李大命,周 軍,唐晟凱,李旭光,林 海,張彤晴,周 剛

(1: 江蘇省淡水水產(chǎn)研究所,江蘇省內(nèi)陸水域漁業(yè)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京 210017)(2: 中國(guó)科學(xué)院南京地理與湖泊研究所湖泊與環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京 210008)

河蟹養(yǎng)殖池塘微囊藻水華毒性及其光合作用活性特征*

李大命1,2,周 軍1,唐晟凱1,李旭光1,林 海1,張彤晴1,周 剛1

(1: 江蘇省淡水水產(chǎn)研究所,江蘇省內(nèi)陸水域漁業(yè)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京 210017)(2: 中國(guó)科學(xué)院南京地理與湖泊研究所湖泊與環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京 210008)

蘇州市吳中區(qū)一河蟹養(yǎng)殖池塘在2013年7月和8月發(fā)生了嚴(yán)重的微囊藻水華.采用單一和雙重PCR擴(kuò)增微囊藻毒素合成酶基因，用以檢測(cè)微囊藻水華是否產(chǎn)毒，結(jié)果顯示為陽(yáng)性.同時(shí)，采用高效液相色譜測(cè)定微囊藻水華的毒性大小.結(jié)果表明：7月和8月微囊藻水華的胞內(nèi)微囊藻毒素濃度分別為1.49和0.88μg/L，胞外微囊藻毒素的濃度分別為0.75和1.09μg/L.另外，采用浮游植物熒光儀Phyto-PAM測(cè)定河蟹養(yǎng)殖水體形成水華的微囊藻的光合作用活性.結(jié)果顯示：7月和8月水華微囊藻的最大光量子產(chǎn)量Fv/Fm分別為0.48和0.44，實(shí)際光量子產(chǎn)量ΦPSII分別為0.38和0.32，表明形成水華的微囊藻有較高的生長(zhǎng)潛力.非光化學(xué)熒光淬滅值NPQ分別為0.28和0.36.從快速光響應(yīng)曲線(xiàn)RLC的特征參數(shù)來(lái)看，7月水華微囊藻的光合作用活性和光能利用效率高于8月.本研究結(jié)果表明，河蟹養(yǎng)殖池塘水體受到微囊藻水華和微囊藻毒素的污染，進(jìn)而可能對(duì)河蟹食品安全構(gòu)成潛在威脅.

河蟹養(yǎng)殖池塘；微囊藻水華；微囊藻毒素；微囊藻光合作用活性；浮游植物熒光儀

藍(lán)藻水華在富營(yíng)養(yǎng)化的湖泊、水庫(kù)和養(yǎng)殖池塘中頻繁發(fā)生已成為當(dāng)前水環(huán)境面臨的重大問(wèn)題.藍(lán)藻水華能產(chǎn)生多種具有毒性效應(yīng)的藍(lán)藻毒素(Cyanotoxins)，對(duì)水生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能、社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人類(lèi)健康都造成了嚴(yán)重的影響.微囊藻是形成藍(lán)藻水華最常見(jiàn)的優(yōu)勢(shì)種類(lèi)，微囊藻水華分布范圍廣，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，發(fā)生頻率高，且微囊藻能合成產(chǎn)生一系列具有肝毒性效應(yīng)的微囊藻毒素(Microcystin, MC)，它們能夠抑制肝細(xì)胞中的蛋白磷酸酶活性[1].長(zhǎng)期飲用含有MC的水，可能引發(fā)肝癌[2].世界衛(wèi)生組織(WHO)建議飲用水源中MC的安全濃度閾值<1.0μg/L，水產(chǎn)品中每日人體可允許攝入的MC<0.04μg/kg[3].

MC是一種小分子環(huán)狀多肽，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定.研究表明，MC是由微囊藻毒素合成酶基因家族(microcystin synthesis gene,mcy)編碼的多酶復(fù)合體催化合成.應(yīng)用分子生物技術(shù)已經(jīng)闡明了mcy基因家族結(jié)構(gòu)，并完成了序列分析.mcy基因家族是由兩個(gè)反方向的操縱子組成，包含10個(gè)家庭成員(mcyA-J)[4-5].文獻(xiàn)報(bào)道微囊藻細(xì)胞中是否含有mcy基因與微囊藻毒素產(chǎn)生有密切相關(guān)性[6].基于此，設(shè)計(jì)了針對(duì)mcy基因家族成員的引物，建立了檢測(cè)微囊藻水華是否產(chǎn)毒的PCR擴(kuò)增技術(shù)，可以對(duì)微囊藻水華是否產(chǎn)毒做出快速和準(zhǔn)確判斷[7-10].同時(shí)，針對(duì)MC的檢測(cè)技術(shù)和分析方法也迅速發(fā)展，主要有生物分析法、化學(xué)分析法和生化分析法，高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)是目前應(yīng)用、研究最多的方法[11].

近10多年來(lái)，我國(guó)河蟹養(yǎng)殖業(yè)有了迅猛的發(fā)展，養(yǎng)殖技術(shù)有了很大提高，池塘養(yǎng)殖密度不斷增大，對(duì)水體的投入也在增加，造成養(yǎng)殖池塘水體富營(yíng)養(yǎng)化和環(huán)境惡化，導(dǎo)致河蟹養(yǎng)殖池塘藍(lán)藻水華頻繁發(fā)生，對(duì)河蟹養(yǎng)殖造成巨大損失.已有一些文獻(xiàn)對(duì)于養(yǎng)殖池塘藍(lán)藻水華現(xiàn)象進(jìn)行了報(bào)道，但對(duì)于微囊藻水華的毒性大小和微囊藻的生理特征尚缺乏研究.2013年7月和8月，蘇州市吳中區(qū)一河蟹池塘發(fā)生了嚴(yán)重的微囊藻水華，顯微鏡檢測(cè)結(jié)果表明銅綠微囊藻是其水華的優(yōu)勢(shì)種群.本研究采用全細(xì)胞PCR擴(kuò)增快速檢測(cè)微囊藻水華是否有毒，進(jìn)一步應(yīng)用HPLC分析方法測(cè)定了MC濃度.另外，應(yīng)用Phyto-PAM熒光儀測(cè)定了微囊藻水華的光合作用活性，用于研究微囊藻的生理特征.本研究為了解河蟹養(yǎng)殖池塘微囊藻水華毒性和生理特征提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時(shí)為評(píng)價(jià)河蟹食品安全提供科學(xué)依據(jù).

1 材料和方法

1.1 水樣采集

2013年7月和8月蘇州吳中區(qū)一河蟹養(yǎng)殖池塘發(fā)生嚴(yán)重的微囊藻水華，分別于7月24日和8月23日上午10:00采集水樣，使用有機(jī)玻璃采水器采集10 L水樣(30cm)，混合均勻，取1 L水樣裝入干凈玻璃瓶中，每個(gè)水樣取2個(gè)平行，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析.

1.2 理化因子測(cè)定

采用哈希水質(zhì)監(jiān)測(cè)儀(HQ-40, HACH)原位測(cè)定采樣點(diǎn)水體的溫度、溶解氧和pH.采用透明度盤(pán)測(cè)定水體的透明度.總氮采用堿性過(guò)硫酸鉀消解-紫外分光光度法測(cè)定，總磷采用鉬酸銨分光光度法測(cè)定，葉綠素a采用90%丙酮萃取，分光光度法測(cè)定[12].

1.3mcy基因片段的擴(kuò)增和檢測(cè)

取5.0ml水樣，10000轉(zhuǎn)/mim離心10min收集微囊藻細(xì)胞，用超純水洗滌，反復(fù)3次，最后用100μl超純水定容，置于-20℃保存，作為PCR擴(kuò)增模板.

本研究選擇mcyA、mcyD和mcyG基因作為PCR擴(kuò)增對(duì)象，PCR擴(kuò)增所用引物見(jiàn)表1.其中對(duì)mcyA基因采用單一PCR擴(kuò)增，mcyD和mcyG采用雙重PCR擴(kuò)增.

表1 PCR擴(kuò)增引物

擴(kuò)增條件：PCR反應(yīng)體系25μl，其中包含12.5μl, 2×PCR mix(上海博彩生物)，1μl正反引物(10μmol)，4μl模板，用超純水補(bǔ)足25μl，陰性對(duì)照使用超純水作為DNA模板.

反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃ 5min，變性95℃ 40s，引物退火58℃ 40 s(mcyA)和56℃ 40s(mcyD和mcyG)，延伸72℃ 40s，30個(gè)循環(huán)，最后在72℃下保留8min.取5μl PCR產(chǎn)物，采用濃度1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，緩沖液是0.5×TAE，電泳結(jié)束后在紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察、拍照.

1.4 微囊藻毒素濃度

取200ml水樣，經(jīng)GF/C玻璃纖維濾膜過(guò)濾，濾膜和濾液分別用于測(cè)定胞內(nèi)和胞外微囊藻毒素的濃度.將濾膜置于低溫冷凍干燥機(jī)中凍干，剪碎濾膜，分別用5%的乙酸溶液和80%的甲醇溶液各5ml進(jìn)行抽提[13]，輔以超聲波破碎，并充分震蕩混勻，離心后合并上清液.采用C18固相萃取小柱富集和純化濾膜提取液和濾液，用含0.1% TFA的甲醇溶液洗脫，洗脫液在40℃氮?dú)獯蹈桑?.5ml 50%的甲醇溶液定容待測(cè).

采用帶有紫外檢測(cè)器的安捷倫高效液相色譜儀(Agilent1200, Agilent, USA)進(jìn)行分析，檢測(cè)條件為：流動(dòng)相為含0.05% TFA的乙腈溶液，梯度從30%～70%，柱溫40℃，流速1ml/min，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)為238nm.

1.5 光合作用活性分析

2 結(jié)果和分析

2.1 理化因子

河蟹養(yǎng)殖池塘采樣點(diǎn)7月和8月總氮分別為1.68和1.05 mg/L，總磷濃度分別為258.28和468.52μg/L，總氮和總磷濃度均超過(guò)水體富營(yíng)養(yǎng)化標(biāo)準(zhǔn)；葉綠素a濃度分別為74.8和63.8μg/L，顯微鏡觀察結(jié)果表明微囊藻水華主要是由銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)組成；水溫分別為28.5和31.5℃，有利于微囊藻水華形成；透明度較低，分別為30和25cm；水質(zhì)呈堿性，pH分別為10.50和9.85；溶解氧分別為8.51和7.82 mg/L.

2.2 PCR產(chǎn)物的檢測(cè)

PCR產(chǎn)物的凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果可以看出，PCR產(chǎn)物的特異性高，沒(méi)有引物二聚體(圖1).7月和8月河蟹養(yǎng)殖池塘的微囊藻水華樣品均能擴(kuò)增出mcyA、mcyD和mcyG基因片段，片段大小與目的基因一致，可以初步判斷，微囊藻水華具有產(chǎn)毒性.

圖1 PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖譜(M：分子標(biāo)記，DL1000；7和8：相應(yīng)月份微囊藻水華樣品，-：陰性對(duì)照；左圖a：mcyA PCR產(chǎn)物，右圖b：mcyD和mcyG PCR產(chǎn)物)Fig.1 Agarose gel electrophoresis images of PCR products(M: Marker, DNA ladder 1000; 7 and 8 indicate the Microcystis bloom samples in July and August, respectively;-: negative control;(a): mcyA,(b): mcyD and mcyG)

2.3 微囊藻毒素濃度

采用HPLC分析方法測(cè)定河蟹養(yǎng)殖池塘微囊藻水華毒素濃度，結(jié)果如圖2所示.共檢出3種異構(gòu)體，異構(gòu)體濃度在7月和8月存在差異：7月微囊藻水華胞內(nèi)毒素濃度大于8月，而胞外毒素濃度相反. 7月微囊藻水華胞內(nèi)毒素濃度為1.49μg/L，其中異構(gòu)體RR、YR和LR濃度分別為0.46、0.45和0.58μg/L.胞外毒素濃度為0.75μg/L，RR、YR和LR濃度分別為0.22、0.18和0.35μg/L；8月胞內(nèi)微囊藻毒素濃度達(dá)0.88μg/L，其中異構(gòu)體RR、YR和LR濃度分別為0.27、0.31和0.30μg/L.胞外微囊藻毒素濃度為1.09μg/L，RR、YR和LR濃度分別為0.39、0.28和0.42μg/L.

圖2 胞內(nèi)和胞外微囊藻毒素濃度Fig.2 Intracelluar and extracellular microcystin concentrations

2.4 微囊藻光合作用活性

從水華微囊藻的葉綠素?zé)晒鈪?shù)可以看出，7月和8月微囊藻的最大光量子產(chǎn)量Fv/Fm分別為0.48和0.44，實(shí)際光量子產(chǎn)量ΦPSII分別為0.38和0.32(圖3)，表明水華期間微囊藻有較高的光合作用活性.從NPQ值可以看出，8月微囊藻的熱耗散能力高于7月.從光響應(yīng)曲線(xiàn)的特征參數(shù)可以看出，7月微囊藻的光能利用效率、耐受光強(qiáng)能力和電子傳遞速率均高于8月(圖3).

圖3 水華微囊藻的光合作用活性Fig.3 Photochemical activity of bloom-forming Microcystis

3 討論

河蟹已成為我國(guó)淡水漁業(yè)養(yǎng)殖的重要品種之一.近年來(lái)，河蟹池塘養(yǎng)殖技術(shù)有很大提高，放養(yǎng)密度逐漸加大，餌料投入不斷增加，導(dǎo)致養(yǎng)殖水體環(huán)境惡化，營(yíng)養(yǎng)鹽負(fù)荷增加，養(yǎng)殖水體變肥，呈現(xiàn)富營(yíng)養(yǎng)化狀態(tài).池塘水體的總氮和總磷濃度均超過(guò)富營(yíng)養(yǎng)化標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致水體透明度也較低，加之養(yǎng)殖池塘是封閉性水體，流動(dòng)性差.同時(shí)，2013夏季7月和8月出現(xiàn)了長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)的高溫晴朗天氣，這些都是促使微囊藻水華發(fā)生的有利條件[18].在水華形成時(shí)，水體中葉綠素a的濃度一般在10μg/L以上.在該研究中，7、8月兩次采樣池塘水體中微囊藻水華的葉綠素a濃度分別達(dá)到74.8和63.5μg/L，均顯著高于10μg/L，表明微囊藻水華強(qiáng)度較高.顯微鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，銅綠微囊藻是微囊藻水華的優(yōu)勢(shì)種群.

光合作用活性是指示微囊藻生理特征的重要指標(biāo)，目前多采用葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)測(cè)定浮游植物的光合作用活性. Phyto-PAM是專(zhuān)一測(cè)定浮游植物光合活性的熒光儀，在研究湖泊微囊藻水華中廣泛用來(lái)測(cè)定水華微囊藻的光合活性[19-20].從本研究結(jié)果可以得出(圖3)，7月和8月水華微囊藻有較高的光合作用活性，其最大光量子產(chǎn)量Fv/Fm分別為0.48和0.44，實(shí)際光量子產(chǎn)量ΦPSII分別為0.38和0.32，這表明該河蟹養(yǎng)殖池塘形成水華的微囊藻有較高生長(zhǎng)潛能，有利于微囊藻水華長(zhǎng)時(shí)間存在.同時(shí)可以得出，7月和8月形成水華的微囊藻光合活性存在差異：7月微囊藻的光合活性高于8月.微囊藻光響應(yīng)曲線(xiàn)的特征參數(shù)也可以說(shuō)明這一點(diǎn).從水溫變化看，8月池塘水體的溫度(31.5℃)高于7月(28.5℃)，研究表明在上述溫度范圍內(nèi)，溫度升高有利于提高微囊藻的光合活性[21-22]，但8月微囊藻的光合活性反而較低，可能是由于微囊藻受到夏季太陽(yáng)光長(zhǎng)時(shí)間照射產(chǎn)生光抑制的現(xiàn)象.已有許多文獻(xiàn)報(bào)道微囊藻在夏季強(qiáng)光照射下，光合作用器官受到損傷，進(jìn)而光合作用活性下降[19-20].另一方面，微囊藻可以通過(guò)NPQ機(jī)制降低光損傷[15]，從本研究結(jié)果可以看出，8月微囊藻NPQ值高于7月微囊藻，這也是微囊藻在長(zhǎng)時(shí)間高光強(qiáng)條件下的一種適應(yīng)機(jī)制.

PCR檢測(cè)法是檢測(cè)微囊藻水華是否產(chǎn)毒的常用方法之一，它具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)[7-8]. PCR擴(kuò)增對(duì)象可以是從水華微囊藻提取的DNA，也可以是微囊藻細(xì)胞.相比較而言，全細(xì)胞PCR可以直接以野外微囊藻細(xì)胞為擴(kuò)增對(duì)象，省去了繁瑣的DNA提取過(guò)程，在自然水體藍(lán)藻水華檢測(cè)中已有廣泛應(yīng)用[23].同時(shí)，從單一PCR擴(kuò)增向雙重和多重PCR擴(kuò)增發(fā)展[8].本研究采用全細(xì)胞的單一和雙重PCR方法擴(kuò)增了河蟹養(yǎng)殖池塘水華微囊藻的mcy基因，結(jié)果顯示為陽(yáng)性(圖1)，表明微囊藻水華是產(chǎn)毒的，與HPLC分析結(jié)果一致(圖2)，表明該池塘水體受到MC污染.與張占會(huì)等[8]建立的全細(xì)胞多重PCR檢測(cè)產(chǎn)毒微囊藻方法相比，本研究所選用引物特異性高，目的基因條帶清晰，沒(méi)有非特異性產(chǎn)物和引物二聚體出現(xiàn).因此，對(duì)于野外微囊藻的全細(xì)胞PCR擴(kuò)增而言，需要選擇特異性高的引物，并對(duì)PCR反應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化.

從HPLC分析結(jié)果可以得出，7月微囊藻水華胞內(nèi)、外MC濃度分別為1.49和0.75μg/L，8月胞內(nèi)、外MC濃度分別為0.88和1.09μg/L，呈現(xiàn)出季節(jié)差異性，這可能與微囊藻水華生長(zhǎng)階段有關(guān).一般而言，在微囊藻水華生長(zhǎng)的前期和中期，胞內(nèi)毒素含量較高，而胞外毒素濃度較低；在微囊藻水華的后期，微囊藻細(xì)胞出現(xiàn)衰亡，微囊藻毒素釋放到水體中，微囊藻胞內(nèi)毒素降低，胞外毒素升高.另外，環(huán)境因子(溫度、光照和營(yíng)養(yǎng)鹽)的差異也可能是導(dǎo)致MC濃度變化的原因.由于MC性質(zhì)較穩(wěn)定，可以在水體中長(zhǎng)期存在，且能通過(guò)食物鏈進(jìn)行傳遞，在水生動(dòng)物體內(nèi)富集，對(duì)魚(yú)類(lèi)、甲殼類(lèi)的食品安全構(gòu)成潛在威脅，因此MC在可食性水產(chǎn)品中的分布及其動(dòng)態(tài)變化成為研究熱點(diǎn)[24-28].本研究結(jié)果表明，河蟹養(yǎng)殖池塘發(fā)生有毒微囊藻水華，水體受到MC污染，這可能會(huì)對(duì)河蟹食品安全構(gòu)成威脅，需要對(duì)河蟹體內(nèi)MC濃度及其動(dòng)態(tài)變化做進(jìn)一步研究.

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Toxicity and photochemical activity ofMicrocystisbloom in crab cultivation pond

LI Daming1,2, ZHOU Jun1, TANG Shengkai1, LI Xuguang1, LIN Hai1, ZHANG Tongqing1& ZHOU Gang1

(1:KeyLaboratoryofFisheriesResourcesinInlandWater,FreshwaterFisheriesResearchInstituteofJiangsuProvince,Nanjing210017,P.R.China)(2:StateKeyLaboratoryofLakeScienceandEnvironment,NanjingInstituteofGeographyandLimnology,ChineseAcademyofSciences,Nanjing210008,P.R.China)

In July and August of 2013,Microcystisbloom occurred in a crab pond which was located in Wuzhong district, the city of Suzhou. In the present study, single and double PCR amplification for microcystin synthetase gene were used to detect whether theMicrocystisbloom was toxigenic or not. All PCR products fromMicrocystisbloom materials were positive. Meanwhile,high performance liquid chromatography technique were used to measure the microcystin concentration ofMicrocystisbloom, the results showed that intracellular microcystin concentration were 1.49 and 0.88μg/L in July and August, and intracellular microcystin concentration were 0.75 and 1.09μg/L, respectively. In addition, Phyto-PAM was applied to measure photochemical activity of bloom-formingMicrocystis. The value of maximum quantum yieldFv/Fmwere 0.48 and 0.44 in July and August, and the effective quantum yieldΦPSIIwere 0.38 and 0.32, respectively. These results suggested that bloom-formingMicrocystishad higher potential growth, and the value of non-photochemical quenching were 0.28 and 0.36. From the view of characteristical parameters of rapid light response light curve, it demonstrated that the photochemical activity of bloom-formingMicrocystisin July is higher than that in August. The experiment results from this study suggested that water in crab culture pond has suffered fromMicrocystisbloom and microcystin contamination may present potential threat to crab food safety.

Crab pond;Microcystisbloom; microcystin; photochemical activity; Phyto-PAM phytoplankton analyzer

*江蘇省青年科學(xué)基金項(xiàng)目(BK2012488)和國(guó)家“十二五”子課題河蟹池塘高效生態(tài)養(yǎng)殖技術(shù)集成與示范項(xiàng)目(2012BAD25B07)聯(lián)合資助.2013-12-20收稿；2014-04-14收修改稿.李大命(1981～)，男，博士，助理研究員；E-mail:ldm8212@126.com.