李榮江 桂水清 黃振華 曾憲成

β-防御素-2是由哺乳動物上皮細(xì)胞產(chǎn)生，主要存在宿主-環(huán)境的界面位置，是宿主抵御各種侵襲的第一道化學(xué)屏障的重要組成成分，在機(jī)體免疫防御中發(fā)揮著極其重要的作用。β-防御素-2除對真菌、革蘭陰性菌、革蘭陽性菌、螺旋體、分枝桿菌及某些包膜病毒具有很強(qiáng)的殺傷活性外，還可抑制腫瘤細(xì)胞生長。本研究通過檢測人β-防御素-2在肝癌組織、癌旁組織和正常肝組織中的表達(dá)，以及其對肝癌細(xì)胞凋亡的影響，旨在探討人β-防御素-2在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集2011年8月-2014年10月手術(shù)切除的原發(fā)性肝癌標(biāo)本45例，其中男34例，女11例，年齡37~69歲，平均52.5歲，病理學(xué)檢查證實(shí)均為肝細(xì)胞肝癌，所有標(biāo)本術(shù)前均未進(jìn)行化療或放療；肝癌癌旁組織30例；活檢取正常肝組織（均為肝內(nèi)膽管結(jié)石肝葉切除肝組織）20例。所有標(biāo)本手術(shù)切除后立即放入液氮中-70 ℃冷凍保存，并切取少量組織用10%甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)4 μm進(jìn)行病理切片。

1.2 實(shí)驗材料 免疫組織化學(xué)試劑盒（Invitrogeng公司， 美 國 ），Trizol（Gibco公 司， 美 國 ），Primescript RT MasterMiX、PremixTaq Version2.0、實(shí)時聚合酶鏈反應(yīng)（realtime polymerase chain reaction，Real-Time PCR） SYBR Premix Ex Taq（Takara公司，日本），SP免疫組化試劑盒（北京中杉生物技術(shù)有限公司），dNTPS試劑盒（Promega公司）。HBD-2的上游引物5-CATGAGGGTCTTGTATCTCCTCT-3’及下游引物5-CCTCCTCAT-GGCTTTTTGCAGC-3’，均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 檢測HBD-2 mRNA的表達(dá) 根據(jù)說明書，采用Trizol法從所有肝癌組織、肝癌癌旁組織和正常肝組織標(biāo)本中提取mRNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；將cDNA用于PremixTaq Version2.0試劑做PCR分析表達(dá)情況。并將cDNA用于Real-Time PCR，定量檢測HBD-2 mRNA表達(dá)情況，具體的方法按照試劑盒說明進(jìn)行。Real-Time PCR工作條件：95 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行40個循環(huán)；75℃ 5 min。對HBD-2 mRNA以及內(nèi)參照β-actin分別進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR進(jìn)行擴(kuò)增，PCR定量計算 mRNA，待測樣品中的表達(dá)量用2-△Ct表示，2-△Ct=2-（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）。

1.3.2 檢測HBD-2蛋白的表達(dá) 采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶連接（SP）法，HBD-2一抗工作濃度為1∶50。實(shí)驗步驟依據(jù)試劑盒說明進(jìn)行。結(jié)果判斷：組織切片染色以胞漿中染成淡黃或棕黃色為陽性，根據(jù)陽性細(xì)胞百分率分為：陽性細(xì)胞數(shù)<5%為陰性，10%~50%為弱陽性，>50%為強(qiáng)陽性。

1.3.3 肝癌組織的細(xì)胞凋亡檢測 采用原位末端標(biāo)記法（TUNEL法），在200倍鏡下隨機(jī)選取10個視野，計算1000個腫瘤細(xì)胞中陽性染色細(xì)胞百分率，根據(jù)以下公式計算細(xì)胞凋亡表達(dá)指數(shù)（AI），凋亡指數(shù)（AI）=（凋亡小體+凋亡細(xì)胞數(shù)）/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對實(shí)驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗或秩和檢驗，計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HBD-2 mRNA檢測結(jié)果 PCR結(jié)果顯示，在肝癌組織、癌旁組織和正常肝組織中均可檢測到HBD-2 mRNA（圖1）。Real-Time PCR結(jié)果顯示，HBD-2 mRNA在肝癌組織、癌旁組織和正常肝組織中的表達(dá)均值分別為（1.469±0.519）、（3.742±0.394）和（3.835±0.256），三組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=336.87，P<0.01）。正常肝組織和癌旁組織中，HBD-2 mRNA的表達(dá)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.46）；相對于正常的肝組織和癌旁肝組織，在肝癌組織中HBD-2 mRNA的表達(dá)明顯下降，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.00）。

圖1 肝癌組織、癌旁組織和正常肝組織HBD-2 mRNA的表達(dá)注：1為Marker；2為肝癌組織；3為癌旁組織；4為正常肝組織

2.2 HBD-2蛋白表達(dá)檢測結(jié)果 HBD-2蛋白在正常肝組織及肝細(xì)胞癌組織中可呈陰性或陽性表達(dá)（圖2）；HBD-2蛋白在肝癌組織、癌旁組織和正常肝組織中的表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1。

圖2 HBD-2在肝癌組織及正常肝組織中的表達(dá)

表1 HBD-2蛋白在肝癌組織、癌旁組織和正常肝組織中的表達(dá)

2.3 不同肝癌組凋亡指數(shù)（AI）比較 HBD-2蛋白陽性表達(dá)肝癌組20例的凋亡指數(shù)為（3.279±0.309）%，HBD-2蛋白陰性表達(dá)肝癌組25例的凋亡指數(shù)為（2.072±0.289）%，兩組凋亡指數(shù)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=13.501，P=0.000）。

3 討論

人體的防御素主要可分為兩大類，即α-防御素和β-防御素，HBD-2屬β-防御素家族成員。防御素在天然免疫功能中扮演多種作用，據(jù)報道人類的HBD具有抗腫瘤的作用[1]。HBD-2是由41個氨基酸殘基陽離子構(gòu)成的短肽，富含半胱氨酸。含6個氨基酸殘基構(gòu)成的3個二硫鍵結(jié)構(gòu)及3束β片層結(jié)構(gòu)。HBD-2表面有較多正電荷，其空間結(jié)構(gòu)可分為帶電區(qū)和疏水區(qū)。HBD-2獨(dú)特結(jié)構(gòu)使其既有親水性又有親脂性，可在多種微生物細(xì)胞膜上形成孔道，破壞微生物細(xì)胞膜，文獻(xiàn)[2]指出HBD-2可能參與了尖銳濕疣的免疫反應(yīng)過程并發(fā)揮了一定的作用。HBD-2是天然免疫的重要組成成分，存在于全身各種組織細(xì)胞中如皮膚、牙齦、扁桃體、肺、胃、小腸、結(jié)腸、膀胱、血管、骨髓等[3-5]。另外，在一些腫瘤組織也存在，如口腔鱗狀細(xì)胞癌、食管癌、前列腺癌等[6]。

目前已在多種腫瘤組織中如泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤、呼吸系統(tǒng)腫瘤、消化系統(tǒng)腫瘤等發(fā)現(xiàn)防御素[7-8]。體內(nèi)防御素水平及其發(fā)生變異可能與某些腫瘤發(fā)生、治療及預(yù)后相關(guān)[9-11]。低濃度的防御素不影響正常細(xì)胞，但有明顯抗腫瘤作用，其抗腫瘤作用可能與細(xì)胞骨架有關(guān)[12]。細(xì)胞膜可能是防御素作用的靶之一，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生癌變后，細(xì)胞膜表面的負(fù)電荷增加，利于帶正電荷的防御素與腫瘤細(xì)胞膜結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞骨架改變。研究發(fā)現(xiàn)，鼠β-防御素可增加腫瘤抗原的可識別性，在腫瘤體液免疫和細(xì)胞免疫中發(fā)揮作用[13]。此外，β-防御素可以破壞腫瘤細(xì)胞的骨架，防止紡錘絲形成及阻止細(xì)胞的有絲分裂，從而抑制腫瘤的生長，還可以破壞腫瘤細(xì)胞的線粒體引起腫瘤細(xì)胞死亡或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[14]。另外，β-防御素可通過體液免疫方面抵抗癌細(xì)胞的入侵[15]。

本研究結(jié)果顯示相對于正常肝組織及癌旁組織，肝細(xì)胞癌組織HBD-2 mRNA的表達(dá)量明顯下降，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），但正常肝組織與癌旁組織HBD-2 mRNA的表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；免疫組化結(jié)果顯示，肝細(xì)胞癌HBD-2蛋白的表達(dá)明顯低于正常肝組織及癌旁組織；HBD-2蛋白表達(dá)陽性的肝癌組織細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯高于HBD-2蛋白表達(dá)陰性的肝癌組織，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。以上結(jié)果表明，在肝細(xì)胞癌的發(fā)生過程中，HBD-2 mRNA的表達(dá)量的下降使HBD-2蛋白表達(dá)下調(diào)，從而導(dǎo)致肝癌細(xì)胞凋亡減少，提示HBD-2可能在肝癌細(xì)胞的發(fā)生中有一定作用，而且可能是通過影響細(xì)胞凋亡起作用，HBD-2在肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中的作用需要進(jìn)一步的研究。

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