趙國(guó)群,關(guān)軍鋒

(1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,河北石家莊 050018;2.河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳生理研究所,河北石家莊 050051)

高產(chǎn)γ-氨基丁酸釀酒酵母的篩選及其在梨酒釀制中的應(yīng)用

趙國(guó)群1,關(guān)軍鋒2,*

(1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,河北石家莊 050018;2.河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳生理研究所,河北石家莊 050051)

從梨果實(shí)表面篩得到8株既能高產(chǎn)γ-氨基丁酸(GABA),又有較強(qiáng)產(chǎn)酒精能力的酵母菌株,其中菌株KS45產(chǎn)生GABA能力最強(qiáng),達(dá)到了1.146 g/L。經(jīng)鑒定,菌株KS45為釀酒酵母。當(dāng)在含有梨汁的發(fā)酵培養(yǎng)基中靜置發(fā)酵時(shí),釀酒酵母KS45高產(chǎn)GABA,這表明梨汁中可能含有刺激酵母合成GABA的物質(zhì)。將釀酒酵母KS45接種到鴨梨汁中,30 ℃下靜置發(fā)酵10 d,獲得了富含GABA 的梨酒,其中GABA含量達(dá)到了2.427 g/L。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在富含GABA梨酒發(fā)酵過程中,GABA的產(chǎn)生伴隨著酒精的消耗,呈現(xiàn)耦合關(guān)系,其機(jī)理尚不清楚。隨著發(fā)酵溫度的升高,梨酒的最終酒精度顯著降低。裝液量對(duì)GABA產(chǎn)生有很大影響。隨著裝液量的增加,梨酒中GABA含量急劇下降,這可能與氧氣供給不足有關(guān)。

γ-氨基丁酸,釀酒酵母,梨酒,篩選

γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric Acid,GABA)是一種非蛋白質(zhì)的天然氨基酸,廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物中[1]。GABA具有抗衰老、降血壓、改善肝功能、調(diào)節(jié)激素分泌、改善睡眠、增強(qiáng)記憶力、防治肥胖等重要生理功能[2-3]。GABA主要是通過谷氨酸脫羧酶催化谷氨酸脫羧轉(zhuǎn)化而成的[4]。乳酸菌[5-7]、霉菌[8-9]、酵母菌[10-11]以及其他微生物中均含有這種酶,因此,可通過提取谷氨酸脫羧酶或通過微生物發(fā)酵來生產(chǎn)GABA。隨著人們生活水平的提高和保健意識(shí)的增強(qiáng),富含GABA的功能性食品已經(jīng)成為研究和開發(fā)的熱點(diǎn)。

目前,采用微生物發(fā)酵已經(jīng)開發(fā)的富含GABA食品有發(fā)酵乳[12]、清酒[13]、飲料酒[14]、米醋[15]等,但富含GABA 的果酒尚未見報(bào)道。梨果肉質(zhì)細(xì)脆,含糖量高,香甜爽口,營(yíng)養(yǎng)豐富,含有各種蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)和多種維生素等,是釀造果酒的良好原料[16]。本研究從梨果實(shí)表面篩選出了既能高產(chǎn)GABA,又仍有較強(qiáng)產(chǎn)酒精能力的釀酒酵母,并用于梨酒的釀制,獲得了富含GABA的梨酒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鴨梨、雪梨 河北省趙縣產(chǎn);溴甲酚綠 天津市百世化工有限公司,分析純;琥珀酸 天津市博迪化工有限公司,分析純;50%乙醛酸溶液 上海源葉生物科技有限公司。

SP-722E型分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;SPX-250B-II型生化培養(yǎng)箱 上海賀德實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;安捷倫6820高效氣相色譜儀 美國(guó)惠普公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基 YPD培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L,蛋白胨20 g/L,酵母浸粉10 g/L,瓊脂20 g/L,pH自然;GABA篩選培養(yǎng)基[17]：葡萄糖20 g/L,蛋白胨20 g/L,酵母粉10 g/L,瓊脂20 g/L,溴甲酚綠0.1 g/L,琥珀酸2 g/L,乙醛酸2 g/L,pH自然;WL瓊脂培養(yǎng)基[18]酵母浸粉5 g/L,胰蛋白胨5 g/L,葡萄糖50 g/L,瓊脂 20 g/L,磷酸二氫鉀0.55 g/L,氯化鉀0.425 g/L,氯化鈣0.125 g/L,氯化鐵0.0025 g/L,硫酸鎂0.125 g/L,硫酸錳0.0025 g/L,溴甲酚綠0.022 g/L,pH為6.5;發(fā)酵培養(yǎng)基[19]：蔗糖 200 g/L,酵母浸粉10 g/L,硫酸銨 1.0 g/L,磷酸二氫鉀1.0 g/L,硫酸鎂1.0 g/L pH自然;梨汁發(fā)酵培養(yǎng)基：50%鴨梨汁+發(fā)酵培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)所用的鴨梨汁中GABA含量為0.76～1.03 g/L。

1.2.2 酵母的富集培養(yǎng) 選擇糖分含量高、香氣濃、充分成熟、無霉?fàn)€果的梨果,去核、不去皮,用螺桿式榨汁機(jī)榨汁。分別取100 mL果汁于250 mL錐形瓶中,并加入適量果渣。加入5%亞硫酸鈉溶液,使得果汁SO2濃度為50 mg/L;用8層干凈的紗布封口,放置于30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),直到有酒味產(chǎn)生為止。

1.2.3 高產(chǎn)GABA釀酒酵母的初篩 將發(fā)酵后的梨汁進(jìn)行適當(dāng)稀釋后涂布到GABA篩選培養(yǎng)基上,于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。觀察菌落顏色和形態(tài),挑取具有酵母形態(tài)、綠色較深的菌株進(jìn)行分離純化。純化菌株保藏于試管斜面,并保存于4 ℃冰箱中。將初篩出的高產(chǎn)GABA菌株,接種YPD液體培養(yǎng)基,活化24 h后接種到WL瓊脂培養(yǎng)基,30 ℃培養(yǎng)3 d后觀察,挑選出淺黃色-綠色、表面光滑、球形突起的、不透明的菌株。

1.2.4 高產(chǎn)GABA釀酒酵母的復(fù)篩 將初篩得到的高產(chǎn)GABA菌株,分別接種到100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基、梨汁發(fā)酵培養(yǎng)基中,30 ℃靜置發(fā)酵6 d。待發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵液中GABA的含量和酒精含量。

1.2.5 高產(chǎn)GABA釀酒酵母的鑒定 將復(fù)篩所得到GABA產(chǎn)量最高的酵母菌株KS45,進(jìn)行賴氨酸培養(yǎng)基鑒定[20],并送交上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行分子鑒定。

1.2.6 富含GABA梨酒的釀制

1.2.6.1 釀酒酵母種子液的制備 在100 mL YPD液體培養(yǎng)基中,分別接入2～3環(huán)斜面保藏的釀酒酵母KS45,30 ℃、180 r/min 搖床培養(yǎng)2 d。

1.2.6.2 梨汁的制備 選擇新鮮無病的成熟鴨梨,清水洗凈、去核后,用螺桿式榨汁機(jī)榨汁,并用蔗糖調(diào)整其糖度為20%。

1.2.6.3 發(fā)酵時(shí)間的影響 將150 mL梨汁加入250 mL的三角瓶中,并按10%接種量接入種子液,用8層干凈的紗布封口,在30 ℃下分別靜置發(fā)酵4、6、8、10、12 d。

1.2.6.4 發(fā)酵溫度的影響 按10%接種量向150 mL梨汁中接入種子液,分別在15、20、25、30、35 ℃下恒溫靜置發(fā)酵10 d。

1.2.6.5 裝液量的影響 將制備好的梨汁裝入500 mL三角瓶中,裝液量分別控制為100、200、300、400 mL,接入10%種子液,分別在30 ℃下靜置發(fā)酵10 d。

1.3 分析方法

1.3.1 GABA測(cè)定 采用Berthelot比色法[21]。每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置三個(gè)平行實(shí)驗(yàn),測(cè)定GABA,取其平均值。

1.3.2 酒精度測(cè)定 梨酒蒸餾后,以正丁醇為內(nèi)標(biāo)物,采用氣相色譜儀測(cè)定其乙醇含量。每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置三個(gè)平行實(shí)驗(yàn),測(cè)定酒精度,取其平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)GABA酸釀酒酵母的篩選

2.1.1 高產(chǎn)GABA釀酒酵母的初篩 黃麗華等[17]在篩選高產(chǎn)GABA的酵母菌株時(shí),使用了一種含有溴甲酚綠、琥珀酸和乙醛酸的篩選培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基對(duì)GABA具有顯色專一性,菌落綠色越深,表明該菌株產(chǎn)生的GABA越多,從而可快速地初篩出GABA高產(chǎn)菌株。課題組曾采用檸檬酸、草酸、乳酸、鹽酸、硫酸、磷酸驗(yàn)證過其準(zhǔn)確性,發(fā)現(xiàn)這些有機(jī)/有機(jī)酸在該篩選培養(yǎng)基上均不顯色,只有GABA顯示出黃綠色,這表明該篩選培養(yǎng)基對(duì)GABA具有良好的選擇性和靈敏性。

將自然發(fā)酵后的梨汁進(jìn)行適當(dāng)稀釋后涂布到GABA篩選培養(yǎng)基上,30 ℃培養(yǎng)3 d,其中一個(gè)平板的培養(yǎng)結(jié)果見圖1。觀察菌落顏色和形態(tài),挑取出具有酵母形態(tài)、綠色較深的菌株進(jìn)行分離純化,獲得了83株高產(chǎn)GABA酵母菌株。WL培養(yǎng)基對(duì)釀酒酵母的篩選可信度達(dá)到100%[18]。將上述獲得83株酵母菌株,活化后接種到WL瓊脂培養(yǎng)基,挑選出了67株呈淺黃色-綠色菌株,初步判定其為釀酒酵母。

圖1 不同酵母菌株在GABA篩選培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.1 The colonies of different yeast strains on the GABA selecting medium

2.1.2 高產(chǎn)GABA釀酒酵母的復(fù)篩 本研究的目的是獲得富含GABA的梨酒,因此,復(fù)篩時(shí)采用了靜置發(fā)酵。將初篩得到的高產(chǎn)GABA酵母菌株分別接種到發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行靜置發(fā)酵,發(fā)酵結(jié)束后,檢測(cè)其中的GABA和酒精含量。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),所有酵母菌株均產(chǎn)生不同濃度的酒精,但均檢測(cè)不出GABA。分析其原因很可能是由于靜置發(fā)酵時(shí)氧氣供給太低造成的。與之相反,當(dāng)將初篩得到的高產(chǎn)GABA酵母菌株在梨汁發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行靜置發(fā)酵時(shí),發(fā)現(xiàn)所有酵母菌株在產(chǎn)生酒精的同時(shí),均可檢測(cè)到有不同濃度的GABA產(chǎn)生,這說明梨汁中可能含有刺激GABA合成物質(zhì)。這些刺激GABA合成物質(zhì)使得酵母菌能夠在厭氧條件合成了較多GABA。在梨汁發(fā)酵培養(yǎng)基上經(jīng)過復(fù)篩,共獲得了8株高產(chǎn)GABA釀酒酵母(表1),其中菌株KS45產(chǎn)生的GABA最多,達(dá)到了1.146 g/L。從表1中還可以發(fā)現(xiàn),普通釀酒用的安琪釀酒酵母可以產(chǎn)生酒精,但不產(chǎn)生GABA。菌株KS45在高產(chǎn)GABA的同時(shí),仍具有良好的產(chǎn)生酒精的能力,其發(fā)酵酒精度達(dá)到8%,因此,本研究采用菌株KS45來釀制富含GABA梨酒。菌株KS45的菌落形態(tài)特征為:乳白色,球形突起,表面光滑,不透明,奶油狀(圖2)。

表1 高產(chǎn)GABA酵母菌株的復(fù)篩結(jié)果

注:表1中GABA產(chǎn)量為酵母菌株產(chǎn)生的凈GABA值。

圖2 酵母菌株KS45的菌落形態(tài)Fig.2 The colonies of yeast strains KS45

2.1.3 高產(chǎn)GABA釀酒酵母的鑒定 釀酒酵母不能利用賴氨酸作為氮源,因而在賴氨酸培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。將復(fù)篩所得到GABA產(chǎn)量最高的酵母菌株KS45,接種到賴氨酸培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)菌株KS45不能在賴氨酸培養(yǎng)基形成菌落,因而基本上可確定菌株KS45為釀酒酵母。為了更加準(zhǔn)確和可靠,將菌株KS45送交上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行了分子鑒定。提取KS45菌株的基因組DNA,用通用引物NS1和NS6進(jìn)行擴(kuò)增可知18S rDNA 的PCR長(zhǎng)度約為1300 bp。經(jīng)測(cè)序,菌株KS45的18S rDNA核苷酸序列大小為1335 bp,與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)序列比對(duì)結(jié)果顯示:菌株KS45的18S rDNA核苷酸序列與釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)18S rDNA(GeneBank登記號(hào)為EU011664.1)核苷酸序列一致性達(dá)到99%,因此將菌株KS45鑒定為釀酒酵母。

2.2 富含GABA梨酒的釀制

2.2.1 發(fā)酵時(shí)間的影響 將釀酒酵母KS45接種到梨汁中進(jìn)行酒精發(fā)酵,定時(shí)取樣監(jiān)測(cè)梨汁中GABA含量和酒精度的變化,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。從圖3中可以看出,在發(fā)酵的前4 d,隨著酵母菌體的生長(zhǎng)和發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),酒精濃度急劇上升,并在第4 d達(dá)到最高值,9.5%;而與此同時(shí),梨酒中GABA含量卻逐漸下降,在第4 d達(dá)到最低值,0.88 g/L。在葡萄酒釀造過程中也觀察到類似的現(xiàn)象,可能是GABA用作氮源而被菌體吸收利用[22]。4 d發(fā)酵以后,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),發(fā)酵液中酒精度呈近似線性地下降,而GABA含量卻呈近似線性地上升,直至發(fā)酵結(jié)束。這個(gè)結(jié)果表明GABA產(chǎn)生的同時(shí)伴隨著酒精的消耗,呈現(xiàn)耦合關(guān)系,且為負(fù)相關(guān)。在我們的另外實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過程中酒精度的降低并不是由于醋酸菌的醋酸發(fā)酵而造成酒精的減少(數(shù)據(jù)未顯示)。那么,釀酒酵母KS45在合成GABA的同時(shí),為什么消耗乙醇,其機(jī)理尚不清楚。參考葡萄酒對(duì)酒精度(≥7.0%)要求,因此,富含GABA梨酒的適宜發(fā)酵時(shí)間為10 d。

圖3 發(fā)酵時(shí)間的影響Fig.3 The effect of fermentation time

2.2.2 發(fā)酵溫度的影響 溫度是影響釀酒酵母生長(zhǎng)和酒精發(fā)酵的一個(gè)重要因素。如圖4所示,當(dāng)發(fā)酵溫度較低(15～25 ℃)時(shí),菌體產(chǎn)生GABA的量很低。發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí),菌體產(chǎn)生GABA的能力最強(qiáng),發(fā)酵液中GABA濃度達(dá)到最大值,2.427 g/L。當(dāng)發(fā)酵溫度升高至35 ℃,菌體產(chǎn)生GABA量顯著下降。胡超等[23]也發(fā)現(xiàn)釀酒酵母產(chǎn)生GABA的最適溫度為30 ℃。對(duì)于普通梨酒及其他果酒而言,一般是較高發(fā)酵溫度下所獲得的酒精度要高于較低發(fā)酵溫度,或者發(fā)酵溫度對(duì)最終酒精度影響不大[24-25]。然而,從圖4中卻發(fā)現(xiàn),隨著發(fā)酵溫度的升高,梨酒中酒精度呈顯著下降趨勢(shì)。造成這種現(xiàn)象的部分原因可能是:GABA的產(chǎn)生與酒精的消耗呈負(fù)相關(guān)(見2.2.1);在較低的發(fā)酵溫度下,菌株KS45產(chǎn)生的GABA較少,酒精消耗也較少,因而使得梨酒的最終酒精度較高。發(fā)酵溫度為35 ℃時(shí),GABA和酒精度均顯著降低,可能是高溫(35 ℃)既抑制乙醇的產(chǎn)生,也抑制GABA的合成。

圖4 發(fā)酵溫度的影響Fig.4 The effect of fermentation temperature

2.2.3 裝液量的影響 裝液量的多少直接影響釀酒酵母酒精發(fā)酵過程中氧氣的供給。從圖5中可以看出,隨著裝液量的增加,梨酒的酒精度逐漸上升,而梨酒中GABA含量卻急劇下降。關(guān)于GABA生物合成的機(jī)理研究基本上都集中于乳酸菌,而對(duì)釀酒酵母合成GABA的機(jī)理國(guó)內(nèi)外都極少研究。關(guān)于釀酒酵母合成GABA是否需氧,國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)均沒有明確說明。蔣冬花等[11]、胡超等[23]在搖床發(fā)酵研究釀酒酵母產(chǎn)GABA發(fā)酵條件時(shí),發(fā)現(xiàn)高搖床轉(zhuǎn)速產(chǎn)生的GABA高于低搖床轉(zhuǎn)速。結(jié)合本研究結(jié)果,可初步推斷釀酒酵母生物合成GABA是一個(gè)需氧過程。當(dāng)梨汁裝液量較高時(shí),由于氧氣供給的不足,造成釀酒酵母產(chǎn)生較少的GABA。

圖5 裝液量的影響Fig.5 The effect of broth volume in the fermentor

3 結(jié)論

本研究從梨果實(shí)表面篩選出了8株既能高產(chǎn)GABA,又有較強(qiáng)產(chǎn)酒精能力的酵母菌株,其中菌株KS45產(chǎn)生GABA能力最強(qiáng),達(dá)到了1.146 g/L。經(jīng)鑒定,菌株KS45為釀酒酵母。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),只有在含有梨汁的發(fā)酵培養(yǎng)基中,篩選出的酵母菌才能在靜置發(fā)酵時(shí)高產(chǎn)GABA,這表明梨汁中可能含有刺激釀酒酵母合成GABA的物質(zhì)。將釀酒酵母KS45按10%接種量接入到鴨梨汁中,30 ℃下靜置發(fā)酵10 d,獲得了富含GABA 的梨酒,其酒精度為7.0%,GABA含量達(dá)到了2.427 g/L,比發(fā)酵前(梨汁)增加了2倍多。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),在富含GABA梨酒發(fā)酵過程中,GABA產(chǎn)生的同時(shí)伴隨著酒精的消耗,呈現(xiàn)耦合關(guān)系,其機(jī)理尚不清楚。隨著發(fā)酵溫度的升高,梨酒的最終酒精度顯著下降。裝液量對(duì)GABA產(chǎn)生有很大影響。隨著裝液量的增加,梨酒中GABA含量急劇下降,這可能與氧氣供給不足有關(guān)。

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Screening of highγ-aminobutyric acid-yield yeast strains ofSaccharomycesCerevisiaeand application in brewing of pear wine

ZHAO Guo-qun1,GUAN Jun-feng2,*

(1.College of Bioscience and Bioengineering,Hebei University of Science and Technology,Shijiazhuang 050018,China;2.Institute of Genetics and Physiology,Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences,Shijiazhuang 050051,China)

Eight yeast strains which could produce high yield ofγ-aminobutyric acid(GABA)and ethanol were screened from the surface of pear fruits,among which,yeast strain KS45 had the highest capability of GABA production(1.146 g/L). Strain KS45 was then identified asSaccharomycescerevisiae. WhenS.cerevisiaeKS45 was cultivated in pear juice-contained culture media,it could produce high yield of GABA in anaerobic condition,which indicated that pear juice might had compounds that could stimulateS.cerevisiaeKS45 to produce GABA. AfterS.cerevisiaeKS45 was inoculated in Ya pear juice and fermented in a incubator at 30 ℃ for 10 d,pear wine with rich GABA(2.427 g/L)was obtained. It was found that GABA production was coupled with ethanol consumption during the brewing of pear wine,and its mechanism was not clear. The final ethanol concentration of pear wine decreased significantly as the fermentation temperature increased. The volume of culture medium in the fermentor could affect the production of GABA. With increasing of the volume of culture medium,GABA concentration of the pear wine rapidly decreased,and the possible reason was that supply of oxygen was not sufficient.

γ-aminobutyric acid;Saccharomycescerevisiae;pear wine;screening

2015-02-09

趙國(guó)群(1963-),男,博士,教授,研究方向:食品生物技術(shù),E-mail:gqzhao18@126.com。

*通訊作者:關(guān)軍鋒(1966-),男,博士,研究員,研究方向:果品貯藏加工,E-mail:junfeng@126.com。

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)[梨]產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(cars-29)。

TS255.47

A

1002-0306(2015)23-0173-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.027