謝 茹,葉盛英,郭德亮,楊權(quán)華

(1.廣東省儲(chǔ)備糧管理總公司東莞直屬庫(kù),廣東東莞 523145;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510642)

不同濃度[Bmim][PF6]離子液體處理對(duì)啤酒酵母活性的影響

謝 茹1,葉盛英2,郭德亮2,楊權(quán)華2

(1.廣東省儲(chǔ)備糧管理總公司東莞直屬庫(kù),廣東東莞 523145;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510642)

為了研究離子液體在全細(xì)胞生物催化中的作用,有必要考察離子液體對(duì)微生物活性的影響。本文以啤酒酵母為實(shí)驗(yàn)菌種,通過測(cè)定酵母菌的生長(zhǎng)量、糖代謝效果、生理活性,觀察菌落狀態(tài)、菌體細(xì)胞壁等方法,探討不同濃度[Bmim][PF6]離子液體處理對(duì)酵母活性的影響。結(jié)果表明:[Bmim][PF6]離子液體對(duì)酵母菌的生長(zhǎng)有抑制作用,但離子液體對(duì)酵母菌的致死效果微弱,與超臨界CO2、高濃度苯甲醇處理會(huì)導(dǎo)致絕大多數(shù)酵母菌死亡的效果截然不同。

不同濃度,離子液體,酵母菌,菌體活性

生物催化是催化科學(xué)的前沿之一,具有反應(yīng)條件溫和、無(wú)環(huán)境污染、速度快、高選擇性等優(yōu)點(diǎn)。生物催化的傳統(tǒng)介質(zhì)為有機(jī)溶劑,但有機(jī)溶劑會(huì)對(duì)生物產(chǎn)生毒性影響,也會(huì)污染環(huán)境。多項(xiàng)研究表明,離子液體可以作為生物催化反應(yīng)介質(zhì),并具有有機(jī)溶劑所沒有的優(yōu)點(diǎn)。某些酶能在離子液體中保持活性,甚至提高穩(wěn)定性、反應(yīng)選擇性和產(chǎn)物產(chǎn)率。由此可見,離子液體在生物催化反應(yīng)方面具有很大潛力[14-18]。一些催化反應(yīng)需要多酶體系參與,對(duì)于這類反應(yīng),直接加入菌體更便捷。因此,研究菌體在離子液體中的活性顯得尤為重要。本文正是從宏觀和微觀的角度,全面探討離子液體處理對(duì)酵母菌活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae) 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供;1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽(1-butyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate,[Bmim][PF6])離子液體(97%) 上海鎂鍶鋇實(shí)業(yè)有限公司化學(xué)事業(yè)部提供;苯甲醇(AR) 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;CO2氣體 廣州市卓正氣體有限公司。

SFE-1L超臨界CO2裝置 廣州漢維冷氣機(jī)電工程有限公司;SW-CJ-IFD超凈工作臺(tái) 江蘇安泰空氣技術(shù)有限公司;HZS-H水浴振蕩器 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;LRH-250生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;Leica UGT超薄切片機(jī) 德國(guó)Leica儀器有限公司;TECNAI 12分析型透射電子顯微鏡 荷蘭FEI電子光學(xué)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酵母菌液的制備 取酵母菌菌種接入若干支裝有5 mL固體斜面培養(yǎng)基的試管,于30 ℃靜置培養(yǎng)48 h進(jìn)行活化。挑取3接種環(huán)已活化的斜面菌種接入裝有50 mL液體培養(yǎng)基的錐形瓶,于30 ℃ 180 r/min振蕩24 h擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.2 低濃度離子液體長(zhǎng)時(shí)處理 一次培養(yǎng) 取擴(kuò)大培養(yǎng)后的液體菌種1 mL分別接入6個(gè)裝有28 mL液體培養(yǎng)基的錐形瓶,加入離子液體和無(wú)菌水,使培養(yǎng)基中離子液體濃度為0.0%、0.3%,0.5%,0.7%,0.9%,1.1%,于30 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng),空白試樣培養(yǎng)11 h,其余培養(yǎng)33 h。二次培養(yǎng):從一次培養(yǎng)完畢的菌液中取1 mL加入含29 mL液體培養(yǎng)基的錐形瓶,于30 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)26 h。

1.2.3 高濃度離子液體、苯甲醇短時(shí)處理 取擴(kuò)大培養(yǎng)后的液體菌種1 mL分別接入4個(gè)裝有24 mL液體培養(yǎng)基的錐形瓶,于30 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。培養(yǎng)完畢后把培養(yǎng)液各自轉(zhuǎn)入無(wú)菌離心管,以3000 r/min 3 min離心分離,去上清液,加入離子液體和31 g/L的磷酸氫二鈉緩沖液,使溶液中離子液體濃度為0%、20%、40%,苯甲醇濃度為20%?；靹?各自轉(zhuǎn)入已滅菌的4個(gè)錐形瓶,于30 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)2.5 h。處理后,把菌液再次轉(zhuǎn)入無(wú)菌離心管,離心分離,移出全部離子液體和苯甲醇,加入緩沖液使每根離心管的液量為25 mL,混勻。

1.2.4 超臨界CO2短時(shí)處理 取擴(kuò)大培養(yǎng)后的液體菌種1 mL接入裝有24 mL液體培養(yǎng)基的錐形瓶,于30 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。培養(yǎng)完畢后把培養(yǎng)液各自轉(zhuǎn)入無(wú)菌離心管,離心分離,去上清液,加入緩沖液10 mL,搖勻,于14 MPa超臨界CO2,33 ℃下處理1.5 h。

1.2.5 高濃度離子液體長(zhǎng)時(shí)處理 取擴(kuò)大培養(yǎng)后的液體菌液1 mL接入1個(gè)裝有24 mL液體培養(yǎng)基的錐形瓶,于30 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。培養(yǎng)完畢后把培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入無(wú)菌離心管,離心分離,去上清液,加入1.5 mL 97%離子液體和13.5 mL的緩沖液,混勻,轉(zhuǎn)入已滅菌的錐形瓶,于30 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)2.5 h。處理完后,把菌液轉(zhuǎn)入無(wú)菌試管,靜止分層,吸出全部緩沖液,試管于常溫靜置3個(gè)月。

1.2.6 分析方法 生長(zhǎng)曲線測(cè)定:560 nm分光光度法[19]。降糖曲線測(cè)定:3,5-二硝基水楊酸分光光度法[20]。生理活性測(cè)定:產(chǎn)酯能力測(cè)定法、耐酸堿能力測(cè)定法、耐酒精能力測(cè)定法、耐鹽能力測(cè)定法[21]、菌落計(jì)數(shù)法[22]、透射電鏡觀察法、菌落觀察法。

2 結(jié)果與分析

2.1 低濃度離子液體處理對(duì)酵母菌的影響

2.1.1 酵母菌的生長(zhǎng)趨勢(shì) 從圖1可以看出,隨著離子液體濃度的增加,酵母菌的生長(zhǎng)量逐漸減少,離子液體濃度達(dá)到0.7%以上時(shí)酵母菌基本不生長(zhǎng)。添加了離子液體的試樣和空白相比,生長(zhǎng)曲線由始至終都比較平緩,說(shuō)明低濃度的[Bmim][PF6]離子液體抑制了酵母菌的生長(zhǎng)。

圖1 酵母菌生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of yeast in low concentration ionic liquid[Bmim][PF6]

2.1.2 酵母菌的降糖趨勢(shì) 培養(yǎng)11 h后,空白試樣殘?zhí)橇恳堰_(dá)最低值,而其它添加了離子液體的大部分試樣需要33 h才平衡,因此本實(shí)驗(yàn)采用了不同培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)和取樣間隔。從圖2可以看出,離子液體濃度小于0.9%的試樣殘?zhí)呛慷家堰_(dá)到最低點(diǎn),曲線趨于水平,但達(dá)到平衡的時(shí)間會(huì)隨離子液體濃度的增加而逐漸增長(zhǎng)。離子液體添加量為0.9%和1.1%的降糖曲線呈現(xiàn)波浪型下降,其殘?zhí)橇窟h(yuǎn)遠(yuǎn)大于其它試樣。酵母菌的殘?zhí)橇窟_(dá)到最低,即便繼續(xù)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間,培養(yǎng)液中的菌體量也不會(huì)繼續(xù)增加。結(jié)合生長(zhǎng)曲線和降糖曲線,可以明顯發(fā)現(xiàn)經(jīng)處理的酵母菌雖然通過延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間,能正常代謝培養(yǎng)液中的葡萄糖,但不能達(dá)至與空白相當(dāng)?shù)木w生長(zhǎng)量,其原因有待進(jìn)一步研究。

圖2 酵母菌降糖曲線Fig.2 Residual sugar curve of yeast in low concentration ionic liquid[Bmim][PF6]

2.1.3 二次培養(yǎng)菌量的比較 從圖3可以看出,二次培養(yǎng)開始時(shí),同樣的接種量,隨著離子液體濃度的增加吸光值逐漸減少,而且試樣吸光值差別明顯,部分試樣吸光值為零甚至負(fù)數(shù),說(shuō)明一次培養(yǎng)后部分試樣內(nèi)的酵母菌極少,溶液的最大吸光值可能不在560 nm。由圖4可以看出,培養(yǎng)26 h后,所有試樣的吸光值都明顯提高。添加了離子液體試樣的吸光值提高的幅度尤其突出,說(shuō)明一次培養(yǎng)中酵母菌的生長(zhǎng)受到明顯抑制,但當(dāng)離子液體濃度大幅降低后酵母的生長(zhǎng)能力得到很好的恢復(fù)。二次培養(yǎng)后,離子液體添加量小于等于0.5%的試樣吸光值和空白試樣差別不大。

圖3 二次培養(yǎng)0 h時(shí)的吸光值Fig.3 The optical density of yeast at 0 h in second cultivation 注:圖3中組別A、B、C、D、E分別對(duì)應(yīng)一次培養(yǎng)時(shí)離子液體濃度為0.3%、0.5%、0.7%、0.9%和1.1%的試樣,圖4、圖5同。

圖4 二次培養(yǎng)26 h時(shí)的吸光值Fig.4 The optical density of yeast at 26 h in second cultivation

2.1.4 二次培養(yǎng)殘?zhí)橇康谋容^ 從圖5可以看出,除了離子液體濃度為1.1%的試樣,其它試樣殘?zhí)橇炕疽恢?說(shuō)明各試樣中的可利用的糖原已基本消耗殆盡,濃度為1.1%的試樣殘?zhí)橇刻貏e高可能與該濃度下酵母生長(zhǎng)被嚴(yán)重抑制有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)所采用的生長(zhǎng)曲線測(cè)定方法為比濁法,由于菌懸液的濃度與光密度(OD值)成正比,可利用分光光度計(jì)測(cè)定菌懸液的光密度,從而推知菌液的濃度,最終得出生長(zhǎng)曲線。此測(cè)定方法快捷簡(jiǎn)便,卻不能判斷是因?yàn)榫w生長(zhǎng)造成懸液渾濁還是因?yàn)榫w自溶導(dǎo)致菌液光密度增加。但總的來(lái)說(shuō),二次培養(yǎng)后,酵母菌的糖代謝基本恢復(fù)正常。

圖5 二次培養(yǎng)26 h時(shí)的殘?zhí)橇縁ig.5 Residual sugar of yeast at 26 h in second cultivation

2.1.5 酵母菌生理活性的比較 從表1可以看出,酵母菌的產(chǎn)酯能力、耐酸堿能力、耐酒精能力、耐鹽能力都隨離子液體濃度的升高而減弱。

表1 離子液體[Bmim][PF6]處理后酵母菌生理活性的比較

注:+,-及其數(shù)量分別代表各種能力的強(qiáng)弱有無(wú)。

2.2 高濃度離子液體處理對(duì)酵母菌的影響

圖6 酵母菌存活率Fig.6 Cell viability of yeast after short time treatment with 3 methods

2.2.1 短時(shí)處理后酵母菌的存活率 從圖6可以看出,經(jīng)高濃度離子液體短時(shí)處理的酵母菌存活率都超過了70%,這說(shuō)明離子液體對(duì)酵母菌的殺傷性不大,而超臨界CO2處理和高濃度苯甲醇處理則會(huì)使酵母嚴(yán)重致死。離子液體濃度為20%的酵母存活率比濃度為40%的少?？赡芤?yàn)閇Bmim][PF6]離子液體的密度大,且不溶于水,20%離子液體在緩沖液中的分散程度比40%的高,對(duì)酵母的影響也相對(duì)劇烈。

2.2.2 短時(shí)處理后透射電鏡下的酵母形態(tài) 圖7是在放大倍數(shù)為1400x透射電鏡下酵母的細(xì)胞切片圖。圖7a中的每個(gè)酵母細(xì)胞的細(xì)胞壁都厚薄均勻,其細(xì)胞壁的厚度均約為20 nm。圖7b中不同切片間細(xì)胞壁厚薄不均,幾乎每個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞壁都在同一個(gè)方向上被撐大或擠壓,部分細(xì)胞壁被異常撐大處有穿孔。圖7c中不同細(xì)胞切片的細(xì)胞壁厚薄相差很大,但每個(gè)切片的細(xì)胞壁厚薄均勻。圖7e、圖7e與圖7a、圖7b、圖7c中的細(xì)胞壁明顯不同,透明細(xì)胞壁外部有一層因變性而生成的黑色物質(zhì),變性的細(xì)胞壁已不能承擔(dān)運(yùn)輸、保護(hù)細(xì)胞等功能,此種細(xì)胞壁說(shuō)明細(xì)胞已經(jīng)死亡。

圖7 酵母菌透射電鏡圖1400xFig.7 Analytical transmission electron microscope of yeast in 1400x

2.2.3 長(zhǎng)時(shí)處理后酵母菌落形態(tài) 極端處理中離子液體的濃度達(dá)到了100%,圖8是離子液體處理3個(gè)月后平板菌落圖?？梢?被高濃度離子液體長(zhǎng)時(shí)間處理的酵母菌并沒有被殺滅,菌落形態(tài)和不經(jīng)處理的酵母菌相差不大。圖8a中可以明顯看到兩個(gè)小點(diǎn)(箭頭所示),從圖8b可以看到兩個(gè)小點(diǎn)內(nèi)的菌落特別小,但數(shù)量甚多,這種現(xiàn)象可能由涂布平板時(shí)離子液體聚集并對(duì)酵母抑制造成。

圖8 極端處理后酵母菌落形態(tài)Fig.8 Colonial morphology of yeast after long time treatment in 100% ionic liquid[Bmim][PF6]注:圖8b是圖8a的局部放大圖。

3 結(jié)論

3.1 低濃度離子液體長(zhǎng)時(shí)處理對(duì)酵母菌的影響

在低濃度離子液體中酵母菌生長(zhǎng)受明顯抑制但卻不會(huì)死亡。隨著離子液體濃度增加酵母菌的最大菌體生長(zhǎng)量逐漸降低,達(dá)到可利用殘?zhí)亲畹椭档臅r(shí)間延長(zhǎng),酵母菌的各項(xiàng)生理活性均隨離子液體濃度升高而減弱。二次培養(yǎng)中,酵母菌的活性得到很好的恢復(fù),再次證明低濃度離子液體長(zhǎng)時(shí)處理對(duì)酵母菌只產(chǎn)生暫時(shí)的抑制作用,其致死能力不強(qiáng)。

3.2 高濃度離子液體短時(shí)處理對(duì)酵母菌的影響

離子液體對(duì)酵母菌的致死效果微弱。宏觀上看,高濃度離子液體(大于等于20%)處理遠(yuǎn)比超臨界CO2處理和高濃度苯甲醇處理試樣的存活率高;微觀上看,20%離子液體對(duì)酵母菌的致畸性比40%的大,但二者均不會(huì)讓酵母菌嚴(yán)重致死,而超臨界CO2及苯甲醇處理的酵母菌會(huì)因細(xì)胞壁變性而死亡。

3.3 高濃度離子液體長(zhǎng)時(shí)處理對(duì)酵母菌的影響

經(jīng)97%的離子液體處理3個(gè)月的酵母菌仍沒死亡,菌體形態(tài)保持正常,進(jìn)一步說(shuō)明[Bmim][PF6]離子液體對(duì)酵母菌的殺傷性不大。

4 討論

離子液體種類繁多、價(jià)格昂貴,不同離子液體的性質(zhì)與用途也各不相同,本實(shí)驗(yàn)需要選擇一種已被證實(shí)致死效果不嚴(yán)重的離子液體。

[Bmim][PF6]對(duì)酵母的毒性不大,但外國(guó)學(xué)者只側(cè)重研究微生物中的酶類,而并非微生物本身。Joshua Howarth[23]等人曾提出可以用[Bmim][PF6]∶水為10∶1的溶液作為固定化面包酵母生物合成酮類物質(zhì)的介質(zhì)。離子液體基本不會(huì)破壞在酵母中起催化作用的酶類。Alix Lenourry等人[24]的研究發(fā)現(xiàn),無(wú)論在離子液體[Bmim][PF6]還是正十四烷的作用下,Sporomusa termitida產(chǎn)咖啡酸的量都明顯減少,但在離子液體中產(chǎn)咖啡酸的量相對(duì)較多。接觸時(shí)間越長(zhǎng),離子液體對(duì)微生物的抑制越明顯。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)選擇了[Bmim][PF6]離子液體為研究對(duì)象。該離子液體為中性,密度為1.363 kg/m3(298K),不溶于水,密度比酵母菌大,因此靜置反應(yīng)時(shí)與酵母菌體接觸較少,這可能會(huì)導(dǎo)致靜止培養(yǎng)時(shí)酵母菌存活率偏高。若要真實(shí)反映酵母菌在高濃度離子液體中的存活情況應(yīng)采用振搖或攪拌的培養(yǎng)方式。

相對(duì)傳統(tǒng)有機(jī)溶劑來(lái)說(shuō)離子液體十分昂貴,因此注意其循環(huán)回收利用尤為重要。離子液體屬于綠色溶劑,具有強(qiáng)大的萃取功能。在以后的研究中可擴(kuò)展研究不同性質(zhì)的離子液體及微生物,根據(jù)微生物的特殊需要篩選出最適合其生長(zhǎng)代謝、生成最多目標(biāo)次級(jí)代謝物的離子液體,服務(wù)科學(xué)研究和工業(yè)生產(chǎn)。

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Effect of different concentrations of[Bmim][PF6]on the microbial activity ofSaccharomycescerevisiae

XIE Ru1,YE Sheng-ying2,GUO De-liang2,YANG Quan-hua2

(1.Dongguan Subordinate Grain Depot of Guangdong Province Grain Reserves Corporation,Dongguan 523145,China;2.College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China)

In order to study the role of ionic liquid as a solvent for whole cell biocatalyst,it is necessary to investigate the effect of ionic liquid treatments on microbial activity. In this study,Saccharomycescerevisiaewas selected as testing target,and the effect of different[Bmim][PF6]treatments on growth curve,sugar degradation curve,microbial activity,colonial morphology and the shape of cell wall of yeast were studied. The results showed that:[Bmim][PF6]ionic liquid would inhibit the growth of yeast,but the ionic liquid yeast lethal effect was weak,that was totally different from supercritical CO2treatment and high concentration benzene methanol treatment which would lead most yeast to death.

biocatalysis;ionic liquid;yeast;microbial activity

2015-03-07

謝茹(1985-)，女，本科，研究方向：食品科學(xué)與工程，E-mail:xrspook@xlanda.net 。

TS201.3

A

1002-0306(2015)23-0204-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.034