高 陽，劉國寶，劉 科，李冉輝，鄭易之

深圳市微生物基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，深圳 518060

【生物工程 / Bioengineering】

大豆ASR表達(dá)提高酵母和煙草細(xì)胞對(duì)Cu2+耐受力

高 陽，劉國寶，劉 科，李冉輝，鄭易之

深圳市微生物基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，深圳 518060

利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)，證明大豆幼苗在150 μmol/L CuSO4脅迫3 h后，其葉和根內(nèi)GmASR基因表達(dá)均上調(diào)．將大豆GmASR基因轉(zhuǎn)化Cu2+敏感型酵母菌ΔCUP2和煙草懸浮細(xì)胞BY-2，GmASR蛋白的表達(dá)可增強(qiáng)重組酵母和轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞抗Cu2+脅迫的能力．利用大腸桿菌表達(dá)體系表達(dá)、分離并純化大豆GmASR蛋白，體外實(shí)驗(yàn)證明，GmASR蛋白可與Cu2+結(jié)合，并具有清除羥基自由基的能力．研究結(jié)果推測(cè)，ASR蛋白可通過螯合Cu2+降低細(xì)胞內(nèi)Cu2+濃度，提高植物對(duì)Cu2+脅迫的耐受力．

植物基因工程；GmASR基因；轉(zhuǎn)基因煙草；重組突變體酵母；抗金屬離子脅迫；金屬離子結(jié)合蛋白

ASR(abscisicacid,stress,ripening-induced)基因是植物中一類受脫落酸(abscisicacid，ABA)、脅迫和果實(shí)成熟誘導(dǎo)表達(dá)的基因．Gonzalez等[1]首次從西紅柿葉中分離出了ASR基因，并在30余種單子葉和雙子葉植物中克隆到ASR基因．然而，在模式植物擬南芥中未發(fā)現(xiàn)ASR同源基因[2]．ASR基因可編碼分子質(zhì)量相對(duì)較小的堿性蛋白質(zhì)(10～30kDa)，富含甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、賴氨酸以及組氨酸，具有較高的親水性及熱穩(wěn)定性．ASR蛋白序列中通常含有3～5個(gè)保守區(qū)，不同ASR蛋白具有不同的保守區(qū)域，每個(gè)保守區(qū)都富含組氨酸[3]．

ASR蛋白的表達(dá)模式具有多樣性，ABA、脅迫和果實(shí)成熟過程都可以誘導(dǎo)植物體內(nèi)ASR基因表達(dá)[4-5]．如ABA存在條件下，香蕉mAsr3和mAsr4的相對(duì)表達(dá)量上升顯著[6]．干旱脅迫可誘導(dǎo)西紅柿葉中的ASR1和ASR2基因表達(dá)上調(diào)，然而在根中只有ASR2基因表達(dá)上調(diào)[7]．鋁脅迫時(shí)，水稻ASR5基因的轉(zhuǎn)錄水平上升[8]．ASR基因表達(dá)模式的多樣性意味著ASR蛋白可能參與植物細(xì)胞對(duì)多種環(huán)境信號(hào)的響應(yīng)．一些轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)也證明，ASR基因的過表達(dá)能提高植物對(duì)非生物脅迫的耐受力，如大蕉MpASR基因的過表達(dá)可使轉(zhuǎn)基因擬南芥耐旱性提高[9]；百合花粉LLA23基因(ASR)和番茄ASR1基因的過表達(dá)可分別使轉(zhuǎn)基因擬南芥和轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性提高[10-11]．ASR蛋白可通過多種機(jī)制提高植物的抗逆功能，如體外實(shí)驗(yàn)證明，西紅柿ASR1蛋白能夠保護(hù)乳酸脫氫酶、限制性內(nèi)切酶SmaI等的活性[12]．西紅柿ASR1蛋白在Zn2+存在時(shí)能與DNA結(jié)合，可能起到轉(zhuǎn)錄因子的作用[13]．ASR基因在植物細(xì)胞中的保護(hù)功能和保護(hù)機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究．

Cu2+是植物生長和發(fā)育的必需微量元素，但過量Cu2+積累會(huì)對(duì)植物細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用[14]．如前所述，ASR蛋白可能參與植物對(duì)干旱、高鹽和鋁脅迫的保護(hù)作用，然而它能否提高植物對(duì)重金屬離子(如Cu2+)脅迫的耐受性還不清楚．大豆基因組編碼3個(gè)ASR蛋白(Glyma10g36890.1、Glyma16g28150.1和Glyma20g30720.1)，本實(shí)驗(yàn)室克隆得到第3個(gè)GmASR基因(Glyma20g30720.1)，先前的研究表明，大豆GmASR蛋白具有結(jié)合Fe3+和Zn2+的特性，并能減少由Fe3+產(chǎn)生的羥基自由基[15]．本研究檢測(cè)了在Cu2+脅迫過程中，大豆幼苗GmASR基因的表達(dá)模式，并證明大豆GmASR基因表達(dá)可提高Cu2+敏感酵母突變株和轉(zhuǎn)基因煙草懸浮細(xì)胞對(duì)Cu2+的耐受力，探討了ASR蛋白對(duì)植物細(xì)胞保護(hù)的分子基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料、菌株和載體

選取大豆(GlycinemaxL.)“白農(nóng)六號(hào)”種子(由吉林省白城市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供)，萌發(fā)后將其移栽到Hoagland營養(yǎng)液中．培養(yǎng)至兩片真葉期，將大豆幼苗進(jìn)行150μmol/LCuSO4脅迫處理，間隔一定時(shí)間取幼根和幼葉于-80 ℃保存，用于RNA提?。?/p>

煙草懸浮細(xì)胞BY-2(由香港中文大學(xué)姜里文教授惠贈(zèng))在MS液體培養(yǎng)基中，于28 ℃條件下120r/min振蕩培養(yǎng)．懸浮細(xì)胞3～4d繼代一次[16]．

釀酒酵母Cu2+敏感突變株ΔCUP2購自Euroscarf公司．酵母表達(dá)載體pYES2/CT載體(Invitrogen公司生產(chǎn))、植物表達(dá)載體pCAMBIA1300和pBI121、大腸桿菌重組質(zhì)粒pET28a/GmASR[15]、大腸桿菌菌株Top10和BL21star，以及農(nóng)桿菌LBA4404菌株均由本實(shí)驗(yàn)室保存．

1.1.2 培養(yǎng)基及主要試劑

培養(yǎng)大腸桿菌使用LB培養(yǎng)基(lysogenybrothmedium)，酵母細(xì)胞使用YPD培養(yǎng)基(yeastextractpeptonedextrosemedium)，煙草懸浮細(xì)胞BY-2使用MS培養(yǎng)基(murashigeandskoogmedium；4.3g/LMS粉、30g/L蔗糖、0.255g/L磷酸二氫鉀、1mg/L維生素B1、0.4mg/L2,4-D、100mg/L肌醇，pH=5.0)．MS粉購于Caisson公司，分子克隆相關(guān)酶購于Takara公司，其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方 法

1.2.1 熒光實(shí)時(shí)定量PCR

采用Trizol(Invitrogen公司)法提取大豆根葉組織中的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMⅡ1ststrandcDNAsynthesis(Takara公司)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用作熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，PCR)的模板，正反引物分別為qGmASR-F和qGmASR-R(表1)．以大豆actin基因作為內(nèi)參，對(duì)應(yīng)引物為actinF和actinR(表1)．采用SYBR?PremixExTaqTMⅡ(Takara公司)試劑盒，進(jìn)行PCR擴(kuò)增(ABI7500PCR儀)．PCR擴(kuò)增程序如下：95 ℃預(yù)變性30s，95 ℃變性5s，60 ℃反應(yīng)31s，40次循環(huán)．采用2-△△Ct方法分析Real-timeqPCR數(shù)據(jù)．

表1 實(shí)驗(yàn)引物匯總表

1.2.2 酵母表達(dá)載體的構(gòu)建及酵母轉(zhuǎn)化

根據(jù)GmASR基因序列(GenBank登錄號(hào)：AY382827)設(shè)計(jì)引物Y-F和Y-R(表1)，以pET28a/GmASR為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)．將擴(kuò)增的PCR片段進(jìn)行HindIII和SacI酶切，再連接至酵母表達(dá)載體pYES2/CT．采用醋酸鋰方法，將空載體pYES2/CT和重組表達(dá)載體pYES2/GmASR轉(zhuǎn)化銅敏感型酵母(ΔCUP2)，并利用組氨酸營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基SCR(syntheticcompletemediumcontainingraffinose，以20g/L蜜三糖為碳源的SC(syntheticcompletemedium)培養(yǎng)基)篩選出陽性克隆ΔCUP2/pYES2和ΔCUP2/GmASR．

1.2.3Cu2+脅迫下酵母生長曲線的測(cè)定

挑取對(duì)照菌ΔCUP2/pYES2和重組菌ΔCUP2/GmASR各3個(gè)單克隆，在SCR液體培養(yǎng)基中(30 ℃，200r/min)培養(yǎng)2～3d．按體積比1∶10將菌液接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基(YPGal，含10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，10g/L半乳糖，pH=5.8)中培養(yǎng)8h后，分別接入含100μmol/LCuCl2的YPGal培養(yǎng)基，菌液的初始濃度調(diào)至光密度(opticaldensity,OD)D(600)=0.02．間隔時(shí)間取樣，測(cè)D(600)值，繪制生長曲線．實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次．使用SPSS進(jìn)行t檢驗(yàn)(t-test)方差分析．

1.2.4 植物表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化煙草懸浮細(xì)胞

用HindIII和EcoRI分別酶切質(zhì)粒pBI121和pCAMBIA1300，將pBI121上的35S-GUS-Nos片段連到pCAMBIA1300上，構(gòu)建質(zhì)粒pCAMBIA1300-GUS，然后用XbaI和SacI切除GUS．設(shè)計(jì)引物BY-F和BY-R(表1)，以重組質(zhì)粒pET28a/GmASR為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)．獲得的PCR片段經(jīng)XbaI和SacI酶切后連到切除GUS的植物表達(dá)載體pCAMBIA1300中．用電擊法將空載體、重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404，得到對(duì)照菌LBA/1300和重組菌LBA/GmASR．

用農(nóng)桿菌LBA/1300和LBA/GmASR轉(zhuǎn)染煙草懸浮細(xì)胞BY-2．將轉(zhuǎn)化的BY-2細(xì)胞平鋪到含有潮霉素B和頭孢霉素的固體篩選培養(yǎng)基上，28 ℃避光培養(yǎng)3～4周，直至細(xì)胞團(tuán)形成．選擇3個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞團(tuán)BY/GmASR和1個(gè)對(duì)照BY/1300轉(zhuǎn)入MS液體培養(yǎng)基(含有潮霉素B和頭孢霉素)中懸浮培養(yǎng)，用于后續(xù)分析．

繼代培養(yǎng)2～3次后，提取各轉(zhuǎn)基因細(xì)胞核糖核酸(ribonucleicacid，RNA)，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)脫氧核糖核酸(complementarydeoxyribonucleicacid，cDNA)．以cDNA為模板，以GmASR-F和GmASR-R為引物(表1)進(jìn)行PCR鑒定，確認(rèn)獲得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞．煙草BY-actin(表1)作為內(nèi)參基因．

1.2.5Cu2+脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞生長的測(cè)定

將轉(zhuǎn)空載體的對(duì)照BY/1300及轉(zhuǎn)GmASR基因的煙草懸浮細(xì)胞BY/GmASR培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，將其涂布在正?；蚝?0μmol/LCuSO4的固體培養(yǎng)基上，觀測(cè)愈傷組織的生長．

1.2.6 固相金屬螯合親和層析和內(nèi)源熒光法研究GmASR蛋白與Cu2+的結(jié)合

將pET28a/GmASR載體轉(zhuǎn)化BL21star菌．異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)誘導(dǎo)GmASR蛋白的表達(dá)，并利用His親和層析分離純化GmASR蛋白[15]．

通過固相金屬螯合親和層析方法檢測(cè)GmASR蛋白與Cu2+的結(jié)合[17]．色譜柱使用HiTrapTMChelatingHP(5mL；AmershamPharmaciaBiotech，Tokyo公司生產(chǎn))．GmASR蛋白濃度為35μmol/L．同時(shí)，采用內(nèi)源熒光方法研究GmASR蛋白與Cu2+的相互作用．GmASR蛋白溶解在10mmol/LHEPES(pH=7.0)中，加入不同濃度的CuSO4溶液，GmASR蛋白的終濃度為25μmol/L．室溫下溫育5min，用熒光分光光度計(jì)(F-4500，日本Hitachi公司生產(chǎn))檢測(cè)．激發(fā)波長為280nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5nm，掃描速度為1 200nm/min．

1.2.7 羥基自由基清除實(shí)驗(yàn)

羥基自由基清除實(shí)驗(yàn)參照Hara等[18]的方法并做出適當(dāng)調(diào)整．配制200μL樣品溶液：體積分?jǐn)?shù)為10%的PBS(pH=7.4)、4.6μmol/LCuCl2、10mmol/Lcoumarin-3-carboxylicacid(購自Sigma)、1μmol/Ldesferrioxamine(購自Sigma)、300μmol/L抗壞血酸鈉以及不同濃度的GmASR或BSA蛋白．加入抗壞血酸鈉使該體系產(chǎn)生羥基自由基并產(chǎn)生熒光(395nm激發(fā)光，452nm發(fā)射光)，用全波長酶標(biāo)儀(日本Thermo公司生產(chǎn))監(jiān)測(cè)30min．

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

2.1 Cu2+脅迫不同時(shí)間大豆幼苗中GmASR基因相對(duì)表達(dá)量的變化

大豆幼苗在含150 μmol/L CuSO4的營養(yǎng)液中培養(yǎng)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Cu2+脅迫下GmASR基因在幼葉和幼根中的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果表明(圖1)，與0h相比，處理3h時(shí)，幼葉中GmASR基因表達(dá)水平顯著上調(diào)；處理6h和12h時(shí)，該基因相對(duì)表達(dá)量下降；處理24h后，該基因的表達(dá)再次升高；而處理至72h時(shí)，其表達(dá)水平達(dá)到最高，如圖1(a)．在幼根中GmASR基因的表達(dá)趨勢(shì)與葉中十分相似，只是在脅迫48h時(shí)，該基因表達(dá)水平達(dá)最高，在72h時(shí)略有下降，如圖1(b)．

圖1 GmASR基因在葉和根中的相對(duì)表達(dá)量Fig.1 Relative expression of GmASR gene in leaves and roots

2.2 GmASR蛋白表達(dá)提高Cu2+敏感酵母突變體(ΔCUP2)對(duì)Cu2+脅迫的耐受力

將空載體和含大豆GmASR基因的載體轉(zhuǎn)化Cu2+敏感型酵母ΔCUP2．再將獲得的對(duì)照菌ΔCUP2/pYES2和重組菌ΔCUP2/GmASR分別接入正常培養(yǎng)基和含100μmol/LCuCl2的液體培養(yǎng)基中．間隔一定時(shí)間后測(cè)定酵母細(xì)胞的D(600)值．從圖2(a)生長曲線可知，在無Cu2+培養(yǎng)基中，對(duì)照菌和轉(zhuǎn)基因重組菌生長速率十分接近，表明大豆GmASR蛋白的過表達(dá)對(duì)重組菌的生長無明顯影響．圖2(b)則顯示在含Cu2+培養(yǎng)基中，在0～18h期間對(duì)照菌與轉(zhuǎn)基因重組菌的生長速率基本一致；在24～36h，轉(zhuǎn)基因重組菌的生長速率比對(duì)照菌快，差異達(dá)極顯著(P<0.01)． 可見，GmASR蛋白表達(dá)使Cu2+敏感酵母突變體(ΔCUP2)對(duì)Cu2+脅迫的耐受力得到提高．

圖2 對(duì)照菌ΔCUP2/pYES2和重組菌ΔCUP2/GmASR的生長曲線Fig.2 Growth curves of ΔCUP2/pYES2 and ΔCUP2/GmASR

2.3 GmASR蛋白表達(dá)可提高轉(zhuǎn)基因煙草懸浮細(xì)胞對(duì)Cu2+脅迫的耐受力

將空載體和含GmASR基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草懸浮細(xì)胞BY-2，獲得轉(zhuǎn)空載體的對(duì)照BY/1300(contrastcheck，CK)和3個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞系BY/GmASR(T1、T2和T3)，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA．以cDNA為模板，用GmASR-F和GmASR-R為引物(表1)進(jìn)行PCR驗(yàn)證．從瓊脂糖電泳可以看出，對(duì)照組CK不能擴(kuò)增出特異條帶，而3個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞系T1、T2和T3均可擴(kuò)增出700堿基對(duì)(basepair,bp)左右的特異性條帶，如圖3(a)，表明GmASR基因已轉(zhuǎn)入煙草細(xì)胞中，并得到了表達(dá)．

將對(duì)照組CK及轉(zhuǎn)基因煙草懸浮細(xì)胞BY/GmASR(T1、T2和T3)分別涂布在正常固體培養(yǎng)基及含50μmol/LCuSO4的脅迫培養(yǎng)基上．培養(yǎng)15d后，在正常培養(yǎng)基上對(duì)照和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系生長狀況接近．但在含Cu2+的培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞愈傷組織體積明顯大于對(duì)照細(xì)胞(圖3(b))，說明GmASR蛋白表達(dá)提高轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞對(duì)Cu2+脅迫的耐受力．

圖3 GmASR基因表達(dá)可提高轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞BY-2抗 Cu2+脅迫的能力Fig.3 Expression of GmASR gene in transgenic tobacco BY-2 cells under copper stress

2.4 GmASR蛋白具有Cu2+結(jié)合的抗氧化能力

將pET28a/GmASR載體轉(zhuǎn)化BL21star菌，加入異丙基-β-D硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogaloctopyranoside,IPTG)誘導(dǎo)GmASR蛋白的表達(dá)，并利用His親和層析分離純化GmASR蛋白．將固相金屬螯合親和層析柱HiTrapchelatingHP螯合Cu2+，再加入GmASR蛋白．先用EQ緩沖液(equilibrationbuffer)洗脫未結(jié)合的蛋白，再利用乙二胺四乙酸(eathylenediaminetetraaceticacid，EDTA)將金屬離子從HiTrap柱上洗脫下來．取樣進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE)，結(jié)果如圖4(a)．以牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，BSA)作為陽性對(duì)照，以未加金屬離子的作為陰性對(duì)照．結(jié)果顯示，在EDTA洗脫的樣品中可發(fā)現(xiàn)GmASR蛋白，表明GmASR蛋白能與Cu2+結(jié)合．

圖4 GmASR 蛋白與Cu2+的結(jié)合及其清除羥基自由基活性的能力Fig.4 Cu2+ binding and hydroxyl radicals scavenging activity of GmASR protein

蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光主要是由Trp和Tyr殘基產(chǎn)生．蛋白質(zhì)與金屬離子結(jié)合后常引起蛋白內(nèi)源熒光的淬滅效應(yīng)．圖4(b)表明，在280nm光激發(fā)下，GmASR蛋白的熒光最大發(fā)射峰出現(xiàn)在310nm附近．隨著GmASR蛋白溶液中Cu2+濃度的增加，最大熒光發(fā)射峰位未發(fā)生位移，熒光強(qiáng)度逐漸降低，即出現(xiàn)了猝滅效應(yīng)，表明GmASR蛋白與Cu2+間存在相互作用，或者說Cu2+使GmASR蛋白的熒光生色團(tuán)的微環(huán)境和分子構(gòu)象發(fā)生了改變．

參照Hara等[18]的方法，檢測(cè)GmASR蛋白是否可以減少由Cu2+產(chǎn)生的羥基自由基．羥基自由基的清除能力通過半數(shù)抑制濃度(inhibitoryconcentration50%，IC50)來表示，并以羥基自由基清除劑BSA為陽性對(duì)照，結(jié)果見圖4(c).由圖4(c)可見，GmASR蛋白具有清除羥基自由基的能力，其IC50=0.65μmol/L，GmASR蛋白的抗氧化能力比與BSA要好，且差異達(dá)極顯著(P<0.01)．

3 討 論

現(xiàn)代冶煉、金屬加工、機(jī)器制造及其他工業(yè)廢水中都含有銅，其中，以金屬加工和電鍍工廠所排廢水含銅量最高．這種廢水排入水體，會(huì)影響水和土壤的質(zhì)量．Cu2+影響植物生長和發(fā)育．植物受到Cu2+脅迫時(shí)，會(huì)表達(dá)多種蛋白質(zhì)用于減輕脅迫帶來的細(xì)胞傷害，ASR蛋白是其中重要的一類植物保護(hù)性蛋白．本研究結(jié)果證明，在Cu2+脅迫過程中，幼苗的葉片和根部GmASR基因的表達(dá)量在脅迫3h和24h(或48h)出現(xiàn)2次峰值，表明大豆GmASR基因?qū)u2+脅迫存在快速應(yīng)答和慢速應(yīng)答．快速應(yīng)答是植物對(duì)周圍環(huán)境變化的應(yīng)激性反應(yīng)，而慢速應(yīng)答是植物在較長時(shí)間脅迫下產(chǎn)生的適應(yīng)性反應(yīng)，即脅迫耐受性[19]．GmASR基因的表達(dá)受到Cu2+脅迫的誘導(dǎo)，說明它可能與植物的抗Cu2+脅迫有關(guān)．而轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)也證明，GmASR基因的過表達(dá)確實(shí)能提高重組酵母和轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞的抗Cu2+能力．

非生物脅迫可以在生理水平和代謝水平上對(duì)植物造成影響，如細(xì)胞膜穩(wěn)定性降低、水分喪失、離子平衡失調(diào)和離子毒害等，其中，金屬(Cu、Fe、Cd和Pb等)離子濃度的升高可以催化活性氧物質(zhì)(reactiveoxygenspecies，ROS)的產(chǎn)生，繼而對(duì)細(xì)胞造成氧化傷害[20]．已有研究結(jié)果證明蛋白質(zhì)序列中的組氨酸可結(jié)合金屬離子，減輕對(duì)細(xì)胞的氧化傷害．大豆GmPM1和GmPM9蛋白(LEA4)以及柑橘CuCOR19蛋白(LEA2)，可通過其序列中的組氨酸結(jié)合Fe3+、Cu2+、Ni2+和Zn2+等金屬離子，具有清除羥自由基和過氧自由基的功能[21-22]．Hara等[18]也證明擬南芥中的AtHIRD11蛋白(LEA2)能減少由Cu2+產(chǎn)生的ROS，并且組氨酸是ROS清除的重要氨基酸．大豆GmASR蛋白含有高比例(9.8%)的組氨酸．文獻(xiàn)[15]的研究已證明，GmASR蛋白可以與Fe3+結(jié)合，并降低Fe3+催化的羥基自由基．本研究用體外實(shí)驗(yàn)證明，GmASR蛋白可直接與Cu2+結(jié)合．推測(cè)植物受到Cu2+脅迫時(shí)，表達(dá)的GmASR可螯合細(xì)胞內(nèi)高濃度的Cu2+，減輕Cu2+的毒害作用，降低ROS引起的氧化傷害．因此，利用植物表達(dá)ASR蛋白在治理環(huán)境中Cu2+污染可能有潛在應(yīng)用前景．

利用酵母突變體及功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，可準(zhǔn)確地鑒定基因的功能．本實(shí)驗(yàn)利用的是Cu2+敏感型酵母ΔCUP2，CUP2基因是Cu2+可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)酵母細(xì)胞的CUP2基因發(fā)生突變后，不能啟動(dòng)下游的Cu2+結(jié)合蛋白CUP1的表達(dá)，造成細(xì)胞內(nèi)Cu2+積累過多，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害[23]．本研究構(gòu)建了可表達(dá)大豆GmASR蛋白的酵母載體，轉(zhuǎn)化Cu2+敏感型酵母ΔCUP2，證明GmASR蛋白的表達(dá)可以提高酵母突變體耐Cu2+脅迫的能力，即對(duì)Cu2+敏感型酵母細(xì)胞中CUP2基因的缺失起到了補(bǔ)償效應(yīng)．這一結(jié)果進(jìn)一步支持了前述“ASR蛋白可通過結(jié)合Cu2+，參與植株對(duì)Cu2+脅迫的耐受性”的結(jié)論．

結(jié) 語

研究了大豆GmASR基因的表達(dá)能提高轉(zhuǎn)基因重組型酵母和煙草細(xì)胞對(duì)Cu2+脅迫的耐受力．實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，Cu2+可以誘導(dǎo)大豆幼苗內(nèi)GmASR基因的表達(dá)．體外實(shí)驗(yàn)固相金屬螯合親和層析和內(nèi)源熒光法證明GmASR蛋白可直接螯合Cu2+，羥基自由基清除實(shí)驗(yàn)證明GmASR蛋白具有抗氧化能力，植物細(xì)胞中的ASR蛋白可以通過螯合多余的金屬離子，起到保護(hù)植物細(xì)胞的作用．

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【中文責(zé)編：晨 兮；英文責(zé)編：艾 琳】

Expression ofASRgene confers copper tolerance to yeast mutant and transgenic tobacco BY-2 cells

Gao Yang, Liu Guobao, Liu Ke, Li Ranhui, and Zheng Yizhi?

Shenzhen Key Laboratory of Microbiology and Gene Engineering, College of Life Science,Shenzhen University, Shenzhen 518060, P.R.China

Expression analysis by quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) shows thatGmASRisidentifiedwithincreasedexpressionintherootsandleavesofsoybeanseedlingsunder150μmol/LCuSO4stressfor3h.TheGmASRgeneisintroducedintoCu2+sensitiveyeastΔCUP2andtobaccosuspensionBY-2cells,andwefindthatexpressionofGmASRproteincouldimprovecoppertoleranceoftherecombinantyeastmutantandtransgenictobaccoBY-2cells.GmASRproteinisinduced,separatedandpurifiedbyusingtherecombinantE.Coli.ItisconfirmedthattheGmASRproteincanbindCu2+andalsoinhibithydroxylradicalgenerationinvitro.WecanspeculatethattheGmASRproteinwouldenhancetheplanttoleranceofcopperstressbychelatingCu2+,reducingintracellularCu2+concentrationandoxidantdamage.

plant genetic engineering;GmASRgene;transgenictobaccoBY-2cells;recombinantmutantyeast;metalionstresstolerance;metal-bindingprotein

：Gao Yang, Liu Guobao, Liu Ke, et al. Expression ofASRgene confers copper tolerance to yeast mutant and transgenic tobacco BY-2 cells[J]. Journal of Shenzhen University Science and Engineering, 2015, 32(2): 137-144.(in Chinese)

Q943.2；Q

A

10.3724/SP.J.1249.2015.02137

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31370289)；深圳市科技創(chuàng)新委資助項(xiàng)目(JCYJ20120614085333654)

高 陽(1989—)，女(漢族)，湖北省孝感市人，深圳大學(xué)碩士研究生．E-mail：gaoy822@163.com

Received：2014-12-26；Accepted：2015-01-30

Foundation：National Natural Science Foundation of China (31370289)；Science and Technology Project of Shenzhen(JCYJ20120614085333654)

? Corresponding author：Professor Zheng Yizhi．E-mail：yzzheng@szu.edu.cn

引 文：高 陽，劉國寶，劉 科，等. 大豆ASR表達(dá)提高酵母和煙草細(xì)胞對(duì)Cu2+耐受力[J]. 深圳大學(xué)學(xué)報(bào)理工版，2015，32(2)：137-144.