李玉靜，刁振宇，薛平平，沈 莉，龔 萍，顏桂軍，胡婭莉

0 引 言

外泌體是由細胞細胞質(zhì)內(nèi)的晚期內(nèi)泡小體以膜融合的方式通過胞吐方式主動分泌到細胞外環(huán)境的一種直徑30 ～100nm 的微型囊泡［1］，其形態(tài)規(guī)則，呈圓形或橢圓形杯狀結(jié)構(gòu)，不同類型細胞分泌的外泌體具有很多共性，包括膜上富含脂筏及豐富的跨膜蛋白，如四次跨膜蛋白家族成員CD63、CD81等，表面為類似于細胞膜的脂質(zhì)雙分子層，具有一定的疏水性。外泌體能夠攜帶微小RNA(microRNAs，miRNAs)、RNA、蛋白質(zhì)等生物活性分子，并在細胞外環(huán)境穩(wěn)定存在，而且通過傳遞供體細胞信息，調(diào)節(jié)靶細胞的代謝通路［2］。外泌體可由多種類型細胞分泌，妊娠期母體血清中存在表達胎盤堿性磷酸酶(placental alkaline phosphatase，PLAP)的胎盤來源外泌體［3］，并且在妊娠中發(fā)揮重要的作用。

由于外泌體純化和鑒定技術(shù)的限制，目前只能研究胎盤釋放的所有微型囊泡的混合物對靶細胞的生物學(xué)功能和行為的影響［4］。這種混合物除外泌體，還包括微泡、脫落體、凋亡體等多種類型的囊泡［5］。因此難以確切闡明胎盤外泌體的生物學(xué)作用。目前隨著方法學(xué)的不斷進步，已建立了一些外泌體分離方法，本研究通過對現(xiàn)有的外泌體分離方法進行改良，以期確立高效的胎盤來源外泌體的分離方法。

1 材料與方法

1.1 實驗樣本 取10 例在南京鼓樓醫(yī)院產(chǎn)科正常分娩的足月妊娠女性的血清為實驗樣本。于清晨空腹抽取孕婦肘外周靜脈血3 mL，置于未加抗凝劑的生化管中，靜置30 min，2000×g 離心5 min，吸取血清置于干試管中，-80 ℃保存?zhèn)溆茫?］。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，孕婦及家屬同意參與并簽署知情同意書。

1.2 主要材料與試劑 CD81、CCND1 抗體購自Santa Cruz 公司;CD63 抗體購自Bioworld 公司;PLAP 抗體購自BBI 公司;蛋白酶抑制劑購自Sigma 公司;有酚紅(H1020)/無酚紅(H1025)Hank's 液購自Thermo Fisher 公司;永生化的人妊娠早期絨毛外滋養(yǎng)細胞株(HTR-8/SVneo 細胞)由加拿大皇后大學(xué)Dr Charles H.Graham 饋贈;RPMI 1640 培養(yǎng)液、青鏈霉素和胎牛血清(FBS)等細胞培養(yǎng)試劑購自HyClone 公司。

1.3 方法

1.3.1 母血清胎盤來源外泌體的分離 取儲存于-80 ℃的正常孕婦血清10 份，每份取200 μL，4 ℃下2000×g 離心30 min，取上清，0.22 μm 過濾器過濾，收集濾過液。濾過液中加入1/4 體積的40%PEG6000，混勻后4 ℃孵育過夜，4 ℃下10000×g 離心60 min，0.25 mol/L 蔗糖液懸浮沉淀，進一步蔗糖梯度離心純化，即蔗糖聯(lián)合有/無酚紅Hanks 液制備蔗糖密度梯度(14%、21%、27%、34%、40%)，將各密度層溶液分層吸出，再次使用PEG6000 沉淀，PBS 重懸。

1.3.2 胎盤來源外泌體特異性蛋白分析 純化得到的外泌體沉淀經(jīng)BCA 試劑盒進行蛋白定量，10% SDS-PAGE 膠電泳分離，轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h［7］，分別加外泌體標志分子抗體anti-CD63(1∶1000 稀釋)、anti-CD81 抗體(1∶1000稀釋)及胎盤外泌體特有標記蛋白分子抗體anti-PLAP(1∶1000 稀釋)，4 ℃孵育過夜，二抗室溫避光孵育60 min，ECL 顯影檢測蔗糖密度梯度離心后各密度層的外泌體標志蛋白含量。

1.3.3 外泌體蛋白樣品銀染 SDS-PAGE 膠電泳后，取下膠，進行銀染。固定:40%乙醇，10%冰醋酸。將凝膠板浸入固定液中，固定30 min;水洗:去離子水浸泡3×10 min;致敏:量取75 mL 乙醇，17 g乙酸鈉或三水乙酸鈉，0.5 g 硫代硫酸鈉加去離子水到體積250 mL。將固定后的凝膠浸入致敏液中，浸泡30 min;水洗:去離子水浸泡3×10 min;銀染:0.625 g AgNO3、100 μL 37%甲醛(在使用前加入)加去離子水到終體積250 mL。將膠浸入銀染液中，浸泡30 min;水洗:去離子水浸泡3 次，每次20 s;顯色:6.25 g Na2CO3、50 μL 37%甲醛(在使用前加入)加去離子水到終體積250 m，顯色2 ～15 min，使蛋白各條帶顯示，將凝膠取出;終止:1 g 甘氨酸加去離子水到終體積250 mL，浸泡凝膠10 min，掃膠儀白光下攝片。

1.3.4 透射電鏡鑒定母血清胎盤來源外泌體形態(tài)前固定:將外泌體沉淀用 配制的5%，4 ℃固定2 h;漂洗:用0.1 mol/L 磷酸漂洗液漂洗4 次，每次15 min;后固定:1%4 ℃固定2 h;漂洗:用0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗2 次，每次15 min;快染:2%醋酸鈾水溶液孵育2 h;脫水:50%丙酮孵育15 min;70%丙酮孵育15 min;90%丙酮孵育15 min;100%丙酮孵育15 min;100%丙酮孵育15 min;浸漬:100%丙酮+包埋液(1∶1)室溫孵育1.5 h;100%丙酮+包埋液(1∶2)室溫孵育1.5 h;純包埋液37 ℃孵育3 h;包埋:準備標簽，包埋模具;固化:60 ℃烘箱內(nèi)孵育36 h;切片50 ～60 nm;3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色;透射電鏡觀察，拍片。

1.3.5 動態(tài)光散射(dynamic light scattering，DLS)測定外泌體粒徑及分布 馬爾文激光散射粒度測定儀(Malvern，Nano-ZS90 ZEN3690)是根據(jù)納米顆粒做無規(guī)則布朗運動時，觀測散射光隨時間的波動性得到顆粒布朗運動的速度，并通過斯托克斯-愛因斯坦方程測定粒徑及粒度分布［8］。將樣品用PBS 稀釋成3 ～5 個相差一個數(shù)量級的濃度，添加到樣品池中，打開DTS 軟件，設(shè)置溫度(25 ℃)、溫度平衡時間(70 s)、粘度(0.89 cP)、折射率(1.330)及測量次數(shù)，同一樣本測量3 次，然后進行分析，得到樣品粒徑的平均值以及粒徑大小的分布。

1.3.6 PKH67 熒光染料標記外泌體 PKH67 熒光細胞標記試劑可在細胞膜的脂質(zhì)雙分子層中穩(wěn)定結(jié)合綠色熒光染料，因此常用于標記含有脂質(zhì)雙分子層膜的外泌體［9］。方法參照試劑盒說明書。簡述如下:將分離得到的外泌體沉淀用1mL 試劑盒中稀釋液C 重懸;染色前，準備4×10-6mol/L 的PKH67染液(用稀釋液C 稀釋)置于離心管中;盡快加外泌體到稀釋后的染料中，用吸管均勻快速混合樣品;室溫孵育2 ～5 min，定時輕輕顛倒離心管充分混勻;加入等量1%BSA 孵育1 min 終止染色反應(yīng);為排除FBS 含有的外泌體的影響，通過超聲粉碎FBS 中的外泌體［10］，用等量含超聲粉碎外泌體后血清培養(yǎng)基稀釋終止的反應(yīng)液;100 000×g 離心70 min，去上清;加10 mL 超聲后的完全培養(yǎng)基重懸外泌體沉淀，與HTR-8/SVneo 細胞共孵育6 h;熒光顯微鏡分析HTR-8/SVneo 細胞對外泌體的攝入情況。

2 結(jié) 果

2.1 蔗糖密度梯度聯(lián)合2 次PEG6000 沉淀后各密度層蛋白情況 經(jīng)SDS-PAGE 膠電泳后銀染，各密度層蛋白條帶，Western blot 檢測各密度層外泌體標志性蛋白分子(CD63、CD81)及胎盤特異性標志分子—PLAP 的表達情況，胎盤外泌體的標志蛋白分子主要表達于21%～34%蔗糖密度層，這提示胎盤相關(guān)外泌體主要存在于1.08 ～1.10 g/mL 蔗糖密度層。見圖1。

圖1 蔗糖密度梯度聯(lián)合2 次PEG6000 沉淀后各密度層蛋白情況Figure 1 Protein profiles in different density layers following sucrose gradient centrifugation by 8%PEG6000 precipitation twice

2.2 透射電鏡鑒定胎盤外泌體形態(tài) 透射電鏡鑒定蔗糖密度梯度離心聯(lián)合2 次PEG6000 沉淀分離得到的血清胎盤外泌體形態(tài)，電鏡視野下可見外泌體呈現(xiàn)典型的圓形或橢圓形杯狀結(jié)構(gòu)，直徑為30 ～100 nm。見圖2。

圖2 透射電鏡鑒定胎盤外泌體形態(tài)Figure 2 Transmission electron microscopy of the isolated placental exosomes

2.3 DLS 檢測胎盤外泌體粒徑及分布 外泌體直徑大部分分布于28 ～91 nm 之間［粒徑=(41.79±11.94)nm］。見圖3。

圖3 DLS 檢測胎盤外泌體粒徑及分布Figure 3 Particle size and distribution of the isolated placental exosomes measured by DLS

2.4 PKH67 標記的胎盤來源外泌體進入滋養(yǎng)細胞的情況 為了測定分離得到的胎盤來源外泌體是否保持進入細胞的活性，我們采用PKH67 綠色熒光染料標記血清中胎盤外泌體，觀察外泌體進入HTR-8/SVneo 絨毛外滋養(yǎng)細胞的情況。將PKH67 標記的外泌體與HTR-8/SVneo 絨毛外滋養(yǎng)細胞共孵育6 h，PBS 作陰性對照，4%多聚甲醛固定細胞，核染料DAPI 染色，熒光顯微鏡下觀察外泌體進入HTR-8/SVneo 細胞的情況，Photoshop 軟件對圖像進行融合，外泌體具有進入滋養(yǎng)細胞的活性。綠色熒光顆粒指示PKH67 標記的外泌體。見圖4。

圖4 PKH67 標記的胎盤來源外泌體進入滋養(yǎng)細胞的情況(×400)Figure 4 Fluorescent microscopy of the placental exosomes labeled by PHK67 dye uptake(×400)

3 討 論

妊娠期間胎盤可釋放外泌體到全身循環(huán)系統(tǒng)，參與妊娠期間母胎界面的免疫調(diào)節(jié)［11］、子宮螺旋動脈重塑［12］和胎盤屏障的形成［10］等重要事件調(diào)控，在正常妊娠過程維持中發(fā)揮重要作用。而很多妊娠并發(fā)癥，如子癇前期等胎盤功能紊亂相關(guān)疾病的發(fā)生，很可能與胎盤來源外泌體異常密切相關(guān)。為進一步探究胎盤外泌體在正常妊娠及各種妊娠并發(fā)癥中的作用，必須建立高效的胎盤來源外泌體分離方法。

目前外泌體分離方法主要包括:多步差速離心、蔗糖密度梯度離心、試劑盒沉淀、免疫磁珠分選、色譜法、過濾離心等方法。其中，多步差速離心是制備外泌體的經(jīng)典方法［13］，該方法是根據(jù)外泌體的沉降系數(shù)差速離心將其分離出來，然而妊娠期母血清中除含有胎盤組織釋放的外泌體，還包括許多其他種類細胞釋放的外泌體，如樹突狀細胞、淋巴細胞等［14］，且血清中可能還存在一些大小類似的物質(zhì)混雜其中，這些因素都會影響胎盤來源外泌體的分離純化。目前市面上開發(fā)的外泌體提取試劑盒［15-20］，是根據(jù)外泌體表面由類似于細胞膜的脂質(zhì)雙分子層具有一定疏水性這一特性，用試劑捆綁水分子，從而可通過常規(guī)離心收集沉淀獲取外泌體。這種快速提取外泌體的方法雖簡便快捷、樣本需求少、對設(shè)備要求低，但與差速離心方法類似，其分離得到的沉淀包含其他細胞分泌的囊泡，且血清中含有大量血清蛋白分子，成分復(fù)雜，很可能摻雜一些未知的疏水大分子物質(zhì)。Sabapatha 等［14］曾根據(jù)來源于胎盤的外泌體表面特異表達PLAP 這一特性，使用耦合到磁珠的抗PLAP 抗體，采用磁珠分選方法分離血漿中胎盤來源外泌體。此法雖不需要進行超速離心，適于檢測胎盤外泌體成分，得到的胎盤外泌體具有特異性，但可以提取的胎盤外泌體量少，不適用于大規(guī)模提取制備，且免疫磁珠價格昂貴，不利于提取技術(shù)的普及。

2013 年，Vlassov 等［21］發(fā)表的一篇外泌體的提取方法及組成的專利文獻中介紹，通過終濃度為8%的PEG6000 與生物體液共孵育14 h 后，10 000×g 離心1 h，可將直徑在30 ～150 nm 之間，且包含豐富RNA 的外泌體沉淀下來。因此我們采用終濃度為8%的PEG6000 沉淀血清中的外泌體，為了進一步純化胎盤相關(guān)外泌體，我們將獲得的包含外泌體的沉淀用PBS 重新懸浮后，加入非線性蔗糖密度梯度層，100 000×g 超速離心5 h，將分層液采用PEG6000 進行2 次沉淀。經(jīng)過多次實驗反復(fù)驗證，確定同時表達外泌體標志蛋白分子及胎盤特異性蛋白分子的胎盤來源外泌體所在密度層。

本研究采用蔗糖密度梯度離心聯(lián)合2 次PEG6000 沉淀，試劑價格低廉且易獲得，操作方法簡便，極大地降低了外泌體的提取成本，且獲得的外泌體不僅表達外泌體公認的標志蛋白分子，同時也表達胎盤特異性蛋白分子，證明我們通過這種方法獲得的外泌體是胎盤來源外泌體。

我們通過蔗糖密度梯度離心后得到的外泌體沉淀經(jīng)蛋白質(zhì)SDS-PAGE 膠電泳，銀染后可見各蛋白分子條帶清晰可見，動態(tài)光散射分析粒徑，結(jié)果顯示獲得的外泌體顆粒粒徑大部分分布于28 ～91 nm 之間，與文獻報道外泌體顆粒大小相一致，且分布曲線呈單峰，證明所獲得的外泌體顆粒粒徑分布均一。且胎盤外泌體經(jīng)過PKH67 熒光染料染色后，與細胞共孵育，熒光顯微鏡下觀察外泌體具備進入細胞的活性，進一步驗證了我們應(yīng)用此種改良的分離方法可有效的獲得胎盤來源的外泌體。

本研究通過蔗糖密度梯度離心聯(lián)合2 次PEG6000 沉淀成功分離得到母體血清中胎盤來源外泌體，并從蛋白標志分子、電鏡、粒徑及分布、進入細胞活性四方面對其進行了鑒定，為研究妊娠期間胎盤外泌體在正常妊娠及胎盤源性并發(fā)癥中的作用奠定了基礎(chǔ)。

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