李 楊,蔡海鶯,趙敏潔,李 陽,馮鳳琴

(浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院,馥莉食品研究院,浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江省食品加工技術(shù)與裝備工程中心,浙江杭州 310058)

巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)高效異源表達(dá)脂肪酶研究進(jìn)展

李 楊,蔡海鶯,趙敏潔,李 陽,馮鳳琴*

(浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院,馥莉食品研究院,浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江省食品加工技術(shù)與裝備工程中心,浙江杭州 310058)

脂肪酶作為一種常見的工業(yè)用酶,廣泛應(yīng)用于食品、化妝品等與生活密切相關(guān)的工業(yè)領(lǐng)域,但較高的生產(chǎn)成本和使用成本,在一定程度上限制了其進(jìn)一步應(yīng)用。通過巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)異源表達(dá)系統(tǒng)重組表達(dá)脂肪酶,成為解決限制脂肪酶發(fā)展的方法之一。本文介紹了脂肪酶在P.pastoris表達(dá)系統(tǒng)中的異源表達(dá)及其優(yōu)化策略,并對畢赤酵母表面展示異源脂肪酶的技術(shù)及應(yīng)用進(jìn)行了歸納。

巴斯德畢赤酵母(P.pastoris),脂肪酶,重組表達(dá)優(yōu)化方法,表面展示技術(shù)

脂肪酶(Triacylglycerol acylhydrolases;EC 3.1.1.3)是能在油水界面上水解甘油三酯的一類酶的總稱,主要來源于動物、植物和微生物。脂肪酶可以催化解脂、酯交換、酯化等反應(yīng),使得它在油脂加工、食品、洗滌劑、化妝品等領(lǐng)域有很廣泛的應(yīng)用。例如,隨著配方奶粉的不斷更新,母乳脂肪替代品1,3-油酸-2-棕櫚酸三?；视?OPO)的研制[1]也越來越廣泛,這些結(jié)構(gòu)脂的合成反應(yīng),不僅需要適合反應(yīng)條件的脂肪酶,更需要有較高酶活的脂肪酶。脂肪酶的生產(chǎn)方法主要有3種:提取法、化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法,其中,微生物發(fā)酵法以其較高的得率、較低的成本逐漸成為脂肪酶生產(chǎn)的首選方法。隨著工業(yè)的發(fā)展,對脂肪酶的需求也越來越大,僅僅依靠傳統(tǒng)野生菌株和突變株進(jìn)行發(fā)酵得到的脂肪酶產(chǎn)量,已經(jīng)不能滿足工業(yè)的需要,通過異源表達(dá)系統(tǒng)通常能夠獲得比野生菌更高的脂肪酶產(chǎn)量[2],因此,利用異源表達(dá)系統(tǒng)高水平表達(dá)脂肪酶成為一個(gè)重要的課題。

巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種真核重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)[3],它不僅克服了大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)缺少翻譯后修飾、通常形成包涵體及表達(dá)產(chǎn)量低等缺陷,還克服了釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)分泌效率低、重組菌株不夠穩(wěn)定、表達(dá)質(zhì)粒易丟失等缺陷,并因其獨(dú)特的高表達(dá)、高分泌、高穩(wěn)定性等成為現(xiàn)在應(yīng)用最廣、效果最好的異源蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一[4]。本文從異源表達(dá)脂肪酶的優(yōu)化策略,重組表達(dá)的脂肪酶的分離純化,畢赤酵母表面展示異源脂肪酶的技術(shù)及應(yīng)用等方面介紹了脂肪酶在P.pastoris表達(dá)系統(tǒng)中的異源表達(dá)。

表1 常見微生物脂肪酶在畢赤酵母中的表達(dá)

1 巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)

P.pastoris表達(dá)系統(tǒng)相對于其他異源蛋白表達(dá)系統(tǒng),它具有以下優(yōu)點(diǎn):含有醇氧化酶1(AOX1)基因啟動子,可以通過甲醇誘導(dǎo)進(jìn)行異源蛋白表達(dá),具有表達(dá)可控性;表達(dá)載體上插入的信號肽,可以將表達(dá)的異源蛋白高效地分泌到胞外;自身分泌的蛋白較少,有利于異源蛋白的分離;外源基因可以整合到畢赤酵母的基因組上,因傳代導(dǎo)致外源基因丟失的可能性較小;具有翻譯后修飾功能,如切除信號肽、糖基化修飾等,使異源蛋白更接近天然構(gòu)象,具有高活性;具有誘導(dǎo)型和組成型兩種表達(dá)方式,防止了如毒素等異源蛋白組成型表達(dá)對宿主的危害;培養(yǎng)成本低,畢赤酵母的營養(yǎng)要求低、培養(yǎng)基廉價(jià)、操作簡便。同時(shí),分泌型異源蛋白易被蛋白酶水解、較難表達(dá)具有活性的復(fù)雜蛋白、高密度發(fā)酵易污染成為了限制P.pastoris表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用的最主要因素[5-6]。

P.pastoris表達(dá)系統(tǒng)商業(yè)化已經(jīng)非常成熟。表達(dá)載體按異源蛋白是否分泌可分為胞內(nèi)表達(dá)載體(如pPIC3.5K)[7]和胞外表達(dá)載體(如pPIC9K、pPICZαA);按表達(dá)方式分為誘導(dǎo)型表達(dá)載體(pPIC9K)和組成型表達(dá)載體(pGAPαA)。常用的P.pastoris表達(dá)菌株均來自于對野生型石油酵母Y-11430的突變改造,菌株多為HIS4營養(yǎng)缺陷型突變體,所以可以將組氨酸脫氫酶His4基因作為篩選標(biāo)記基因進(jìn)行重組轉(zhuǎn)化子的篩選。目前常用的表達(dá)宿主 有GS115、X33、KM71[8]、SMD1168[9]。常見的轉(zhuǎn)化方法有4種:原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、電轉(zhuǎn)化法、聚乙二醇(PEG)法和氯化鋰(LiCl)法。其中,電轉(zhuǎn)化法應(yīng)用最普遍、轉(zhuǎn)化效率最高。

2 脂肪酶基因的畢赤酵母表達(dá)

許多微生物脂肪酶已成功地在畢赤酵母中高效表達(dá)(表1)。從表1中可以看出,在畢赤酵母中成功表達(dá)的脂肪酶基因,包括了細(xì)菌、酵母、霉菌來源的不同脂肪酶基因,其中以使用分泌表達(dá)載體采用分泌表達(dá)方式進(jìn)行表達(dá)的居多。

將脂肪酶基因進(jìn)行定向改造或突變后轉(zhuǎn)入畢赤酵母中表達(dá),也是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。對脂肪酶基因進(jìn)行定向改造,可以提高脂肪酶的產(chǎn)量。施碧紅等[20]利用易錯PCR技術(shù)直接對擴(kuò)展青霉目的蛋白的編碼序列進(jìn)行隨機(jī)突變,畢赤酵母異源表達(dá)后篩選得到的重組脂肪酶比活力比異源表達(dá)的重組野生菌株提高了17%。Lin-Cereghino等[21]定點(diǎn)突變α因子分泌信號序列,去除了57～70氨基酸的3級結(jié)構(gòu)α-螺旋,重組脂肪酶在畢赤酵母中的分泌量增加了至少50%。對脂肪酶基因的定向改造還可以得到具有特殊性質(zhì)的脂肪酶,例如現(xiàn)今比較關(guān)注的耐熱性脂肪酶。Yu等[22]在研究華根霉脂肪酶時(shí),通過兩輪易錯PCR引入了平均1～2個(gè)氨基酸,又通過兩輪DNA改組連接了有益的突變體,從而使定向進(jìn)化得到的突變體的Tm值提高了22℃。

脂肪酶基因的定向改造是獲得特殊性質(zhì)脂肪酶的一種方式,而易錯PCR技術(shù)使得這種改造成為可能。P.pastoris表達(dá)系統(tǒng)具有完善的表達(dá)體系,將突變的脂肪酶基因轉(zhuǎn)入P.pastoris表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行成功表達(dá),更加豐富了P.pastoris表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用范圍。

3 脂肪酶的畢赤酵母表達(dá)優(yōu)化策略

3.1 選擇強(qiáng)的啟動子

醇氧化酶1(AOX1)啟動子和3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAP)啟動子分別是畢赤酵母中最常見的誘導(dǎo)型和組成型啟動子。AOX1啟動子主要涉及抑制/去抑制機(jī)理和誘導(dǎo)機(jī)理[23],誘導(dǎo)機(jī)理是以甲醇為誘導(dǎo)物進(jìn)行表達(dá),表達(dá)強(qiáng)度隨著甲醇濃度的不同而不同。GAP 啟動子是在畢赤酵母中克隆得到的組成型啟動子,使用GAP啟動子進(jìn)行表達(dá)的發(fā)酵條件簡單,不需要甲醇誘導(dǎo)及更換碳源,發(fā)酵周期短且產(chǎn)量高[24],還可以避免宿主細(xì)胞中甲醛和過氧化氫的累積。除此之外,FLD1(依賴谷胱甘肽的甲醛脫氫酶)啟動子是以甲醇或甲胺(廉價(jià)無毒的氮源)為碳源或氮源的誘導(dǎo)型啟動子,也是一種能夠帶來高水平表達(dá)的強(qiáng)啟動子。

3.2 基因序列優(yōu)化

基因序列優(yōu)化主要涉及三方面:密碼子優(yōu)化、GC含量優(yōu)化、mRNA二級結(jié)構(gòu)優(yōu)化。

不同物種的基因在密碼子使用上存在著明顯的偏好性,密碼子偏好性對重組蛋白的異源表達(dá)具有深刻復(fù)雜的影響。原始脂肪酶基因在P.pastoris等異源表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)時(shí),往往會導(dǎo)致稀有密碼子的出現(xiàn),而稀有密碼子可能會成為制約翻譯速率的因素。密碼子優(yōu)化的方法主要有三種:改造宿主tRNA,稀有密碼子的替換,選擇同源性較接近的表達(dá)宿主或同源表達(dá)[25]?；騁C 含量通常可對表達(dá)進(jìn)行間接調(diào)控,影響脂肪酶蛋白的表達(dá)量。GC含量的優(yōu)化可以提高mRNA的轉(zhuǎn)錄水平,從而導(dǎo)致脂肪酶表達(dá)量的提高。Yang等[26]在對南極假絲酵母脂肪酶B(CALB)基因進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)和合成時(shí),替換掉了使用不頻繁的稀有密碼子,而且將GC含量控制在45%～55%,優(yōu)化得到的CALB基因在P.pastoris中表達(dá)的酶活及蛋白含量分別為202.4U/mL和149.2mg/L,較原始的CALB基因分別提高了102%和80.2%。

此外,mRNA如果形成大而穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)如發(fā)卡結(jié)構(gòu)和莖環(huán)結(jié)構(gòu),尤其是起始密碼子附近的穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu),將需要更大的能量來打破折疊自由能,這會影響mRNA在翻譯過程中與核糖體的結(jié)合和延伸,從而降低翻譯的效率和蛋白的表達(dá)水平。優(yōu)化mRNA二級結(jié)構(gòu),可以降低翻譯時(shí)所需的能量,從而提高翻譯速率[25]。

3.3 篩選基因拷貝數(shù)合理的轉(zhuǎn)化子

增加目的基因的拷貝數(shù)是提高異源脂肪酶產(chǎn)量的方法之一。通常,隨著基因拷貝數(shù)的增加,同一宿主所表達(dá)的異源蛋白的水平也會提高。但是,基因劑量對異源脂肪酶表達(dá)水平既有正效應(yīng)也有負(fù)效應(yīng),Sha等[27]研究華根霉CCTCCM201021脂肪酶在畢赤酵母中表達(dá)時(shí),發(fā)現(xiàn)基因拷貝數(shù)為5時(shí),脂肪酶酶活在發(fā)酵96h后達(dá)到最高值12500U/mL;而基因拷貝數(shù)增加到6時(shí),酶活96h時(shí)顯著下降到大約2000U/mL。由以上結(jié)果進(jìn)行推測:畢赤酵母表達(dá)重組脂肪酶的能力先隨基因拷貝數(shù)增加而增加,呈正效應(yīng);當(dāng)拷貝數(shù)超過一定數(shù)值時(shí),又呈下降趨勢。盲目地增加基因拷貝數(shù)不一定能達(dá)到優(yōu)化表達(dá)的目的,因此,在選擇增加基因拷貝數(shù)來優(yōu)化表達(dá)時(shí),要先通過實(shí)驗(yàn)確定達(dá)到脂肪酶最高表達(dá)產(chǎn)量的基因拷貝數(shù),以此拷貝數(shù)進(jìn)行優(yōu)化表達(dá)才是合理、有效的。

3.4 信號肽的選擇

為方便異源脂肪酶的提取,應(yīng)采用分泌表達(dá)的方式,而信號肽可以幫助將異源脂肪酶分泌到胞外。異源脂肪酶的分泌表達(dá)可以利用自身的信號肽,或者是利用釀酒酵母的α因子前導(dǎo)肽序列來引導(dǎo)分泌。兩種信號肽在表達(dá)不同的脂肪酶時(shí),會產(chǎn)生不同的效果。Vadhana等[14]的研究表明,使用自身信號肽表達(dá)CALB(南極假絲酵母脂肪酶B)的水平比使用α因子前導(dǎo)肽序列高;但是,使用兩種信號肽表達(dá)CALA(南極假絲酵母脂肪酶A)的水平幾乎相同。所以,針對不同的目的基因,應(yīng)該選擇合適的信號肽,進(jìn)而提高異源脂肪酶的分泌效率。

3.5 脂肪酶前導(dǎo)肽(propeptide)的引入

很多分泌蛋白的N-端都有一個(gè)前導(dǎo)肽,它可以在轉(zhuǎn)入宿主前或轉(zhuǎn)入到宿主后減緩翻譯速度和幫助蛋白質(zhì)正確折疊,所以被認(rèn)為是分泌蛋白的分子內(nèi)伴侶[21]。王樂樂[28]成功克隆了華根霉脂肪酶的前導(dǎo)肽并在畢赤酵母中高效表達(dá),得到的脂肪酶酶活為161U/mL(橄欖油為底物),比野生菌高了約43倍,表明脂肪酶的前導(dǎo)肽對其高效地表達(dá)具有重要的作用。成熟的脂肪酶往往沒有前導(dǎo)肽,這說明前導(dǎo)肽最終會被去除。對前導(dǎo)肽進(jìn)行糖基化修飾可以幫助Kex2蛋白酶去除前導(dǎo)肽,并實(shí)現(xiàn)脂肪酶的分泌[29],這也印證了畢赤酵母異源表達(dá)系統(tǒng)糖基化修飾的重要性。

3.6 優(yōu)化發(fā)酵條件

畢赤酵母作為模式生物,發(fā)酵工藝已經(jīng)十分成熟,主要是針對影響脂肪酶產(chǎn)量的幾個(gè)因素(如誘導(dǎo)時(shí)間、初始pH、甲醇添加量和誘導(dǎo)溫度等)進(jìn)行單因素或者正交實(shí)驗(yàn),探索得到畢赤酵母表達(dá)最高水平的條件[18]。此外,發(fā)酵過程中的含氧量也在很大程度上影響表達(dá)產(chǎn)量。一般是通過通氣、攪拌來增加溶氧;還可以構(gòu)建含有低氧條件誘導(dǎo)表達(dá)的PsADH2啟動子的表達(dá)載體,幫助異源脂肪酶基因在高密度發(fā)酵的低氧條件下高效表達(dá)[30]。

4 重組表達(dá)的脂肪酶的分離純化

在研究脂肪酶的基本性質(zhì),如分子量大小、反應(yīng)溫度、反應(yīng)pH及對有機(jī)溶劑等的耐受性時(shí),往往需要對脂肪酶進(jìn)行一系列純化來得到純度較高的脂肪酶(一般電泳圖為單一條帶)。通常的純化做法是通過離心發(fā)酵液去除細(xì)胞,不同飽和度的硫酸銨沉淀脂肪酶,重溶沉淀后透析,超濾濃縮酶液,最后通過離子交換層析(Q-Sepharose FF陰離子交換柱或DEAE-Sepharose FF陰離子交換柱等)、凝膠柱層析(Superdex 200或75)等步驟進(jìn)行純化[31-32]。在各個(gè)步驟中間,如果有需要,還可以通過冷凍干燥來脫除水分達(dá)到濃縮的目的,而且凍干后的酶粉比較利于保存。

上述方法不僅可以純化異源表達(dá)的脂肪酶,而且也普遍適用于直接發(fā)酵得到的脂肪酶。對于畢赤酵母異源表達(dá)的脂肪酶的純化,還可以使用鎳柱親和層析法。一般在構(gòu)建畢赤酵母表達(dá)載體時(shí),會在目的蛋白序列下游添加His-Tag序列片段,表達(dá)的脂肪酶中會帶有His-Tag,它可以和Ni2+產(chǎn)生螯合作用而被吸附,所以可以通過金屬螯合層析法純化脂肪酶[17,33]。對于異源表達(dá)的脂肪酶,使用鎳柱親和層析法,是比較簡便快捷的純化方法。

5 畢赤酵母表面展示異源脂肪酶

表面展示技術(shù)是將靶蛋白基因與載體蛋白基因融合,實(shí)現(xiàn)二者在微生物表面融合表達(dá)并保持靶蛋白生物活性的技術(shù),是Smith于1985 年首先提出并逐步發(fā)展起來的[34]。酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)是一種真核蛋白表達(dá)系統(tǒng),其基本原理是將外源靶蛋白基因與特定的載體基因序列融合后導(dǎo)入酵母細(xì)胞,融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)后,信號肽引導(dǎo)融合蛋白向細(xì)胞外分泌。由于融合蛋白含有錨定酵母細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu),可將融合蛋白錨定在酵母細(xì)胞壁中,從而將外源蛋白分子表達(dá)在酵母細(xì)胞表面。目前以釀酒酵母展示系統(tǒng)發(fā)展較為完善,主要分為凝集素系統(tǒng)和絮凝素系統(tǒng),凝集素系統(tǒng)又分為α凝集素系統(tǒng)(其N端與目的蛋白融合)和a凝集素系統(tǒng)(其C端與目的蛋白融合);絮凝素系統(tǒng)分為糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定系統(tǒng)(其N端與目的蛋白融合,FS)和絮凝結(jié)構(gòu)域錨定系統(tǒng)(目的蛋白的N端與Flo1蛋白的絮凝功能區(qū)融合,FL)[35-38]。

Su等[33]將釀酒酵母細(xì)胞壁錨定蛋白Sed1p序列與CALB序列融合在一起,融合蛋白轉(zhuǎn)化進(jìn)入畢赤酵母中表達(dá)并成功地在其表面得到展示,畢赤酵母表面展示的CALB在60℃保溫2h后酶活下降了43%,而游離的CALB在同樣溫度下保溫10min后酶活就僅剩余15%,這說明,畢赤酵母表面展示的脂肪酶的熱穩(wěn)定性比游離脂肪酶高。畢赤酵母表面展示的脂肪酶較多地應(yīng)用于全細(xì)胞催化生產(chǎn)生物柴油(主要成分為脂肪酸甲酯)。Huang等[39]將米黑根毛霉脂肪酶(RML)展示在畢赤酵母表面,作為催化劑用來催化大豆油和甲醇生產(chǎn)生物柴油,重復(fù)使用10次后仍能保持80.46%的酶活;Jin[40]在研究生物柴油的生產(chǎn)時(shí),混合使用了畢赤酵母表面展示的sn-1,3專一性脂肪酶RML和無專一性的CALB,提高了1,2-甘油二酯轉(zhuǎn)化成1,3-甘油二脂或者2-單脂肪酸甘油酯轉(zhuǎn)化成3-單脂肪酸甘油酯的轉(zhuǎn)化速度,使脂肪酸甲酯的含量顯著增加,從反應(yīng)20h獲得80%提高到反應(yīng)16h獲得91.2%。利用酵母表面展示技術(shù)和畢赤酵母表達(dá)體系構(gòu)建的脂肪酶全細(xì)胞催化劑,因其特有的耐受性、穩(wěn)定性和高催化活性,已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于生物柴油的生產(chǎn),同時(shí)也涉及風(fēng)味酯的合成[35]。

6 展望

畢赤酵母表達(dá)的異源蛋白種類很多,單就酶而言,就涉及脂肪酶、蔗糖酶、幾丁質(zhì)酶、溶菌酶等,其中,脂肪酶及其表面展示的全細(xì)胞催化劑的研究較為豐富。宏基因組文庫中含有大量的未能培養(yǎng)的脂肪酶基因,利用畢赤酵母異源表達(dá)宏基因組文庫中脂肪酶基因的應(yīng)用也越來越廣泛[41]。

畢赤酵母表達(dá)的異源脂肪酶,很多僅限于應(yīng)用在非食品工業(yè),但是食品工業(yè)中很多營養(yǎng)物質(zhì)及添加劑(如代可可脂、OPO)的生產(chǎn),都離不開脂肪酶的催化。所以,驗(yàn)證畢赤酵母表達(dá)的異源脂肪酶具有遺傳穩(wěn)定性及食用安全性,成為現(xiàn)今要解決的迫切問題。相信具備食用安全性的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng),不僅能擴(kuò)展畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用,而且可以促進(jìn)食品工業(yè)的發(fā)展。

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Research progress in heterologous expression of lipase genes inPichiapastoris

LI Yang,CAI Hai-ying,ZHAO Min-jie,LI Yang,FENG Feng-qin*

(Zhejiang University,College of Biosystems Engineering and Food Science,Fuli Institute of Food Science,Zhejiang Key Laboratory for Agro-Food Processing,Zhejiang R & D Center for Food Technology and Equipment,Hangzhou 310058,China)

Lipase,as a common industrial enzyme is widely used in food,cosmetics and other industrial fields which are closely related to our daily life. However,the high cost of its production and usage limits the further application to a certain extent. Heterologous expression of lipase genes inPichiapastorishas become one of the methods to resolve this problem. This review introduced the heterologous expression of lipase genes inPichiapastorisand the corresponding optimization strategies. Finally,the technology of lipase displaying onP.pastorissurface and its applications were summarized.

Pichiapastoris;lipase;optimization strategies of recombinant expression;surface display technology

2014-07-14

李楊(1989-)，女，碩士研究生，研究方向：微生物脂肪酶發(fā)酵及性質(zhì)研究。

*通訊作者:馮鳳琴(1964-)，女，博士，教授，研究方向：食品生物技術(shù)。

浙江省重大科技專項(xiàng)(2012C12005-2)；浙江省植物食品加工技術(shù)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(2010R50032)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)07-0377-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.071