馬競 劉飛 麥光興 梁卉 熊禮寬 馬端

(1. 深圳市寶安區(qū)婦幼保健院，廣東 深圳 518000；2. 復(fù)旦大學(xué)出生缺陷研究中心，上海 200032)

肌萎縮側(cè)索硬化家系致病基因SOD1的突變檢測

馬競1,2劉飛2麥光興1梁卉1熊禮寬1馬端2

(1. 深圳市寶安區(qū)婦幼保健院，廣東 深圳 518000；2. 復(fù)旦大學(xué)出生缺陷研究中心，上海 200032)

目的 檢測一個香港肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)家系的銅、鋅超氧化物歧化酶基因(Cu/Zn superoxide dismutase，SOD1)的突變位點(diǎn)。方法 對先證者SOD1的5個外顯子進(jìn)行PCR擴(kuò)增后進(jìn)行sanger測序。結(jié)果 在先證者的SOD1第5外顯子發(fā)現(xiàn)一個已知的致病性錯義突變c.(449 T>C)(p.Ile150Thr)。對家系中其他患者和未發(fā)病者進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)此突變在該家系中與疾病共分離。結(jié)論SOD1錯義突變c.(449T>C)(p.Ile150Thr)是該肌萎縮側(cè)索硬化家系患者發(fā)病的的原因。

肌萎縮側(cè)索硬化；SOD1；錯義突變

肌萎縮側(cè)索硬化(aroyotrophic lateral sclerosis, ALS)是最常見的運(yùn)動神經(jīng)元疾病，發(fā)病率約每年(1～3)/10萬，患病率為每年(4～8)/10萬[1]。病變主要累及大腦皮質(zhì)、腦干、脊髓前角等處的運(yùn)動神經(jīng)元，導(dǎo)致運(yùn)動神經(jīng)元細(xì)胞死亡。臨床上以上、下運(yùn)動神經(jīng)系統(tǒng)受累為主要表現(xiàn)，包括肌肉無力、肌肉萎縮、肌束震顫及肌張力增高、腱反射亢進(jìn)等，一般無感覺異常及大小便障礙。80%～90%的患者于發(fā)病后3～5年死亡，其病因與發(fā)病機(jī)制尚不明確[2]。

ALS可分為家族性肌萎縮側(cè)索硬化癥和散發(fā)性肌萎縮側(cè)索硬化癥。家族性ALS(FALS)主要有12個亞型：ALS1-ALS8、合并ALS的額顳葉癡呆綜合征、X性連鎖遺傳的ALS、關(guān)島型ALS-Parkinson-癡呆綜合征、進(jìn)行性下運(yùn)動神經(jīng)元疾病等。按照遺傳方式，F(xiàn)ALS可分為常染色體顯性遺傳(AD)和常染色體隱性遺傳(AR)，前者占絕大多數(shù)，后者罕見。按照起病年齡可分為兩種：成年型FALS和青少年型FALS，二者以25歲為界線。成年型FALS有很多種類，其中以ALS1最常見，呈AD 遺傳，致病基因?yàn)殂~/鋅超氧化物歧化酶1基因(Cu Zn superoxide dismutase，SOD1)[3]。

目前在FALS患者中發(fā)現(xiàn)了100余種SOD1的致病性突變，大多數(shù)為錯義突變，第1外顯子中第4個密碼子由丙氨酸(Ala)突變?yōu)槔i氨酸(Val)為最常見的突變，約占所有突變的40%～50%[4]。尚無資料顯示臨床表型的嚴(yán)重程度、進(jìn)展以及病程長短與突變類型之間有相關(guān)性。

本研究針對一個香港ALS家系進(jìn)行系統(tǒng)的臨床觀察和SOD1測序，以期確定SOD1某種突變類型與臨床表現(xiàn)之間的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 2012年在深圳寶區(qū)安婦幼保健院收集到1個香港ALS家系，家系圖見圖1。所有患者均由兩個副教授以上職稱的神經(jīng)科醫(yī)生收集病史并查體。每個患者均做肌電圖、頸椎磁共振和常規(guī)生化檢查。全部病例均按照國際診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷。家系中所有收集到的患者和正常人均簽署了知情同意書。該研究經(jīng)深圳寶安區(qū)婦幼保健醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

圖1 ALS-HK家系圖■：男性發(fā)??；●：女性發(fā)??；□：男性未發(fā)病；○：女性未發(fā)病/死亡；箭頭所示為先證者

1.2 研究方法

1.2.1 DNA的提取 采集外周靜脈血2 ml，2% EDTA 1∶9抗凝后-80 ℃分裝保存。取200 μl血樣，用QIAamp DNA Blood Mini kit (Qiagen, Germany)試劑盒進(jìn)行DNA抽提，雙蒸水洗脫。應(yīng)用Primer3軟件設(shè)計(jì)SOD1 5個外顯子的引物，引物序列見表1，包含全外顯子部分及其側(cè)翼100 bp序列堿基。

表1 SOD1 5個外顯子引物序列

1.2.2 PCR擴(kuò)增 反應(yīng)體積為25 μl，含25 ng的模板DNA，dNTP各200 μmol/L，2.5 mmol/L MgCl2，正向反向引物各0.5 μmol/L。Touch-down PCR條件：95 ℃預(yù)變性3分鐘；95 ℃變性30秒，68 ℃復(fù)性30秒，72 ℃延伸1分鐘，2個循環(huán)；95 ℃變性30秒，66 ℃復(fù)性30秒，72 ℃延伸1分鐘，2個循環(huán)；95 ℃變性30秒，64 ℃復(fù)性30秒，72 ℃延伸1分鐘，2個循環(huán)；95 ℃變性30秒，62 ℃復(fù)性30秒，72 ℃延伸分鐘，2個循環(huán)；95 ℃變性30秒，60 ℃復(fù)性30秒，72 ℃延伸1分鐘，2個循環(huán)；95 ℃變性30秒，58 ℃復(fù)性30秒，72 ℃延伸1分鐘，2個循環(huán)；95 ℃變性30秒，56 ℃復(fù)性30秒，72 ℃延伸1分鐘，2個循環(huán)；95 ℃變性30秒，55 ℃復(fù)性30秒，72 ℃延伸1分鐘，28個循環(huán)；72 ℃充分延伸10 分鐘；4 ℃保存。

1.2.3 Sanger法測序 SAP酶純化后，用ABI 3730XL 測序，Mutation Surveyor V4.0.5 (Softgenetics, USA)查看測序結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 患者臨床表現(xiàn) Ⅲ:1：先證者，43歲，2011年5月發(fā)病，主訴肌束震顫、手麻痹、四肢無力，夜間腳和小腿抽筋，難以入睡，腰痛。病情呈進(jìn)行性加重。2012年10月來本院就診。根據(jù)臨床變現(xiàn)，通過神經(jīng)電生理檢查和影像學(xué)等輔助檢查，最終診斷為肌萎縮側(cè)索硬化癥。

2.2 遺傳分析 由家系圖分析，3代中均有患者，疾病連續(xù)傳遞，推測為常染色體顯性遺傳(圖1)。對家系中的先證者Ⅲ:1進(jìn)行SOD1所有編碼區(qū)進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)cDNA的第449位T突變?yōu)镃(GeneBank No．：NM_000454.4)，導(dǎo)致SOD1蛋白第150位異亮氨酸密碼子ATT變?yōu)樘K氨酸密碼子ACT(圖2)。進(jìn)一步的測序表明該家系的所有患者都具有Ile150Thr突變，而家系中其他正常成員皆未發(fā)現(xiàn)這一SOD1突變。提示這一錯義突變是引起本家系成員患有肌萎縮側(cè)索硬化證的原因所在。HGMD數(shù)據(jù)庫顯示，1995年P(guān)ramatarova等發(fā)現(xiàn)該突變位點(diǎn)是引起肌萎縮側(cè)索硬化證的致病位點(diǎn)[5]。

圖2 SOD1測序圖A：家系中正常人SOD1測序圖；B：家系中先證者Ⅲ:1SOD1基因的測序圖

3 討 論

SOD1基因位于21q22，長11Kb，含5個外顯子，編碼的銅/鋅超氧化物歧化酶1(SOD1)含153個氨基酸，大小為32KD。SOD1屬于金屬酶，包含兩個方向相反的亞基，每個亞基均含有一個Cu2+和一個Zn2+[6]。SOD1是SOD家族中最重要的一種抗氧化酶，其基本功能是維持細(xì)胞內(nèi)活性氧內(nèi)穩(wěn)態(tài)的平衡，以達(dá)到解毒的目的。最初認(rèn)為SOD1突變體導(dǎo)致 ALS 的原因可能與酶失活有關(guān)，然而大量研究表明，SOD1突變體導(dǎo)致 ALS 的原因是突變產(chǎn)生的獲得性毒性新功能，機(jī)制尚不清楚[7]。

中國人群也廣泛存在SOD1基因突變。2006年，F(xiàn)ong GC等[7]在一個香港家系發(fā)現(xiàn)了SOD1基因突變p.Ile150Thr，此錯義突變影響了SOD1的亞基與銅離子的結(jié)合部位，從而導(dǎo)致了酶功能發(fā)生改變。2012年，Jinyu Wu等[3]在一個中國北方家系發(fā)現(xiàn)了SOD1基因突變 p.Cys146X，該突變造成SOD1發(fā)生截短突變，使重要的功能結(jié)構(gòu)域丟失，導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能異常，從而影響了清除自由基的能力。

HGMD數(shù)據(jù)庫最新數(shù)據(jù)顯示，迄今共發(fā)現(xiàn)SOD1基因致病突變180種，與家族性ALS發(fā)病有關(guān)的突變150種，其中包括錯義和無義突變126種，剪接位點(diǎn)突變6種，缺失突變14種，插入突變4種，多集中在歐美國家，在亞洲人群鮮有報(bào)道[8]。盡管SOD1幾乎表達(dá)于所有組織，但突變后的臨床表現(xiàn)僅累及運(yùn)動神經(jīng)元，且大多為成年起病。不同的SOD1突變導(dǎo)致的ALS臨床表型上也有差別，包括外顯率、紅細(xì)胞SOD1活性、起病年齡、生存期、組織病理學(xué)等。不同的SOD1突變對ALS病程也有影響，如A4V突變平均病程為1～2年，E100G突變?yōu)?.7年，而H46R和G37R為18～20年[9]。家族遺傳性ALS約占所有ALS的20%，家系成員多在40～50歲起病，發(fā)病后2～5年死亡。

我們對收集到的一個香港ALS家系進(jìn)行了SOD1基因所有5個外顯子測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)先證者及家系中所有患者均存在SOD1第5外顯子一個錯義突變c. (449 T>C) (p.Ile150Thr)，該突變在家系中與疾病共分離，因此可以判斷此錯義突變是該ALS家系的致病突變。

盡管p.Ile150Thr突變之前已經(jīng)被報(bào)道過，但每一個ALS家系SOD1致病位點(diǎn)的確認(rèn)，都會豐富SOD1的基因突變譜，從而為ALS的基因診斷提供更多數(shù)據(jù)。

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編輯：宋文穎

Objective To screen the mutation of copper, zinc superoxide dismutase (SOD1) gene in a Hong Kong amyotrophic lateral sclerosis (ALS) family. Method All the 5 exons ofSOD1 gene from the proband were amplified by PCR and then sequenced by Sanger’s method. Resuls A known pathogenic missense mutation c. (449 T>C) (p. Ile150Thr) in exon 5 ofSOD1was found in theproband and this mutationwas cosegregatewith the disease in this pedigree. Conclusions The missense mutation (449 T>C) (p. Ile150Thr) ofSOD1was the cause of the amyotrophic lateral sclerosis in the Hongkong family.

ALS;SOD1; missense mutation

10.13470/j.cnki.cjpd.2015.04.007

R714.55

A

2015-09-30)