，采用2014年3月發(fā)布的ENCODE數(shù)據(jù)，分析比較神經(jīng)元與其他非神經(jīng)元細(xì)胞基因，得到在神經(jīng)元中特異性表達(dá)的GABA受體以及NMDA受體基因，如表1.

表1 神經(jīng)元內(nèi)特異表達(dá)的GABA和NMDA受體基因

針對(duì)這兩組基因，結(jié)合組蛋白修飾情況、Open Chromatin數(shù)據(jù)和ChIP-seq數(shù)據(jù)等進(jìn)行生物信息學(xué)分析后，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)GABA受體以及NMDA受體基因開放性染色體上可能的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，得到特異在中樞神經(jīng)元內(nèi)起作用的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，如表2. 本研究預(yù)測(cè)的7個(gè)GABA受體基因探針在不同腦區(qū)的分布情況不同，因此，將選擇分布探針最多的前額葉皮質(zhì)區(qū)(5個(gè))與分布探針最少的小腦區(qū)(1個(gè))進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究.

表2 GABA和NMDA受體基因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果及相應(yīng)引物序列

3.2 小鼠不同腦區(qū)核蛋白提取

細(xì)胞核蛋白的抽提過程中，在細(xì)胞膜破裂后，高倍光鏡下進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜破裂完全，僅剩細(xì)胞核. 提出核蛋白后，測(cè)得抽提物蛋白質(zhì)量濃度分別為：前額葉皮質(zhì)4.98 g/L，小腦5.8 g/L.

3.3 GABA和NMDA受體基因探針合成及生物素標(biāo)記

將7條GABA受體及5條NMDA受體基因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)間進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，分別成功克隆λpMD20-T Vector后可得到如圖2(a)所示包含DNA探針序列的質(zhì)粒. 將這些質(zhì)粒作為模板，Biotin-14-dATP作為底物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后可得如圖2(b)所示的生物素標(biāo)記后探針.

圖2 GABA和NMDA受體基因探針合成及生物素標(biāo)記Fig.2 Synthesis and biotin labeling of GABA and NMDA receptor gene probes

3.4 DNA pull-down實(shí)驗(yàn)

標(biāo)記后的DNA探針與鏈親和素瓊脂糖樹脂反應(yīng)24 h后，取上清進(jìn)行瓊脂糖膠電泳并未看到DNA探針條帶，表明標(biāo)記后的探針已與鏈親和素瓊脂糖樹脂充分結(jié)合. 前額葉皮質(zhì)區(qū)與小腦區(qū)的核蛋白抽提物分別與GABA受體探針及NMDA受體探針行DNA pull-down實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，GABA受體DNA探針在前額葉皮質(zhì)和小腦神經(jīng)元細(xì)胞核蛋白中分別都有相同的特異性結(jié)合條帶，大小約為34 kDa(如圖3紅色箭頭所示)，而在NMDA受體DNA探針中未觀察到相應(yīng)的結(jié)合條帶.

圖3 GABA受體以及NMDA受體DNA探針在前額葉皮質(zhì)、小腦神經(jīng)元細(xì)胞核蛋白中的相互作用Fig.3 Interaction of GABA and NMDA receptor gene probes in nuclear proteins of prefrontal cortex and cerebellum

3.5 質(zhì)譜分析結(jié)果

特異與GABA受體DNA探針結(jié)合的約34 kDa的蛋白條帶，其質(zhì)譜分析結(jié)果為核膜血影重復(fù)蛋白-1 (nuclear envelop spectrin repeatprotein-1, Nesprin-1)，又稱synaptic nuclear envelope-1 (SYNE-1).

3.6 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)生物信息學(xué)分析

通過上述DNA pull-down實(shí)驗(yàn)，GABA受體DNA探針可特異性地與Nesprin-1結(jié)合. 然而，作為核內(nèi)重要蛋白的Nesprin-1并不是轉(zhuǎn)錄因子，故Nesprin-1應(yīng)該通過與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用形成復(fù)合物進(jìn)而調(diào)控GABA受體基因表達(dá).

首先，通過運(yùn)用Transfac/JASPAR在線數(shù)據(jù)庫分析，7條GABA受體基因探針上共找到112個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(transcription factor binding site，TFBS)及75個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor). 進(jìn)一步將75個(gè)轉(zhuǎn)錄因子依據(jù)可與其作用的GABA受體基因探針數(shù)目進(jìn)行排序.其中，出現(xiàn)頻率大于2次的轉(zhuǎn)錄因子共25個(gè)(表3)，再經(jīng)過文獻(xiàn)挖掘，篩選出神經(jīng)組織表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子共5個(gè)，分別是MAFA、IRX2、BCL6、CEBPA和RP58.

表3 GABA受體基因相互作用的可能轉(zhuǎn)錄因子

在HPRD/BIOGRID數(shù)據(jù)庫的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)中進(jìn)行擴(kuò)展分析，Nesprin-1與上述5個(gè)可能轉(zhuǎn)錄因子之間分別可通過≤2個(gè)中間因子構(gòu)成相互作用網(wǎng)絡(luò)(圖4).

圖4 GABA受體基因與NESPRIN-1相互作用調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中可能的轉(zhuǎn)錄因子Fig.4 Possible transcriptional factors in the regulatory network between NESPRIN-1 and GABA receptors

對(duì)所得到的相互作用網(wǎng)絡(luò)繼續(xù)進(jìn)行拓展分析，即分別對(duì)5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子、中間因子以及NESPRIN-1與已知GABA相關(guān)蛋白相互作用的情況進(jìn)行綜合分析，得到更加精確的GABA受體基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，如圖5.

圖5 GABA受體基因通過CEBPA或IRX2與NESPRIN-1相互作用調(diào)控拓展網(wǎng)絡(luò)Fig.5 Expanded interaction reaction network between GABA receptors and NESPRIN-1 via CEBPA or IRX2

4 討 論

作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)最主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)受體，GABA受體參與了許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生理活動(dòng)，故GABA受體數(shù)量、分布或功能的異常與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)，如癲癇、卒中、阿爾茨海默癥、精神分裂癥、抑郁和焦慮等. 目前，多數(shù)的研究主要著眼于GABA受體的分子結(jié)構(gòu)組成以及藥理特性等方面，但對(duì)于GABA受體基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制方面的研究鮮有報(bào)道. 為探究GABA受體基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，發(fā)掘潛在的GABA受體基因轉(zhuǎn)錄控制因子，本研究基于生物信息學(xué)與基因組學(xué)的最新進(jìn)展對(duì)GABA受體可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位進(jìn)行了預(yù)測(cè)，以此作為DNA探針在神經(jīng)元核蛋白中識(shí)別與之特異結(jié)合的核蛋白Nesprin-1. 然而作為一種核內(nèi)重要的蛋白，Nesprin-1并不是轉(zhuǎn)錄因子. Nesprins家族是最近新發(fā)現(xiàn)的一組在細(xì)胞內(nèi)廣泛表達(dá)的含多個(gè)血影蛋白重復(fù)序列的細(xì)胞骨架蛋白家族[6]，最初是Zhang等[7]在對(duì)血管平滑肌細(xì)胞分化標(biāo)記物的研究中發(fā)現(xiàn)，由于此類蛋白結(jié)構(gòu)上具有聚合血影蛋白重復(fù)序列、雙組分核定位序列、保守的C-端以及單跨膜區(qū)域等特點(diǎn)，故將之命名為Nesprin(nuclear envelope spectrin repeat). Nesprin-1 是Nesprin 家族中研究較多的蛋白之一，其基因位于染色體的6q25.Nesprin-1蛋白的基本結(jié)構(gòu)為：N端是串聯(lián)成對(duì)的鈣調(diào)蛋白同源區(qū)( CH-domain) 的肌動(dòng)蛋白結(jié)合區(qū)( actin-binding domain，ABD)，中間是多個(gè)血影蛋白重復(fù)序列形成的桿狀區(qū)域，其上有多種蛋白結(jié)合位點(diǎn)，C端為一跨膜區(qū)，是果蠅屬及秀麗隱桿線蟲的Klarischt 同源，稱 KLS區(qū). 鈣調(diào)蛋白同源區(qū)能連接細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白，而KLS 區(qū)是Nesprin 定位于核膜上所必需的，并能參與核膜定位. Nesprin-1主要定位在核膜，參與維持核形態(tài)、連接細(xì)胞核到細(xì)胞骨架，使細(xì)胞核固定在細(xì)胞的特定位置，其突變將使細(xì)胞核無法維持正常形態(tài)和空間構(gòu)象，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞異常[6].

近年來，研究者發(fā)現(xiàn)Nesprin-1/2參與了神經(jīng)發(fā)育以及神經(jīng)元遷移過程[8]. Zhang等[8-12]發(fā)現(xiàn)在大腦皮層細(xì)胞核遷移(interkinetic nuclear migration，INM)和神經(jīng)元遷移過程中，Nesprin-1/2通過與動(dòng)力蛋白Dynein/Dynactin和驅(qū)動(dòng)蛋白(kinesin)相互作用進(jìn)而介導(dǎo)中心體和細(xì)胞核的連接. 在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，文獻(xiàn)[8]指出對(duì)Nesprin-1/2突變后可引起嚴(yán)重的學(xué)習(xí)以及記憶方面的損害. 另外，Gros-Louis等[13]報(bào)道了一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的常染色體隱性遺傳小腦共濟(jì)失調(diào)(autosomal recessive cerebellar ataxia，ARCA)致病基因——Nesprin-1. 由此可知，Nesprin-1不僅參與了神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程，且其基因的突變可引起嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病.

綜上可知，Nesprin-1與中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理生理過程有密切關(guān)系，本研究通過DNA pulldown實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其可與GABA受體基因探針特異性結(jié)合，因此，Nesprin-1可能通過與轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合物從而參與GABA受體基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控. 綜合Transfac/JASPAR在線數(shù)據(jù)庫以及HPRD/BIOGRID數(shù)據(jù)庫，進(jìn)一步分析并描繪了Nesprin-1與可能的轉(zhuǎn)錄因子MAFA、IRX2、BCL6、CEBPA以及RP58形成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并推測(cè)，在中樞神經(jīng)組織中，細(xì)胞通過該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)調(diào)控GABA受體在特定的部位、特定的時(shí)間進(jìn)行表達(dá).

結(jié) 語

本研究采用的DNA-PullDown方法中，將預(yù)測(cè)所得的同種受體(GABA能或NMDA受體)基因調(diào)控序列分別混合起來，再將之與不同腦區(qū)神經(jīng)元核抽提物進(jìn)行反應(yīng)，這種體外反應(yīng)模式模擬了細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)的三維作用. 真核細(xì)胞的染色體是由一系列各自獨(dú)立、高度有序的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的，這些結(jié)構(gòu)域是獨(dú)立的基因表達(dá)調(diào)控單位，在真核生物的基因表達(dá)調(diào)控中起重要作用，比如DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)變化、DNA堿基修飾變化和組蛋白變化，因此，研究者一直致力于研究染色質(zhì)構(gòu)架在基因調(diào)控中的作用. Zhang等[14]證實(shí)了染色質(zhì)通過DNA的三維折疊幫助距離遠(yuǎn)的區(qū)域調(diào)控基因表達(dá)，這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)揭示了人類基因組中的基因雖然相隔甚遠(yuǎn)，但相關(guān)基因可以通過長(zhǎng)距離的染色體相互作用、高度有序的染色體構(gòu)架，有序地進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控. 本研究將預(yù)測(cè)所得的同種受體基因調(diào)控序列結(jié)合起來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，很好地模擬了細(xì)胞核內(nèi)真實(shí)的基因表達(dá)調(diào)控模式.

在對(duì)GABA受體基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的探索中，目前的工作僅是一個(gè)開端. 通過上述實(shí)驗(yàn)分析，初步建立了基于神經(jīng)細(xì)胞特異性功能基因組數(shù)據(jù)庫探索調(diào)控GABA受體基因的分子控制模式，并且該分子控制模式是調(diào)節(jié)GABA受體在特定部位、特定時(shí)間表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控網(wǎng)絡(luò). 后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，將與iNc轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合后，以期能夠應(yīng)用于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞或是體細(xì)胞直接分化為GABA能神經(jīng)元，為將來構(gòu)建與GABA能神經(jīng)元相關(guān)的疾病模型或再生醫(yī)學(xué)治療提供研究基礎(chǔ).

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【中文責(zé)編：晨 兮；英文責(zé)編：艾 琳】

Systematic regulatory network of gamma-aminobutyric acid receptor genes

Zhao Yunyan1, Li Zhong1?, Chen Danni2, Lei Qingfeng1,He Lu1, and Wei Rui1

1) Department of Neurology, The Sixth Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510655, P.R.China 2) College of Optoelectronic Engineering, Shenzhen University, Shenzhen 518060, P.R.China

By using a multidisciplinary strategy, we try to systematically find out the transcription factors that regulate gamma-aminobutyric acid (GABA) receptor expression. Based on the published data in the encyclopedia of DNA elements (ENCODE), we obtain open chromatin sequences of GABA receptor genes. These sequences are used as solid phase probes to capture the specific proteins that could interact with the sequences directly. The captured protein is identified with mass spectrometry for further regulatory network analysis. The experimental results show that the GABA receptor gene probes can capture one specific band in different brain domains while the N-methyl-D-aspartate (NMDA) gene probes, which are designed as negative control, could not capture this specific band. Mass spectrometry results indicate that the protein, which could specifically bind with GABA receptor gene open chromatin sequence, is nuclear envelop spectrin repeatprotein-1(Nesprin-1)(synaptic nuclear envelope-1, SYNE-1). Further bioinformatics analysis results suggest that Nesprin-1 could form a complex with transcription factors such as MAFA, IRX2, BCL6, CEBPA and RP58 and could co-express with GABA receptor genes such as GABRA5, GABRA6, GABBR1 and GABBR2. In conclusion, GABA receptor genes are regulated through the same transcriptional regulation mechanism in different brain domains. Nesprin-1 could interact with transcription factors such as MAFA, IRX2, BCL6, CEBPA and RP58 to form a regulatory complex that regulates the expression of GABA receptor genes. This specific regulatory network can be used as a tool for further inductions of the differentiation of embryonic stem cells or other stem cells into GABA receptor expressing neurons.

molecular biology; gamma-aminobutyric acid (GABA) receptor; open chromatin; transcription regulation; transcription factor; nuclear envelop spectrin repeatprotein-1 (Nesprin-1)

：Zhao Yunyan, Li Zhong, Chen Danni, et al．Systematic regulatory network of gamma-aminobutyric acid receptor genes[J]. Journal of Shenzhen University Science and Engineering, 2015, 32(2): 128-136.(in Chinese)

R 338.2; Q 426

A

10.3724/SP.J.1249.2015.02128

廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金資助項(xiàng)目(A2012211)；廣州市天河區(qū)科技計(jì)劃重點(diǎn)資助項(xiàng)目(201404KW028)

趙云燕(1986—)，女(漢族)，福建省福州市人，中山大學(xué)碩士研究生，E-mail：zoezhao7898@gmail.com

Received：2014-11-03；Accepted：2014-12-26

Foundation：Guangdong Medical Science and Technology Research Foundation(A2012211)；Guangzhou Tianhe District Science and Technology Key Project (201404KW028)

? Corresponding author：Chief physician Li Zhong．E-mail: zslyjohn@163.com

引 文：趙云燕，李 中，陳丹妮，等．γ-氨基丁酸受體基因的系統(tǒng)性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[J]. 深圳大學(xué)學(xué)報(bào)理工版，2015，32(2)：128-136.