張霞 李利君 倪輝 蔡慧農(nóng) 蘇文金

摘要：a-L-鼠李糖苷酶（a-L-rhamnosidase（EC3.2.1.40））是一種水解酶，分布在GH13、GH28、GH78和GH106家族，其中3種GH78家族的α-L-鼠李糖苷酶具有典型的（α/α）6桶狀結(jié)構(gòu)，它能夠特異性地水解許多糖苷類物質(zhì)末端的α-L-鼠李糖基，在食品飲料加工工業(yè)和醫(yī)藥業(yè)中具有重要的應(yīng)用價值。介紹了微生物來源的α-L-鼠李糖苷酶的性質(zhì)及應(yīng)用，主要闡述了α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆、表達(dá)及該酶晶體結(jié)構(gòu)方面的研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：α-L-鼠李糖苷酶；基因克??；基因表達(dá)；晶體結(jié)構(gòu)

中圖分類號：Q71；Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1007-7847（2015）01-0068-07

ProgressesonMolecularBiologyandStructuralBiologyofα-L-rhamnosidasefromMicrobialSources

ZHANGXia1，LILi-jun1*，NIHui1.23，CA1Hui-nong1.2，3，SUWen-jin1，2，3

（1.CollegeofBioengineering，JimeiUniversity，Xiamen361021，F(xiàn)ujian，China；2.ResearchCenterofFoodMicrobiologyandEnzymeEngineeringTechnology，Xiamen361021，F(xiàn)ujian，China.，3.ResearchCenterofFoodBiotechnologyofXiamenCity，Xiamen361021，F(xiàn)ujian，China）

Abstract：a-L-rhamnosidase（EC3.2.1.40）cleavesterminalα-L-r

hamnosespecificallyfromalargenumberofglycosides.Theenzymeisabiotechnologicallyimportanthydrolyticenzymeduetoitsapplicationsinthefoodandbeverageprocessingindustryandpharmaceuticalindustry.Basedonprimarysequencesimilarities，α-L-rhamnosidasesareclassifiedwithintheCarbohydrate—activeenzymes（CAZy）databaseintofourglycosidehydrolase（GH）families（GH13，GH28，GH78andGH106family），andthreeα-L-rhamnosidasesofGH78haveatypical（α/α）6-barrelstructure.Propertiesandapplicationsofα-L-r

hamnosidasefromdifferentmicrobialsourceshavebeenintroduced.Inaddition，therecentdevelopmentsoncloning，expressionofoiLi.hamnosidasegeneandthecrystalstructureoftheenzymeweresummarized.

Keywords：α-L-rhamnosidase；genecloning；geneexpression；crystalstructure

（LifeScienceResearch，2015，19（1）：068?074）

α-L-鼠李糖昔酶（α-L-rhamnosidase（EC3.2.1.40））屬于轉(zhuǎn)化糖苷水解酶類，能夠?qū)Ｒ?、高效地水解許多糖苷類物質(zhì)如柚皮苷（naringin）、蘆?。╮utin）、橙皮苷（hesperidin）等末端的α-L-鼠李糖基[1]。α-L-鼠李糖苷酶的來源廣泛，在動物組織、植物和微生物中均發(fā)現(xiàn)了α-L-鼠李糖稈酶。目前關(guān)于動物組織[2]和植物來源的α-L-鼠李糖苷酶的報(bào)道相對較少，主要是通過細(xì)菌（如芽孢桿菌屬、擬桿菌屬、乳桿菌屬及單胞菌屬等）和真菌（如曲霉屬、青霉屬、木霉屬、犁頭霉屬及裂殖菌屬等）發(fā)酵來獲取α-L-鼠李糖苷酶。

不同微生物來源的α-L-鼠李糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)存在差異。細(xì)菌來源的α-L-鼠李糖苷酶最適pH呈中性或堿性，而真菌分泌的α-L-鼠李糖苷酶的最適pH一般在酸性范圍內(nèi)，主要在4.0～7.0[3-5]之間。微生物中的α-L-鼠李糖稈酶的最適反應(yīng)溫度一般是45?60℃[4、6]。近年來也有發(fā)現(xiàn)耐熱、嗜低溫及耐堿性的α-L-鼠李糖苷酶，如白曲霉MBRC4308[6]分泌的α-L-鼠李糖苷酶，在60℃保溫1h后酶活仍有初始酶活的80%；ThermophilicbacteriumPRI-1686[7]產(chǎn)生的α-L-鼠李糖苷酶最適溫度為70℃，在60℃處理24h后酶活為處理前的20%；而亞南極環(huán)境中的單胞菌屬細(xì)菌[8]中的α-L-鼠李糖苷酶在-1-8℃具有活性。Rojas[9]等從白黃筍頂孢霉菌（Acrostalagmus luteo albus）分離到一種新型堿性α-L-鼠李糖苷酶，以對硝基苯酚-α-I-鼠李糖苷（pNPR）為底物測得酶反應(yīng)的最適pH值為8.0，它可以在堿性條件下水解橙皮苷、柚皮苷以及槲皮苷等糖苷物質(zhì)，擴(kuò)大了α-L-鼠李糖苷酶的應(yīng)用范圍。

α-L-鼠李糖苷酶是柚苷酶及橙皮背酶的主要活性成分，是去除柑梧類果汁苦味的有效物質(zhì)[1]。果汁中的苦味物質(zhì)柚皮苷被柚苻酶水解的過程共有兩步反應(yīng)，首先在α-L-鼠李糖苷酶的作用下水解柚皮背生成普魯寧，接著在β-D-葡萄糖苷酶的作用下，生成柚皮素。在果汁酶法脫苦過程中，α-L-鼠李糖苷酶參與的第一步反應(yīng)是脫苦的關(guān)鍵，Chien[10]等用HPLC法證明僅有柚苷酶的另一組份β-D-葡萄糖背酶存在時，苦味物質(zhì)抽皮苷是不能被水解的。有研究報(bào)道，對葫溪蜜柚果汁進(jìn)行脫苦時，在α-L-鼠李糖苷酶加量為10U/mL的條件下40℃處理60min，苦味就能降低到閾值以下[11]。除了在飲料行業(yè)中用來去除柑橘類果汁的苦味[3、12]，在其他行業(yè)也具有很多潛在的應(yīng)用價值，如通過水解柚皮苷生產(chǎn)L-鼠李糖[1]和普魯寧降低黃酮類化合物的生產(chǎn)成本；增加釀造酒的香味[14、15]，改善葡萄汁和飲料的香氣成分；切除一些糖苷類藥物原料末端的L-鼠李糖等[16]。由于α-L-鼠李糖苷酶的重要應(yīng)用價值，越來越多的國內(nèi)外學(xué)者致力于該酶的研究開發(fā)。本文分別對微生物來源的α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆、表達(dá)以及該酶的晶體結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展進(jìn)行了闡述。

1α-L-鼠李糖苷酶的分子生物學(xué)研究

微生物分泌的α-L-鼠李糖苷酶是一種誘導(dǎo)酶，需要誘導(dǎo)物柚皮苷、橙皮苷、鼠李糖等存在時才能合成α-L-鼠李糖苷酶，而且微生物中α-L-鼠李糖苷酶的誘導(dǎo)受到碳源代謝調(diào)節(jié)，給微生物發(fā)酵產(chǎn)α-L-鼠李糖苷酶造成阻礙。同時隨著α-L-鼠李糖苷酶的應(yīng)用越來越廣泛，傳統(tǒng)發(fā)酵的生產(chǎn)方式不能滿足日益增長的需求，也很難達(dá)到很高的純度。因此，選擇現(xiàn)代生物技術(shù)來研究α-L-鼠李糖苷酶是一種必然趨勢

1.1α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆

早期對a-L-鼠李糖苷酶的研究主要是該酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)，2000年后對α-L-鼠李糖苷酶基因克隆的研究日漸增多，表1列舉了2000年以來微生物中GH78家族和近兩年其他家族已克隆的α-L-鼠李糖苷酶基因目前，從微生物中克隆α-L-鼠李糖苷酶基因主要采用PCR和構(gòu)建文庫的方法。據(jù)PuriM等報(bào)道，采用構(gòu)建文庫的方法克隆α-L-鼠李糖苷酶基因可以通過以下兩種方法篩選陽性克??；一種是利用pNPR作為底物篩選含有α-L-鼠李糖苷酶活性的陽性克??；另外一種是采用多克隆抗體篩選產(chǎn)鼠李糖苷酶的陽性克隆。

細(xì)菌來源的α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆研究比真菌稍早，在2000年[18]就有學(xué)者報(bào)道對Clostridium.stercorarium菌株中鼠李糖苷酶基因ramA的克隆。有些細(xì)菌中存在多個編碼α-L-鼠李糖苷酶的基因，且它們的序列存在差異，在Bacillussp.GLl[31]中克隆到rhaA和rlmB兩個編碼α-L-鼠李糖苷酶的基因，它們分別編碼兩個不同的α-L-鼠李糖苷酶。來自植物乳酸桿菌（Latto-bacillusplantarum）[23]的rhaB1和rhaB2都是編碼α-L-鼠李糖苷酶的基因，它們的序列相似性僅為26%。不同細(xì)菌中編碼α-L-鼠李糖苷酶的基因序列各異，Bacillussp.GLl[31]中rhaA和rhaB與Clostridiumstercorarium中ramA序列相似性分別為41%和23%。植物乳酸桿菌（Lactobacillus plantarum）[23]中的α-L-鼠李糖酶KhaB1和RhaB2與Bacillussp.GLl[31]中該蛋質(zhì)（登錄號：BAB62315）的氨基酸序列相似性均為23%，與ThermomicrobiaPRI-1686[7]中的RhaB（登錄號：AAR96047）相似性分別為22%和23%。而少動鞘氛醇單胞菌FP2001（Sphingornonaspaucimobilis）[21]中克隆的α-L-鼠李糖苷酶基因rhaM，共有3354個核苷酸，同源性比對發(fā)現(xiàn)它與其他屬于糖基水解酶（GH）家族78的α-L-鼠李糖苷酶基因沒有顯著的同源性。

國外關(guān)于真菌中α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆研究主要集中在來源于曲霉屬的α-L-鼠李糖苷酶目前，曲霉屬中的棘孢曲霉[19]、白曲霉[6]和構(gòu)巢曲霉[29]等已有克隆α-L-鼠李糖苷酶基因的研究報(bào)道。對目前已知的α-L-鼠李糖苷酶基因序列的分析發(fā)現(xiàn)，不同來源的α-L-鼠李糖苷酶基因序列差異較大。從棘孢曲霉[19]中克隆的兩種編碼α-L-鼠李糖苷酶的基因rhaA和rlmB的核苷酸序列幾乎沒有相似性，二者氨基酸序列相似性為60%，而它們與Clostridiumstercorarium中該酶的氨基酸序列[18]的一致性僅有11%。白曲霉中[6]α-L-鼠李糖苷酶的氨基酸序列與棘孢曲霉[19]中rhaA和rhaB的氨基酸序列相似性分別為75%和67%，與細(xì)菌[7、18、20、21]來源的α-L-鼠李糖苷酶的氨基酸序列一致性低于30%。有些真菌中存在著多個編碼α-L-鼠李糖苷酶的基因，如在棘孢曲霉[19]中分離到兩種α-L-鼠李糖苷酶，并克隆了它們對應(yīng)的基因：有研究者對構(gòu)巢曲霉[29]的基因組信息進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，至少存在8個可能具有α-L-鼠李糖苷酶功能的基因，而目前已克隆到rhaA和rhaE兩種：我國學(xué)者對α-L-鼠李糖苷酶基因克隆的研究相對較晚，主要是對犁頭霉屬[32-34]的α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆，已成功克隆出蘆丁-α-鼠李糖苷酶基因cDNA片段[32]和人參皂甙-α-鼠李糖苷酶基因[33、34]。近年有研究者從黑曲霉DLFCC-90菌株[26]中克隆到α-L-鼠李糖苷酶基因，該序列和α-淀粉酶的序列有較高的同源性，被歸類到糖苷水解家族GH13。此外，筆者巳經(jīng)從黑曲霉JMU-TS528（集美大學(xué)生物工程學(xué)院發(fā)酵工程研究室保藏的菌株）中克隆到α-L-鼠李糖苷酶基因，共編碼655個氨基酸，序列已上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫（登錄號：KC750908.1），經(jīng)同源性比對發(fā)現(xiàn)，它與白曲霉[6]（AB374267.1）中的α-L-鼠李糖苷酶基因的相似性高于90%。

雖然對微生物來源的α-L-鼠李糖苷酶基因克隆的報(bào)道越來越多，但對該基因在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控研究并不多。目前，僅指出α-L-鼠李糖苷酶基因的表達(dá)量受誘導(dǎo)碳源的影響，葡萄糖在轉(zhuǎn)錄水平抑制該基因的表達(dá)。因此，筆者認(rèn)為今后的研究可在克隆α-L-鼠李糖苷酶基因的基礎(chǔ)上進(jìn)一步鑒定與該基因跨膜轉(zhuǎn)移或翻譯直接相關(guān)的基因和蛋白，闡明葡萄糖抑制基因與α-L-鼠李糖苷酶基因相互作用的關(guān)系，從而明確碳源代謝調(diào)控α-L-鼠李糖苷酶基因的機(jī)制。

1.2α-L-鼠李糖苷酶基因的表達(dá)

通過α-L-鼠李糖苛酶水解柚皮苷生產(chǎn)普魯寧可以降低普魯寧的生產(chǎn)成本，但目前報(bào)道的α-L-鼠李糖苷酶大多數(shù)是以柚苷酶的形式存在，而在柚苷酶水解柚皮苷的過程中，普魯寧作為一種中間產(chǎn)物，會進(jìn)一步被分解成柚皮素，不能大量積累普魯寧。所以表達(dá)出只具α-L-鼠李糖苷酶活性的蛋白質(zhì)具有重要的應(yīng)用價值。近幾年有人對α-L-鼠李糖苷酶基因的表達(dá)進(jìn)行了研究，表2列出了具有代表性的微生物中α-L-鼠李糖苷酶基因表達(dá)出的具有活性的蛋白。

在研究α-L-鼠李糖苷酶基因表達(dá)時，大腸桿菌是研究者常用的表達(dá)宿主。雖然采用原核表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)真核微生物中的基因容易出現(xiàn)沒有活性的產(chǎn)物，目前已有不少研究者將微生物來源的α-L-鼠李糖苷酶基因，通過大腸桿菌表達(dá)出有活性的蛋白。如Jules[22]等將植物乳酸桿菌（Lactobacillus plantaram.）和嗜酸乳酸桿菌（Lactobacillus acidophilus）中克隆得到的鼠李糖苷酶基因ram1Lp、ram2Lp和ramALa，在E.coli中表達(dá)出活性蛋白Ram1Lp、Ram2Lphe RamALa，其中RamALa酶活最大，達(dá)到8.5mU/μg。不同的α-L-鼠李糖苷酶基因表達(dá)后產(chǎn)物的水解底物不同，乳酸片球菌[24]中編碼α-L-鼠李糖苷酶的基因ram和ram2，采用E.coli表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)出活性蛋白Ram和Ram2，但Ram只能有效地水解合成底物pNPR，而Ram2能特異性水解橙皮苷和蘆丁糖，兩種酶均不能水解柚皮苷，以pNPR為底物測得Ram和Ram2的酶活分別為8.7U/mg和0.036U/mg。植物乳酸桿菌NCC2451231中rhaB1和rhaB2基因表達(dá)的RhaBl和RhaB2能特異性地水解α-1，6糖苷鍵，但不能水解柚皮苷中的a-1，2糖苷鍵，RhaB1和RhaB2的最適底物是橙皮苷和蘆丁。有研究者發(fā)現(xiàn)有些細(xì)菌中編碼α-L-鼠李糖苷酶的基因表達(dá)后的產(chǎn)物是二聚體，例如Clostridium stercorarium[18]中編碼α-L-鼠李糖苷酶的基因ramA成功在（PWS1261）細(xì)胞中表達(dá)出的蛋白Ram78A包含兩個相同的亞基，Lactobacillusplantatum[23]中rhaB1和rhaB2基因采用E.coli表達(dá)出的α-L-鼠李糖苷酶以二聚體形式存在。

由于原核表達(dá)系統(tǒng)本身存在的一些缺陷，有時表達(dá)出的α-L-鼠李糖稈酶不具有活性[36]，所以有研究者采用真核表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)α-L-鼠李糖苷酶基因。目前對α-L-鼠李糖苷酶基因的真核表達(dá)的報(bào)道并不多，我國研究者已在酵母中成功表達(dá)了蘆丁鼠李糖苷酶基因[36]、人參皂苷-α-鼠李糖苷酶基因[33]以及黑曲霉中編碼α-L-鼠李糖苷酶的基因[26]。其中黑曲霉中的α-L-鼠李糖苷酶基因序列與α-淀粉酶基因序列相似性較高，通過酵母表達(dá)后的產(chǎn)物具有水解蘆丁、柚皮苷及橙皮苷的功能。米用酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)將Alternaria sp.L1[28]中rhal1編碼的α-L-鼠李糖苷酶固定在釀酒酵母細(xì)胞表面，該細(xì)胞能特異性地水解葡萄柚果汁中的柚皮苷達(dá)到果汁脫苦的作用。RhaL1固定在釀酒酵母細(xì)胞表面后，該酶在70℃環(huán)境中活性很高，在60℃處理2h后酶活達(dá)到處理前的95%，擴(kuò)大了該酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用范圍。目前對黑曲霉來源的α-L-鼠李糖苷酶基因的異源表達(dá)研究較少，筆者正在研究從黑曲霉jMU-TS528菌株中克隆到的α-L-鼠李糖苷酶基因的真核表達(dá)。國外的研究者報(bào)道了土曲霉[25]、構(gòu)巢曲霉[29]和棘孢曲霉[35]中編碼α-L-鼠李糖苷酶的基因在酵母中的成功表達(dá)。鼠李糖能夠誘導(dǎo)構(gòu)巢曲霉[29]中rhaE的表達(dá)，葡萄糖對該基因的表達(dá)產(chǎn)生抑制作用，rhaE在釀酒酵母中表達(dá)的產(chǎn)物，能夠水解底物pNPR，酶活達(dá)到1.4U/mL。通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)，在真菌來源的α-L-鼠李糖苷酶基因中，rhaE是首個與細(xì)菌中α-L-鼠李糖苷酶基因親緣關(guān)系比其他真菌中的α-L-鼠李糖苷酶基因更近的基因。土曲霉中α-L-鼠李糖苷酶基因采用酵母表達(dá)系統(tǒng)得到的產(chǎn)物和天然發(fā)酵的α-L-鼠李糖苷酶一樣，都可以水解蘆丁，重組酶酶活力高達(dá)9U/mL，比天然酶高出3倍，而且大大縮短了天然發(fā)酵獲取α-L-鼠李糖苷酶的時間，同時酶的產(chǎn)量比天然發(fā)酵的α-L-鼠李糖苷酶提高了4倍。盡管近年來，利用基因工程技術(shù)來構(gòu)建產(chǎn)α-L-鼠李糖苷酶的工程菌的研究逐漸增多，并取得了一定的進(jìn)展，但酶活水平始終未能達(dá)到工業(yè)化應(yīng)用的要求；目前國際上對α-L-鼠李糖苷酶分泌機(jī)制的研究也不多，因此如何進(jìn)一步提高該酶的胞外分泌水平，是該酶能否得到推廣應(yīng)用的關(guān)鍵：

2α-L-鼠李糖苷酶的結(jié)構(gòu)生物學(xué)

蛋內(nèi)質(zhì)需要形成一定的空間結(jié)構(gòu)才能有活性，近年來，雖然對α-L-鼠李糖苷酶基因克隆和表達(dá)的報(bào)道很多，佴對它的結(jié)構(gòu)方面的研究報(bào)道還比較少：2000年Zverlov成功克隆Clostridiumstercorarium[18]中編碼α-L-鼠李糖苷酶基因ramA后，首次通過圓二色譜法測得該酶二級結(jié)構(gòu)包含27%的α-螺旋和50%的β-折疊結(jié)構(gòu)。

CAZy（http：//www.cazy.org/）數(shù)據(jù)庫依據(jù)氨基酸序列相似性對糖苷水解酶類進(jìn)行了分類，微生物來源的α-L-鼠李糖苷酶包含在GH13、GH28、GH78和GH106糖苷水解酶家族中。目前，由PDB數(shù)據(jù)庫可以査詢到3個鼠李糖苷酶的晶體結(jié)構(gòu)，分別是來自Bacteroides thetaiutaomicronVPI-5482菌中的α-L-鼠李糖苷酶（PDBcode：3CIH）、Bacillus sp.GLI（PDBcode：20KX）和Streptoinycesavermitilis（PDBcode：3W5M、3W5N）菌株中α-L-鼠李糖苷酶。Cui[31]等于2007年解析了α-L-鼠李糖苷酶（RhaB）的晶體結(jié)構(gòu)，該酶由N、D1、D2、C和A5個結(jié)構(gòu)域組成；結(jié)構(gòu)域A包含其（α/α）6的桶狀結(jié)構(gòu)，Asp567、Glu572、Asp579和Glu841在該酶的催化作用和底物結(jié)合方面起到了關(guān)鍵作用，它們與鼠李糖相互作用，將其突變后，α-L-鼠李糖苷酶（RhaB）酶活大幅度降低；并認(rèn)為RhaB的空間結(jié)構(gòu)與Lactobacillusbrevis菌株的麥芽糖磷酸化酶MalP和Vibrioproteolyti-cus菌株的殼二糖磷酸化酶ChBP的結(jié)構(gòu)相似。來自Streptmnyces avermitilis[37]菌株的α-L-鼠李糖苷酶（SaRha78A）的晶體結(jié)構(gòu)有兩種，一種是原蛋白形式，另外一種是包含L-鼠李糖的晶體結(jié)構(gòu)，這兩種形式的結(jié)構(gòu)變化很小，RMSD值僅為0.21A，它們均由1個α和5個β結(jié)構(gòu)域組成，分別是N、D、E、F、A和C；結(jié)構(gòu)域A包含（α/α）6的桶狀結(jié)構(gòu)，與Cui[31]等報(bào)道的RhaB的催化域相似；SaRha78CM由13個α-螺旋組成，結(jié)構(gòu)域N包含10個β-折疊，結(jié)構(gòu)域D的11個β-折疊和E的13個β-折疊展現(xiàn)出一個β-卷心折疊，結(jié)構(gòu)域F由16個β-折疊組成兩個平行的β-折疊片；L-鼠李糖分別結(jié)合在結(jié)構(gòu)域A和D中，結(jié)構(gòu)域A中的L-鼠李糖結(jié)合在該酶的活性口袋的芳香基氨基酸TrP747和TrP640之間，與周圍的氨基酸形成12個氫鍵，結(jié)合后的船型構(gòu)象被認(rèn)為是GH78家族α-L-鼠李糖苷酶水解聚糖的過渡態(tài)構(gòu)象；結(jié)構(gòu)域D中的L-鼠李糖結(jié)合在β-折疊間，L-鼠李糖的O2、O3和O4原子分別和α-L-鼠李糖苷酶的Trp203、Asnl80和AsP179形成氫鍵，L-鼠李糖的O3、O4位置與一個正二價鈣離子形成配位共價鍵，同時鈣離子與該酶通過Aspl79、ASnl80、Asn228和Pro233氨基酸產(chǎn)生相互作用：Glu636和Glu895是在該α-L-鼠李糖苷酶的催化作用中的關(guān)鍵氨基酸，Glu636在催化過程中提供質(zhì)子，將其突變后，該酶酶活下降了40倍。通過對α-L-鼠李糖苷酶的晶體結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)，該酶有4個結(jié)構(gòu)域高度保守（RhaB：A、C、D2、D1；SaRha78A：A、C、E、F），GH78家族α-L-鼠李糖苷酶的催化域是一個（α/α）6的桶狀結(jié)構(gòu)，鼠李糖結(jié)合在該桶狀結(jié)構(gòu)的深溝里[31]。此外，在streptomyces awermitilis[37]菌株的α-L-鼠李糖苷酶中還發(fā)現(xiàn)了一個新的非催化碳水化合物結(jié)合域（non-catalyticcarbohydratebindingmodule，SaCBM67），SaCBM67位于結(jié)構(gòu)域D，通過鈣依賴的方式與L-鼠李糖結(jié)合，在用EDTA螯合鈣之后，SaCBM67失去與L-鼠李糖結(jié)合的功能。通過對179和180位置的氨基酸的突變實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，突變后該酶水解阿拉伯樹膠的活性大大降低，而對水解芳香基鼠李糖苷的活性影響不大，研究者認(rèn)為SaCBM67對該菌株中的α-L-鼠李糖苷酶酶活有著一定的影響。

3展望

微生物來源的α-L-鼠李糖苷酶具有很多潛在的應(yīng)用價值，近年來，對該酶的研究越來越受到學(xué)者的關(guān)注，從不同水平對α-L-鼠李糖苷酶進(jìn)行了研究。首先，在α-L-鼠李糖苷酶產(chǎn)酶菌株的篩選、發(fā)酵條件的優(yōu)化以及酶的分離純化和性質(zhì)研究日趨成熟，為產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)α-L-鼠李糖苷酶酶制劑及α-L-鼠李糖苷酶在食品醫(yī)藥加工工業(yè)中的應(yīng)用提供了一定的參考價值；其次，在分子生物學(xué)方面，對不同來源的α-L-鼠李糖苷酶基因進(jìn)行了克隆，并通過生物信息學(xué)分析、基因的表達(dá)以及晶體結(jié)構(gòu)的研究，使得對α-L-鼠李糖苷酶的了解進(jìn)一步深入。這些研究為構(gòu)建工程菌生產(chǎn)α-L-鼠李糖苷酶，提高α-L-鼠李糖苷酶的酶產(chǎn)量，降低目前生產(chǎn)α-L-鼠李糖苷酶的成本提供了理論指導(dǎo)。但目前對不同來源的α-L-鼠李糖苷酶的合成途徑、誘導(dǎo)機(jī)制和催化機(jī)制研究較少，因此，可進(jìn)一步通過利用分子生物學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和計(jì)算生物化學(xué)等技術(shù)，對α-L-鼠李糖苷酶進(jìn)行更深層次的研究。從分子水平上來研究α-L-鼠李糖苷酶的催化機(jī)理，結(jié)合定點(diǎn)突變等技術(shù)來提高α-L-鼠李糖苷酶的催化活性。同時，通過計(jì)算模擬等手段研究α-L-鼠李糖苷酶的底物結(jié)合特異性，擴(kuò)大α-L-鼠李糖苷酶在各生產(chǎn)工藝中的應(yīng)用范圍因?yàn)樽匀环蛛x純化的酶難以滿足苛刻的工業(yè)生產(chǎn)過程，所以酶的改造成為一種非常有效的替代途徑，依照α-L-鼠李糖苷酶的晶體結(jié)構(gòu)信息，加深對其結(jié)構(gòu)和功能的認(rèn)識，為α-L-鼠李糖苷酶定向進(jìn)化和改造奠定理論基礎(chǔ)：

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