徐志強，榮春書，高寶山

（1.通遼市醫(yī)院泌尿外科，內(nèi)蒙古通遼028000；2.長春市中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院；3.吉林大學第一醫(yī)院泌尿系統(tǒng)疾病診治中心）

腎移植受者血清抗體IgG1及IgG3亞型介導(dǎo)對凋亡細胞的反應(yīng)性并激活補體途徑

徐志強1，榮春書2，高寶山3＊

（1.通遼市醫(yī)院泌尿外科，內(nèi)蒙古通遼028000；2.長春市中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院；3.吉林大學第一醫(yī)院泌尿系統(tǒng)疾病診治中心）

目的檢測腎移植受者術(shù)前血清內(nèi)多反應(yīng)性IgG抗體亞型與凋亡細胞的反應(yīng)性及與補體激活途徑的關(guān)系，初步探討此類抗體導(dǎo)致移植腎排異反應(yīng)及影響移植腎存活的機制。方法 選取50例腎移植患者術(shù)前血清學標本，應(yīng)用流式細胞技術(shù)檢測血清內(nèi)IgG抗體亞型（IgG1－IgG4）對凋亡細胞的反應(yīng)性，并檢測此類抗體與凋亡細胞反應(yīng)后，能否激活補體途徑，導(dǎo)致C4d沉積于靶細胞表面，并分析IgG亞型對凋亡細胞反應(yīng)強度與C4d在靶細胞表面沉積強度的相關(guān)性。結(jié)果 腎移植患者血清內(nèi)IgG抗體對凋亡細胞的反應(yīng)性主要由IgG1及IgG3亞型介導(dǎo)，而極少患者的血清由IgG2或IgG4介導(dǎo)對凋亡細胞的反應(yīng)，IgG1及IgG3亞型對凋亡細胞的反應(yīng)性與C4d在靶細胞表面沉積強度呈顯著相關(guān)性（P＜0.001，P＝0.005）。結(jié)論 本研究初步揭示腎移植患者血清內(nèi)多反應(yīng)性IgG抗體通過IgG1及IgG3亞型介導(dǎo)對凋亡細胞的反應(yīng)性，并可能通過激活補體途徑造成移植腎損傷。

腎臟移植；多反應(yīng)性抗體；凋亡細胞；補體

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1683）

抗體介導(dǎo)的移植腎排異反應(yīng)是導(dǎo)致移植腎失去功能的主要原因，也是影響移植腎長期存活的關(guān)鍵性因素。目前廣泛認為，器官移植后移植物發(fā)生抗體介導(dǎo)排異反應(yīng)及移植物失功主要與受者供體特異性抗體（Donor specific antibodies，DSA）的產(chǎn)生密切相關(guān)，而非供體特異性抗體（Non－donor specific antibodies，NDSA）對移植物存活的影響尚未得到足夠重視。然而有文獻報道，器官移植受者血清中未產(chǎn)生DSA的情況下，仍然存在針對移植物的抗體介導(dǎo)的排異反應(yīng)［1，2］。另有研究報道，器官移植患者體內(nèi)諸如血管緊張素受體、抗波形蛋白抗體、抗過氧化脂類抗體等諸多自身抗體與移植物的排異反應(yīng)密切相關(guān)并影響移植物長期存活［3－6］。除了DSA之外，NDSA也是影響移植物存活的重要因素。

我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)［7］，腎移植受者血清內(nèi)對凋亡細胞具有反應(yīng)性的IgG抗體與移植腎排異反應(yīng)顯著相關(guān)，并能夠影響移植腎長期存活，但其中機制尚不明確。本研究擬通過揭示腎移植受者血清內(nèi)IgG亞型對凋亡細胞的反應(yīng)性及是否能夠激活補體途徑來初步探討此類抗體導(dǎo)致移植腎排異反應(yīng)及影響移植腎存活的機制。

1 材料與方法

1.1 患者一般資料

本研究所用血清標本來源于2013年7月至2014年2月期間于吉林大學第一醫(yī)院首次行同種異體腎移植手術(shù)的患者。50例患者的基本資料如表1所示。

表1 患者一般資料

1.2 方法

1.2.1 凋亡細胞制備 Jurkat細胞株0.5×106／ml與200ng／ml抗FAS抗體于37℃孵育箱內(nèi)15小時。Annexin－V及7－AAD（BD公司）染色以確認細胞凋亡。

1.2.2 血清IgG純化 將患者與純化緩沖液以1∶10混勻后加入預(yù)裝有吸附膠體及濾膜的純化容器，6 000rpm離心2min，通過濾膜落入Eppendorf試管中的稀釋血清即純化后的IgG抗體，收集待用。

1.2.3 IgG亞型（IgG1－IgG4）對凋亡細胞的反應(yīng)性將分別從50例患者血清中純化的IgG抗體與1 ×106誘導(dǎo)凋亡后的Jurkat細胞株混勻，37℃孵育30min，低溫洗滌二次后，分別向標本中加入PE耦聯(lián)的抗IgG1、抗IgG2、抗IgG3及抗IgG4的二抗，4℃避光孵育30min。低溫洗滌二次后，應(yīng)用流式細胞儀檢測IgG亞型（IgG1－IgG4）對凋亡細胞的反應(yīng)性。反應(yīng)強度用平均熒光強度（MFI）表示。

1.2.4 C4d沉積實驗 0.5×106Jurkat凋亡細胞分別與60μl稀釋成1∶2的純化后血清IgG在FACS試管中混勻，37℃孵育30min。健康自愿者血清用Hank’s平衡鹽緩沖液稀釋成1∶100做為補體來源加入樣本，37℃孵育15min。低溫洗滌二次，于反應(yīng)體系中加入抗C4d二抗，4℃避光孵育30 min。低溫洗滌二次，加入FITC耦聯(lián)的鼠抗人IgG二抗，4℃避光孵育30min。低溫洗滌二次后，應(yīng)用流式細胞儀檢測凋亡細胞表面C4d沉積情況。C4d沉積強度用MFI表示。

1.3 統(tǒng)計學處理

Mann－Whitney檢驗用于比較IgG亞型（IgG1－IgG4）之間對凋亡細胞的反應(yīng)性。Spearman相關(guān)性檢驗用于統(tǒng)計IgG1、IgG3對凋亡細胞的反應(yīng)性與凋亡細胞表面C4d沉積強度之間的相關(guān)性。所有檢驗均為雙向檢驗，P值＜0.05具有統(tǒng)計學意義，數(shù)據(jù)分析應(yīng)用Graph Pad Prism 5.0統(tǒng)計軟件完成。

2 結(jié)果

腎移植患者血清IgG亞型對凋亡細胞的反應(yīng)性。通過對50例患者血清學檢測發(fā)現(xiàn)，IgG1或IgG3或此兩種亞型共同介導(dǎo)對凋亡細胞的反應(yīng)性，而極少患者的血清由IgG2或IgG4介導(dǎo)對凋亡細胞的反應(yīng)（圖1）。

血清IgG1及IgG3亞型與凋亡細胞反應(yīng)后激活補體途徑。在移植腎功能異常的病例中，可通過檢測移植物組織中C4d的沉積來揭示是否有補體途徑的參與［8，9］。本研究中，我們利用體外實驗檢測腎移植患者血清IgG與凋亡細胞反應(yīng)后能否激活補體途徑（圖2）。結(jié)果顯示，IgG1或IgG3亞型可與凋亡細胞發(fā)生反應(yīng)并激活補體途徑，從而介導(dǎo)C4d沉積于靶細胞表面。進一步分析顯示，IgG1及IgG3亞型對凋亡細胞的反應(yīng)性與C4d在靶細胞表面沉積強度呈顯著相關(guān)性（P＜0.001，P＝0.005，圖3）。

圖1 血清IgG亞型（IgG1－IgG4）對凋亡細胞的反應(yīng)性。（A）通過流式細胞儀檢測的4例具代表性腎移植患者血清IgG亞型對凋亡細胞的反應(yīng)性。灰色區(qū)域代表僅應(yīng)用IgG亞型二抗所獲得的背景，實線代表各IgG亞型的反應(yīng)性。（B）分別檢測50例患者血清IgG亞型（IgG1－IgG4）對凋亡細胞的反應(yīng)性，灰色色階代表反應(yīng)強度MFI，顏色越深表示反應(yīng)性越強

圖2 患者血清IgG與凋亡細胞反應(yīng)后導(dǎo)致C4d沉積于凋亡細胞表面

圖3 IgG亞型對凋亡細胞反應(yīng)性與C4d沉積于靶細胞表面的相關(guān)性

3 討論

同種異體腎移植術(shù)是治療終末期腎衰竭的有效方法?？贵w的存在是導(dǎo)致移植腎排異反應(yīng)的主要原因，也是導(dǎo)致移植腎失功的關(guān)鍵因素。長久以來，針對器官移植領(lǐng)域抗體的研究絕大多數(shù)集中于DSA，而NDSA及其他抗體在器官移植領(lǐng)域中的作用尚未得到足夠重視。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)［7］，腎移植受者血清內(nèi)多反應(yīng)性抗體能夠與凋亡細胞反應(yīng)，且此類抗體的活性與移植腎排異反應(yīng)顯著相關(guān)，并能夠影響移植腎長期存活，但其中機制尚不明確。晚期的移植腎失功經(jīng)常伴有補體途徑的參與，表現(xiàn)為C4d沉積于靶器官的表面，在此過程中，IgG1和IgG3亞型發(fā)揮了重要的作用。在此線索的指引下，結(jié)合本研究結(jié)果，我們認為，能夠與凋亡細胞反應(yīng)的IgG1和IgG3亞型很可能參與受者總體的免疫反應(yīng)并通過激活補體途徑造成移植物的損傷及失功。腎移植患者血清IgG與凋亡細胞的反應(yīng)性主要由抗體亞型IgG1及IgG3介導(dǎo)，這種現(xiàn)象的原因尚不明確，可能是能與凋亡細胞反應(yīng)的B淋巴細胞接受抗原刺激的類型不同從而驅(qū)動優(yōu)先向IgG1和IgG3亞型轉(zhuǎn)換。其可能的機制是凋亡細胞通過B細胞受體（B cell receptor，BCR）、共刺激分子以及Toll樣受體（Toll－like receptor，TLR）傳遞伴隨信號，從而引導(dǎo)CRS向IgG1和IgG3亞型轉(zhuǎn)換。值得關(guān)注的是，IgG1和IgG3亞型均具有很強的補體激活特性。

本文通過研究腎移植受者血清內(nèi)IgG亞型對凋亡細胞的反應(yīng)性及是否能夠激活補體途徑，初步揭示腎移植患者血清內(nèi)多反應(yīng)性抗體導(dǎo)致移植腎損傷的可能機制。

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Serum IgG1 and IgG3 subclass antibodies in kidney transplant recipients dominate the reactivity to apoptotic cells and acti－vate complement pathway

XU Zhi－qiang，RONG Chun－shu，GAO Bao－shan.
（Department of Urology，Inner Mongolia Tongliao Hospital，Tongliao 028000，China）

ObjectiveTo investigate the association between reactivity of IgG subclass in kidney transplant recipients to apoptotic cells and complement activation and explore the mechanism of effect of polyreactiveIgG on kidney allograft rejection and graft loss.Methods Pre－transplant serum samples were selected form 50kidney transplant recipients.Reactivity of IgG subclass to apoptotic cells was detected using flow cytometry.We also observed whether polyreactive IgG could activate complement pathway，leading C4ddeposition on target cells after binding to apoptotic cells.The association between reactivity of IgG subclass to apoptotic cells and C4ddeposition on target cells was analyzed.Results Our studies showed that IgG reactivity to apoptotic cells was almost exclusively mediated by IgG1and IgG3 subclasses.Few samples showed IgG2or IgG4reactivity to apoptotic cells.Moreover，we observed a strong association between IgG1and IgG3reactivity to apoptotic cells and C4ddeposition on target cells（P＜0.001，P＝0.005）.Conclusion Our studies preliminarily revealed that reactivity of polyreactive IgG in kidney transplant recipients to apoptotic cells was mediated by IgG1and IgG3subclasses，they lead to kidney allograft injury probably through activation of complement pathway.

Kidney transplantation；Polyreactive antibodies；Apoptotic cells；Complement

R392.4

A

2014－10－09）

1007－4287（2015）10－1683－04

＊通訊作者

文章編號：1007－4287（2015）10－1686－03