張 毅，陳東芹，張 凱，王 銳，陳龍邦

0 引 言

肺癌的發(fā)病率和死亡率高居各種惡性腫瘤的首位，嚴(yán)重危害人類健康，是全球范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生問題［1-2］。肺癌根據(jù)病理類型的不同可分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，其中80%左右為非小細(xì)胞肺癌，非小細(xì)胞肺癌中絕大部分病理類型為肺腺癌。

目前針對(duì)肺腺癌的主要治療手段包括手術(shù)、放療、化療、生物治療、分子靶向治療等。但很多患者早期無(wú)臨床癥狀，發(fā)現(xiàn)時(shí)已到晚期失去了手術(shù)機(jī)會(huì)。放療作為肺腺癌治療的主要手段之一，廣泛應(yīng)用于臨床。但是，臨床觀察發(fā)現(xiàn)很多肺腺癌患者對(duì)放療不敏感，且部分患者在治療過程中會(huì)出現(xiàn)抵抗，從而使療效大大降低。因此，尋求肺腺癌放療抵抗的潛在機(jī)制對(duì)臨床治療肺腺癌而言有重要意義。

本研究前期自建了人肺腺癌多藥耐藥株SPCA1/多西他賽(docetaxel，DTX)［3］，并且發(fā)現(xiàn)與親本株SPC-A1 相比，該耐藥株同時(shí)具有放療抵抗，本研究擬在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討人肺腺癌多藥耐藥株SPC-A1/DTX 放療抵抗的潛在分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor κB，NF-κB，美國(guó)，Selleck 公司)，Aurora-A 干擾質(zhì)粒［4］，多西他賽(山東齊魯藥業(yè))，Aurora-A、NF-κB、IκBa、GAPDH 抗體(美國(guó)，Abcom 公司)、胎牛血清(杭州四季青公司)、RPMI1640 培養(yǎng)液(美國(guó)Hyclone 公司)，SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR Kit(日本Takara公司)、PVDF 膜(美國(guó)，Millipore 公司)人肺腺癌SPC-A1(上海細(xì)胞所)、人肺腺癌SPC-A1/DTX 耐藥株(本實(shí)驗(yàn)室自建)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染、給藥方法 人肺腺癌SPC-A1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS 的RPMI1640 培養(yǎng)液中，人肺腺癌SPC-A1/DTX 細(xì)胞培養(yǎng)于多西他賽終濃度為50 mg/L，含10%FBS 的RPMI1640 培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為37 ℃，5%CO2，飽和濕度，每2 天傳代培養(yǎng)。sh-Aurora-A 組用Aurora-A 干擾質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，對(duì)照sh-NC 組加入DMSO 后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT 測(cè)定細(xì)胞體外放療敏感性 SPC-A1、SPC-A1/DTX 細(xì)胞以2000/100 微升/孔的密度接種于96 孔板，孵箱培養(yǎng)，貼壁后給予不同劑量的射線照射，48 h 后加入MTT，孵育4 h 后，加入DMSO 溶解結(jié)晶，490 nm 波長(zhǎng)測(cè)定A 值。

1.2.3 克隆實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證細(xì)胞體外增殖能力 1000個(gè)/孔接種細(xì)胞于6 孔板，孵育10 ～14 d 后，PBS 清洗1 遍，純甲醇固定，結(jié)晶紫染色，拍照、計(jì)數(shù)。

1.2.4 實(shí)時(shí)定量RT-PCR 測(cè)定mRNA 表達(dá) TRIzol法提取總RNA，以日本Takara 公司的SYBR?Prime-ScriptTMRT-PCR Kit 試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為CDNA，加Aurora-A 的引物［3］，擴(kuò)增，反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s;55 ℃復(fù)性30 s;72 ℃延伸60 s;共循環(huán)35 次。利用ABI Prism 7000 型實(shí)時(shí)定量PCR儀檢測(cè)目標(biāo)基因的表達(dá)。2-ΔΔCt法計(jì)算表達(dá)量。

1.2.5 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá) 提取總蛋白，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂牛奶封閉，孵育一抗，4 ℃過夜，洗膜5 min×3 次，孵育二抗，室溫2 h，洗膜10 min×4 次，ECL 發(fā)光液發(fā)光，Image J 掃描灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.2 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量檢測(cè)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。2 組均數(shù)的比較視方差齊性檢驗(yàn)(以0.1 作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)進(jìn)行Levene 檢驗(yàn))結(jié)果進(jìn)行不同的選擇:當(dāng)方差齊同時(shí)，用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn);當(dāng)方差不齊時(shí)，用Satterthwaite 校正t 檢驗(yàn)。多組均數(shù)的比較采用單因素方差分析:當(dāng)方差齊同時(shí)，選擇LSD 檢驗(yàn)，當(dāng)方差不齊時(shí)，選擇Tamhane'sT2 檢驗(yàn)。以P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SPC-A1/DTX 與SPC-A1 細(xì)胞的半數(shù)致死量(50%effective dose，ED50)值和體外增殖能力結(jié)果MTT 法測(cè)定SPC-A1 和SPC-A1/DTX 細(xì)胞的ED50(50%effective dose，半數(shù)致死量)值分別為(6.5±0.3)Gy、(12.8±0.6)Gy，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。在0，2，4，6 Gy 放療條件下，SPC-A1 細(xì)胞細(xì)胞克隆數(shù)分別為(345±20)個(gè)、(252±22)個(gè)、(170±15)個(gè)、(81±10)個(gè)，SPC-A1/DTX 細(xì)胞克隆數(shù)分別為(402±21)個(gè)、(370±18)個(gè)、(301±16)個(gè)、(252±15)個(gè)，同放療條件下SPC-A1 細(xì)胞細(xì)胞克隆數(shù)較SPC-A1/DTX 體外增值能力明顯下降(P ＜0.05)，見圖1。

圖1 各組在不同放療條件下克隆形成數(shù)的比較Figure 1 Numbers of cloned SPC-A1 and SPC-A1/DTX cells in different radiation dose groups

2.2 SPC-A1/DTX 細(xì)胞中的Aurora-A 蛋白及mRNA 表達(dá) 在放療0 Gy 條件下，SPC-A1/DTX 細(xì)胞中的Aurora-A 的蛋白水平(1.00±0.08)、mRNA 水平(1.00±0.06)均明顯高于SPC-A1 細(xì)胞(0.49±0.03、0.22±0.02)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);并且隨著放療劑量強(qiáng)度的增加，耐藥株SPC-A1/DTX細(xì)胞中Aurora-A 的蛋白水平、mRNA 表達(dá)水平均較0 Gy 放療條件下進(jìn)一步增加，見圖2，表1。

圖2 不同放療條件下SPC-A1/DTX 細(xì)胞中的Aurora-A蛋白表達(dá)Figure 2 Protein expression of Aurora-A in SPC-A1/DTX cells in different radiation dose groups

表1 SPC-A1/DTX 和SPC-A1 細(xì)胞的Aurora-A 蛋白量及mRNA 比較Table 1 Protein and mRNA expressions of Aurora-A in SPC-A1 and SPC-A1/DTX cells in different radiation dose groups

表1 SPC-A1/DTX 和SPC-A1 細(xì)胞的Aurora-A 蛋白量及mRNA 比較Table 1 Protein and mRNA expressions of Aurora-A in SPC-A1 and SPC-A1/DTX cells in different radiation dose groups

與SPC-A1/DTX 0 Gy 比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

細(xì)胞 蛋白量比值 mRNA比值SPC-A1 0 Gy 0.49±0.03＊＊ 0.22±0.02＊＊SPC-A1/DTX 0 Gy 1.00±0.08 1.00±0.06 2 Gy 1.45±0.12* 1.35±0.10*4 Gy 1.72±0.11＊＊ 2.42±0.18＊＊6 Gy 2.63±0.20＊＊ 3.51±0.25＊＊

2.3 抑制Aurora-A 表達(dá)后SPC-A1/DTX 細(xì)胞的ED50值 sh-Aurora-A 組可見Aurora-A 的蛋白表達(dá)明顯抑制，見圖3。MTT 法測(cè)定sh-NC 組和sh-Aurora-A組細(xì)胞的ED50值分別為(11.8±0.5)Gy、(7.1±0.3)Gy，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。

圖3 SPC-A1/DTX 的Aurora-A 的蛋白水平Figure 3 Protein expression of Aurora-A in SPC-A1/DTX cells treated with sh-NC or sh-Aurora-A

2.4 抑制NF-κB 的表達(dá)后SPC-A1/DTX 細(xì)胞的ED50值 免疫印跡法發(fā)現(xiàn)NF-κB 抑制組的NF-κB蛋白表達(dá)明顯下降，見圖4;抑制NF-κB 后，MTT 法測(cè)定對(duì)照組和NF-κB 抑制組細(xì)胞的ED50值分別為(11.7±0.5)Gy 和(6.1±0.3)Gy，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。

圖4 SPC-A1/DTX 加入NF-κB 抑制劑后NF-κB 蛋白的表達(dá)Figure 4 Protein expression of NF-κB in SPC-A1/DTX cells treated or not treated with NF-κB inhibitors

2.5 免疫印跡法測(cè)定核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 與Aurora-A 的表達(dá) 抑制Aurora-A 后，發(fā)現(xiàn)IκBa 的表達(dá)為原表達(dá)的(2.18±0.32)倍(P ＜0.01)，NF-κB 的蛋白表達(dá)為原表達(dá)的(0.24±0.03)倍(P ＜0.01)，見圖5a;與親本株SPC-A1 的IκBa(1.00±0.05)和NF-κB(1.00±0.04)比較，耐藥株SPC-A1/DTX 中IκBa 低表達(dá)(0.65±0.04)，NF-κB 呈高表達(dá)(2.18±0.15)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)，見圖5b。

圖5 免疫印跡法測(cè)定核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 與Aurora-A 的表達(dá)Figure 5 Protein expressions of Aurora-A and NF-κB detected by Western blot

3 討 論

Aurora-A 是絲氨酸/蘇氨酸激酶Aurora 激酶家族的一種亞型，在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)［5］，如肺癌、食管癌，肝癌，乳腺癌、結(jié)腸癌等，并且與患者的預(yù)后密切相關(guān)［6］。已有文獻(xiàn)報(bào)道，Aurora-A 參與了乳腺癌的放化療抵抗［7］。Aurora-A 通過NF-κB/miR-21/PTEN/Akt 信號(hào)通路參與了肝細(xì)胞癌的化療敏感性，過表達(dá)的Aurora-A 與病人的無(wú)復(fù)發(fā)生存及總生存率密切相關(guān)，是肝癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素［3］。過表達(dá)的Aurora-A 可通過上調(diào)ATM/Chk2的表達(dá)，下調(diào)BRCA1/2、ATR/Chk1、p53、pp53、H2AX、gammaH2AX 和RAD51，從而參與腫瘤細(xì)胞的放療抵抗［7］。在非小細(xì)胞肺癌中，過表達(dá)的Aurora-A與順鉑耐藥、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者的預(yù)后密切相關(guān)［6］。

本研究發(fā)現(xiàn)Aurora-A 在耐藥株中表達(dá)明顯增高，并且干擾Aurora-A 后可顯著逆轉(zhuǎn)人肺腺癌耐藥株的放療抵抗，提示高水平的Aurora-A 參與了人肺腺癌耐藥株SPC-A1/DTX 細(xì)胞的體內(nèi)外放療抵抗性。抑制Aurora-A 后可以上調(diào)IκBa 的表達(dá)，進(jìn)而抑制NF-κB 的蛋白表達(dá);并且發(fā)現(xiàn)與親本株相比，IκBa 在耐藥株中與NF-κB 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。提示在人肺腺癌耐藥株SPC-A1/DTX 細(xì)胞中，核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 是Aurora-A 的下游效應(yīng)基因。但Aurora-A調(diào)控放療抵抗的具體機(jī)制還未完全闡明。

以往研究報(bào)道，在P53 敲除的肺癌細(xì)胞中Aurora-A可引起IκBa 的穩(wěn)定性降低，進(jìn)而引起核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor κB，NF-κB)的轉(zhuǎn)錄活性增加，參與了吉非替尼的耐藥［8］。miR-15a/16 通過靶向TLR1/NF-κB信號(hào)通路而增加非小細(xì)胞肺癌的放療敏感性［9］。NF-κB 既是細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、炎癥反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子又是內(nèi)源性促腫瘤因子。一般而言，非結(jié)合條件下，NF-κB 與其抑制蛋白IκB 結(jié)合成三聚體復(fù)合物在核內(nèi)外保持動(dòng)態(tài)平衡。NF-κB 的活化主要是IκB的解離或NF-κB 的表達(dá)增加。NF-κB 的異常激活與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［10-12］，NF-κB 編碼的蛋白質(zhì)在細(xì)胞漿和細(xì)胞核中表達(dá)表達(dá)異常，細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活，細(xì)胞異常增生，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［13］。本研究證實(shí)了NF-κB 在肺腺癌表達(dá)量遠(yuǎn)高于其在正常肺組織中的表達(dá)，提示NF-κB 可能參與了這種類型肺癌的發(fā)生發(fā)展。放療可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)NF-κB 的水平明顯升高，過度激活的NF-κB 可以促進(jìn)凋亡抑制因子的大量生產(chǎn)，使腫瘤細(xì)胞抗凋亡能力增強(qiáng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，從而產(chǎn)生放療抵抗［14-16］。NF-κB 也可通過調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)所需的多種細(xì)胞因子如TGF-beta 的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和分化進(jìn)而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)而產(chǎn)生放療抵抗［17-18］。本研究發(fā)現(xiàn)耐藥株中的NF-κB的表達(dá)量明顯高于親本株，抑制Aurora-A 后IκBa的表達(dá)降低，而NF-κB 的表達(dá)增高，放療可導(dǎo)致耐藥株中的NF-κB 表達(dá)量進(jìn)一步升高，以上結(jié)果提示高表達(dá)的Aurora-A 引起NF-κB 活化進(jìn)而參與了人肺腺癌的放療抵抗。

綜上所述，相比人肺腺癌親本株而言，耐藥株中過表達(dá)的Aurora-A 通過引起NF-κB 的異?；罨?，進(jìn)一步激活NF-κB 信號(hào)通路通過一系列的復(fù)雜機(jī)制最終引起人肺腺癌的放療抵抗。

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