鄔賢 陳嘉盛 曹瑩 丘玉昌 龐建新

摘要：端粒酶是維持端粒長(zhǎng)度的重要組成部分，是腫瘤發(fā)生的標(biāo)志物之一。構(gòu)建了能表達(dá)人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）C端936-1132氨基酸片段（C197）的重組腺病毒Ad-GFP-C197，并觀察其對(duì)Hela細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示，Ad-GFP-C197感染Hela細(xì)胞后，采用免疫印跡法檢測(cè)到C197在細(xì)胞內(nèi)得到高效表達(dá)。此外，Ad-GFP-C197明顯抑制Hela細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且降低Hela細(xì)胞中端粒酶活性。上述研究為進(jìn)一步研究hTERT C末端功能打下基礎(chǔ)，并為腫瘤的生物治療提供新的思路。

關(guān)鍵詞：重組腺病毒；Hela細(xì)胞；人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶；C197；細(xì)胞凋亡；端粒酶活性

中圖分類(lèi)號(hào)：R966 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-7847（2015）03-0237-05

端粒是在染色體末端維持染色體穩(wěn)定的帽狀結(jié)構(gòu)，含有特征性的TTAGGG重復(fù)片段。細(xì)胞每一次分裂均會(huì)使TTAGGG片段的丟失，最終導(dǎo)致DNA缺損，引起細(xì)胞死亡。端粒酶是一種核糖核蛋白，能特異性地在染色體DNA末端加上TTAGGG片段，防止端?？s短。絕大多數(shù)人體細(xì)胞中檢測(cè)不到端粒酶的活性[1]。與此相反，在85 010的腫瘤細(xì)胞中檢測(cè)到了端粒酶活性[2]。端粒酶對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展起到重要的促進(jìn)作用[3]。

人端粒酶主要組成部分包括RNA（ humantolemerase RNA，hTR）和逆轉(zhuǎn)錄酶（human telom-erase reverse transcriptase，hTERT）。hTR作為模板，在hTERT的作用下使端粒末端得以延長(zhǎng)。hTERT有3個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別是N末端部分，具有逆轉(zhuǎn)錄活性的中間部分（逆轉(zhuǎn)錄區(qū)），以及一小段C末端序列[4]。N末端主要是與hTR結(jié)合部位，C末端主要是與DNA結(jié)合部位，這兩部分是hTERT與其他逆轉(zhuǎn)錄酶的主要區(qū)別。逆轉(zhuǎn)錄區(qū)是催化活性部位，幾乎所有的逆轉(zhuǎn)錄酶在該區(qū)的活性基團(tuán)都高度保守。目前對(duì)hTERT不同片段的研究較多的是將hTERT的N末端和逆轉(zhuǎn)錄區(qū)的保守基因進(jìn)行缺失突變或識(shí)別hTERT自然存在的不同mRNA剪切體，觀察這些突變體或剪切體對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響和端粒酶活性[5-7]。另外，一些剪切體可以翻譯成蛋白質(zhì)，表現(xiàn)出不同的生理和病理功能，如抑制細(xì)胞增殖、抑制Wnt信號(hào)途徑等端粒外功能[8，9]。

目前對(duì)hTERT C末端的研究較少，有研究表明，hTERT的C末端可調(diào)節(jié)hTERT在細(xì)胞內(nèi)定位[10]，對(duì)端粒酶的功能不可或缺[11]。在前期的研究中，我們?cè)?jīng)構(gòu)建了表達(dá)hTERT C末端197個(gè)氨基酸（hTERT 936-1132，C197）的真核表達(dá)質(zhì)粒[12]，但表達(dá)量不高。在此基礎(chǔ)上，本研究構(gòu)建了能大量表達(dá)C197片段的重組腺病毒Ad-GFP-C197.為進(jìn)一步研究hTERT的C末端功能打下基礎(chǔ)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)C197可明顯抑制Hela細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，降低細(xì)胞端粒酶的活性，為腫瘤的生物治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1材料1

.1.1 菌種、細(xì)胞系、載體

BJ5183、DH5α、HEK293細(xì)胞、Hela細(xì)胞、重組腺病毒系統(tǒng)AdFJasy-l（包含骨架質(zhì)粒PAdEasy-l和穿梭質(zhì)粒PAdTrack-CMV）均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和設(shè)備

胎牛血清、高糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；SalI和Ecor V限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Ex -Tag酶、Pme I酶、PacI酶均購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；小量質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司；Trizol試劑盒購(gòu)自上海生物技術(shù)有限公司；臺(tái)盼蘭試劑盒購(gòu)自碧云天公司；凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司；PVDF膜、TRAP法端粒酶活性檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；ECL顯色試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；EB溶液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；6-his tag抗體、凝膠成像分析儀（美國(guó)Kodak公司）；GDPDH抗體、羊抗鼠IgG二抗均購(gòu)自美國(guó)Santa公司；細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）；高速離心機(jī)（美國(guó)Backman公司）；熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.2方法

1.2.1 目的基因獲取

根據(jù)GenBank公布的人hTERT基因序列，選取C端936-1132氨基序列片段（命名為C197），在該片段中的C端引入EcorV限制性酶切位點(diǎn)，在N端引入6個(gè)his標(biāo)簽和SalI限制性酶切位點(diǎn)，片段總長(zhǎng)度為650 bp，合成后克隆至pGSI載體（上海生工公司合成）。

1.2.2 重組腺病毒大質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

將含有目的基因的pGSI載體進(jìn)行雙酶切（Sal I和EcorV酶），酶切片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，回收含有his tag的C197基因。穿梭質(zhì)粒PAdTrack-CMV分別用SalI和EcorV限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，隨后在T4 DNA連接酶作用下與C197基因進(jìn)行連接，獲得重組質(zhì)粒PAdTrack-C197。用Pme I酶線性化PAdTrack-C197，將其轉(zhuǎn)化進(jìn)入到含有骨架質(zhì)粒PAdEasy-l的BJ5183細(xì)菌中進(jìn)行同源重組，得重組大質(zhì)粒PAd-C197。以重組大質(zhì)粒PAd-C197為模板，C197基因的上下游引物（上游引物序列：5'-AGGGTCGACACCAT-GCATCATCACCATCACCAT-3'，下游引物序列：5'-TGGATATCTCAGTCCAGGATGGTCTTGAA -3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定和基因序列測(cè)序，同時(shí)用SalI和EcorV限制性內(nèi)切酶對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。

1.2.3 重組腺病毒Ad-GFP-C197的包裝

將重組大質(zhì)粒PAd -C197進(jìn)行Pac I線性化，用脂質(zhì)體2000將線性化產(chǎn)物轉(zhuǎn)染進(jìn)入HEK293細(xì)胞中進(jìn)行腺病毒包裝，待細(xì)胞出現(xiàn)CPE病變現(xiàn)象時(shí)，收集細(xì)胞，反復(fù)凍融3次，離心（3 000 r/min，4 0C）收集上清，得到病毒原液Ad-GFP-C197?？蛰d體對(duì)照病毒Ad-GFP按照同樣的方法進(jìn)行包裝。

1.2.4重組腺病毒的純化及滴度測(cè)定

Ad-GFP-C197和Ad-GFP在HEK293細(xì)胞中擴(kuò)增后，氯化銫密度梯度離心法純化病毒；最后轉(zhuǎn)入透析袋，4 0C透析過(guò)夜[13]后分裝保存，分別取一管用綠色熒光蛋白標(biāo)記法[14]檢測(cè)病毒滴度。

1.2.5 C197蛋白在Hela細(xì)胞中的表達(dá)

Hela細(xì)胞接種于6孔板（每孔2xl05個(gè)細(xì)胞），分別將Ad-GFP-C197和Ad-GFP （MOI=100）轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞48 h，提取6孔板中細(xì)胞的總蛋白行免疫印跡實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 Ad-GFP-C197對(duì)Hela細(xì)胞凋亡及增殖的影響

收集Ad-GFP-C197和Ad—GFP轉(zhuǎn)染24 h、48 h和72 h的Hela細(xì)胞，按照Annexin V-PE凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)處理樣品后上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)并收集數(shù)據(jù)，根據(jù)早期凋亡細(xì)胞占活細(xì)胞數(shù)的比例來(lái)計(jì)算凋亡率并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；同時(shí)將Hela細(xì)胞鋪于24孔板中（每孔lxl04個(gè)），共7塊板，每組實(shí)驗(yàn)6個(gè)復(fù)孔。用Ad-GFP-C197和Ad-GFP分別感染各組細(xì)胞，每天取1塊板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用胰酶消化各組細(xì)胞，采用臺(tái)盼蘭計(jì)數(shù)法對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并繪制細(xì)胞增殖曲線圖。

1.2.7 TRAP法檢測(cè)Hela細(xì)胞的端粒酶活性

收集Ad-GFP-C197轉(zhuǎn)染24 h、48 h和72 h后的Hela細(xì)胞，Ad-GFP轉(zhuǎn)染72 h的Hela細(xì)胞以及正常的Hela細(xì)胞。分別提取總蛋白并調(diào)成一致濃度，按照TRAPEZE⑩Telomerase Detection Kit說(shuō)明書(shū)操作；產(chǎn)物行12.50/0聚丙烯酰胺凝膠電泳后用EB溶液染色，于凝膠成像系統(tǒng)下拍照。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)方法

均采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)作圖軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果均以x+s表示。組間比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1獲得目的基因

從含有目的基因C197的pGSI質(zhì)粒中，用SalI和EcorV酶進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)650 bp特異性條帶，大小與目的基因相符。結(jié)果見(jiàn)圖l。

2.2 PAd-C197大質(zhì)粒的鑒定

以大質(zhì)粒PAd-C197為模板，C197基因的上下游引物進(jìn)行PCR，且將PAd-C197大質(zhì)粒進(jìn)行SalI和EcorV雙酶切，均得到目的條帶（650 bp），測(cè)序結(jié)果顯示該片段序列與我們預(yù)計(jì)的序列一致，表明重組大質(zhì)粒PAd-C197構(gòu)建正確，結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.3重組腺病毒包裝及擴(kuò)增

PacI酶切線性化的重組大質(zhì)粒PAd-C197轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞，l周后鏡下可見(jiàn)細(xì)胞呈彗星狀綠色熒光，見(jiàn)圖3；表明重組大質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)得到表達(dá)，可視為重組腺病毒包裝成功。

2.4病毒滴度的測(cè)定

Ad-GFP-C197和Ad-GFP經(jīng)擴(kuò)增純化后，采用綠色熒光蛋白法進(jìn)行病毒滴度測(cè)定，結(jié)果顯示Ad-GFP-C197的滴度為3.14xl011 pfu/mL，對(duì)照病毒Ad-GFP的滴度為2.34xl011 pfu/mL。

2.5 C197在Hela細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)

Ad-GFP-C197轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞48 h后，和空載體病毒Ad-GFP組相比，Ad-GFP-C197組的C197蛋白成功表達(dá)，進(jìn)一步說(shuō)明了重組腺病毒Ad-GFP-C197構(gòu)建成功。結(jié)果見(jiàn)圖4。

2.6 Hela細(xì)胞凋亡和增殖情況

與Ad-GFP組比較，Ad-GFP—C197轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后，在第3d開(kāi)始出現(xiàn)增殖抑制作用，細(xì)胞增殖速率明顯降低；在轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h，Ad-GFP-C197轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞的凋亡率明顯高于Ad-GFP對(duì)照組，表明Ad-GFP-C197能明顯地抑制Hela細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡。結(jié)果見(jiàn)圖5。

2.7 TRAP法檢測(cè)Hela細(xì)胞的端粒酶活性

依據(jù)TRAP方法檢測(cè)端粒酶活性，結(jié)果顯示，每一組都出現(xiàn)了36 bp的條帶，說(shuō)明TRAP方法操作成功，陰性對(duì)照組無(wú)端粒酶活性。與端粒酶陽(yáng)性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，Ad-GFP轉(zhuǎn)染組的端粒酶活性不受影響，而Ad-GFP-C197轉(zhuǎn)染組的端粒酶活性在第2d開(kāi)始出現(xiàn)降低，第3d降低得更明顯。說(shuō)明Ad-GFP-C197能夠明顯地抑制Hela細(xì)胞中端粒酶活性。結(jié)果見(jiàn)圖6。

3討論

端粒酶在除造血組織和生殖細(xì)胞外的正常組織中不表達(dá)或低表達(dá)，而在80%—90%的腫瘤中表達(dá)異常增高，所以端粒酶的激活可能是腫瘤發(fā)生過(guò)程中的關(guān)鍵因素。而端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT是端粒酶活性的限速酶，hTERT的表達(dá)異常增加也通常被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生前期標(biāo)志[15～17]。已有研究表明在體外降低hTERT的表達(dá)，可以縮短端粒長(zhǎng)度、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，于是hTiFRT成為抗腫瘤研究中一個(gè)新的特異性靶點(diǎn)[18，19]。

hTERT是由N端（RNA結(jié)合區(qū)）、逆轉(zhuǎn)錄區(qū)（催化活性區(qū)）和C端3個(gè)功能區(qū)組成，近年來(lái)大部分研究都針對(duì)N端和逆轉(zhuǎn)錄區(qū)，而C端是調(diào)節(jié)hTERT在細(xì)胞內(nèi)定位的重要結(jié)構(gòu)域，也是其在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行端粒末端復(fù)制所必需的結(jié)構(gòu)域[20]。但目前對(duì)于hTERT的C端研究不多。本研究構(gòu)建的重組腺病毒Ad-GFP-C197能在細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)hTERT C末端完整的197個(gè)氨基酸。在表達(dá)載體的設(shè)計(jì)上，我們?cè)贑197片段的N端加上了6個(gè)His標(biāo)簽，不但有利于檢測(cè)C197的表達(dá)，而且便于后續(xù)的蛋白純化，使得我們很方便就能得到足量的hTERT C末端片段，為進(jìn)一步研究其功能打下基礎(chǔ)。

PAdEasy一l腺病毒載體是一種El區(qū)和E3區(qū)雙缺失的復(fù)制缺陷型載體，要得到感染性病毒則需要在含有El區(qū)的HEK293細(xì)胞內(nèi)包裝復(fù)制[21]該載體通過(guò)在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制可大大增加治療基因的拷貝數(shù)，使治療基因高水平表達(dá)[22]，而且該載體安全，不會(huì)整合到宿主細(xì)胞內(nèi)，因此是應(yīng)用于臨床的一種基因治療載體。如Ad-p53重組腺病毒注射液（今又生）應(yīng)用于臨床治療腫瘤已數(shù)年，并取得了較好的療效[23]。在實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)將重組腺病毒Ad-GFP-C197感染Hela細(xì)胞后，能夠明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并抑制其增殖，同時(shí)還能夠降低端粒酶活性，顯示Ad-GFP-C197可能具有作為腫瘤基因治療手段的潛力，也為進(jìn)一步的機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

端粒酶活性抑制能縮短端粒，但端粒酶活性抑制至端?？s短到臨界值至少需要20 d以上[24]。而Ad-GFP-C197感染Hela細(xì)胞后3d即出現(xiàn)明顯抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，表明其作用機(jī)制可能不只是通過(guò)作用于端粒，還可能通過(guò)端粒外作用介導(dǎo)。已有的研究表明，NF-KB通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用[25，26]。hTERT在細(xì)胞核中，可以結(jié)合到NF-KB通路靶基因的啟動(dòng)子上，增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)[27]。已知hTERT C端含有14-3-3蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，而14-3-3在端粒酶的核定位中發(fā)揮重要作用[28]。C197為完整的hTERT C端序列，我們推測(cè)C197在細(xì)胞內(nèi)大量表達(dá)后，可能結(jié)合了大部分的14—3-3，進(jìn)而抑制細(xì)胞內(nèi)hTERT的核定位，使得NF-KB通路的活性受到抑制，進(jìn)而抑制Hela細(xì)胞的增殖。相關(guān)的研究工作正在開(kāi)展之中。