劉志強(qiáng)，柯江維，樂萍，段榮

(江西省兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌330006)

近幾年,隨著多藥聯(lián)合強(qiáng)化治療的實(shí)施，兒童急性淋巴細(xì)胞白血病 (acute lymphoblastic leukaemia,ALL)的長期無病存活率明顯提高,部分發(fā)達(dá)國家已達(dá)90%[1],但仍有患兒復(fù)發(fā)死亡。如何防止復(fù)發(fā)、避免不必要的過度化療一直是兒科血液腫瘤研究者期待解決的問題。近年來大量相關(guān)研究提出,ALL復(fù)發(fā)的主要原因之一是白血病誘導(dǎo)化療完全緩解后,在體內(nèi)殘留微量白血病細(xì)胞,即微小殘留病變(minimal residual disease，MRD)[2]。 目前適合MRD檢測的方法只有聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)和流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)[3]。本研究應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR(realtime quantitative PCR，RQ-PCR),對 153例 ALL患兒化療前、誘導(dǎo)化療結(jié)束及強(qiáng)化治療末期骨髓樣本的MRD進(jìn)行監(jiān)測,以評(píng)估其在預(yù)測復(fù)發(fā)、指導(dǎo)個(gè)體化治療方面的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2010年3月-2014年6月期間江西省兒童醫(yī)院血液科病房收治的376例急性淋巴細(xì)胞白血病患兒資料，其中男151例，女225例，中位年齡5.4歲(1.6月～14歲)。所有患兒均經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)-免疫學(xué)-細(xì)胞遺傳學(xué)-分子遺傳學(xué)(MICM)進(jìn)行診斷及分型。從誘導(dǎo)化療結(jié)束為完全緩解后開始列入隨訪，平均隨訪時(shí)間28月(10～41月)。

1.2 治療方案 按2006年中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)血液學(xué)組兒童ALL診療建議(第三次修訂草案)[4]及2010年全國兒童ALL臨床路徑方案進(jìn)行治療。以誘導(dǎo)化療結(jié)束骨髓涂片檢查時(shí)原幼淋巴細(xì)胞＜5%為骨髓完全緩解?；熐熬颜鞯没純杭覍俚闹橥?。

1.3 標(biāo)本采集 分別于治療前、誘導(dǎo)化療結(jié)束后、強(qiáng)化治療后抽取骨髓肝素抗凝標(biāo)本2ml。

1.4 融合基因檢測

1.4.1 總RNA提取 將抽取的骨髓標(biāo)本經(jīng)Ficoll Hypaque淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心分離單個(gè)核細(xì)胞。用RNA Isolation Kit(Promega SV Total RNA Isolation System購自美國Promega公司)提取總RNA。

1.4.2 cDNA合成 反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系(試劑購自大連寶生物有限責(zé)任公司):(1)5×Prime ScriptTMBuffer(for Real Time)2μl;(2)Prime ScriptTMRT Enzyme MixⅠ0.5μl;(3)Oligo(dT)Primer(50μmol·L-1)0.5μl;(4)Random 6 mers(100μmol·L-1)2μl;(5)Total RNA 1μg;(6)RNase Free雙蒸水 (dH2O)補(bǔ)充至反應(yīng)體系10μl。 反應(yīng)條件:37℃ 15 min，85 ℃ 5s。cDNA 產(chǎn)物置于-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 引物設(shè)計(jì)和合成 各融合基因及ABL內(nèi)參基因的引物及探針均選用歐洲抗癌項(xiàng)目組公布的序列。引物及探針均由大連寶生物工程有限公司合成。各融合基因的引物序列見表1。

1.4.4 qRT-PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)采用TaqMan探針法，在熒光定量PCR儀(ABI PRISM 7500)上檢測，同時(shí)擴(kuò)增內(nèi)參ABL，每個(gè)標(biāo)本做2個(gè)復(fù)孔。定量PCR反應(yīng)體系采用 “白血病相關(guān)融合基因檢測試劑盒(ALL 9種)(核酸擴(kuò)增熒光定量法)(上海源奇生物醫(yī)藥科技有限公司)。

表1 RQ-PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 TEL/AML1、BCR/ABL、E2A/PBX1、MLL/AF4 四種融合基因的檢測 所有標(biāo)本均經(jīng)RQ-PCR檢測，每例標(biāo)本最多只存在1種異常融合基因。376例ALL患兒中融合基因陽性共153例，其中TEL/AML1陽性 91例 (24.2%)，BCR/ABL陽性 26例(6.9%)，E2A/PBX1 陽性 27(7.2%)，MLL/AF4 陽性 9(2.4%)。

2.2 治療反應(yīng)及療效觀察 在不同時(shí)期對融合基因陽性兒童進(jìn)行監(jiān)測，詳見表2。TEL/AML1陽性組誘導(dǎo)化療結(jié)束有13(14.3%)例融合基因未轉(zhuǎn)陰，強(qiáng)化治療末仍有2(2.2%)例融合基因未轉(zhuǎn)陰，隨訪期間無復(fù)發(fā)；BCR/ABL陽性組誘導(dǎo)化療結(jié)束有19(73.1%)例融合基因未轉(zhuǎn)陰，強(qiáng)化治療末仍有9(34.6%)例融合基因未轉(zhuǎn)陰，隨訪中有5例(19.2%)復(fù)發(fā)，2(7.7%)例死亡；E2A/PBX1陽性組誘導(dǎo)化療結(jié)束有8(29.6%)例融合基因未轉(zhuǎn)陰，強(qiáng)化治療期末仍有4(14.8%)例融合基因未轉(zhuǎn)陰，隨訪中1例(3.7%)復(fù)發(fā)；MLL/AF4陽性組誘導(dǎo)化療結(jié)束有6(66.7%)例融合基因未轉(zhuǎn)陰，強(qiáng)化治療末仍有3(33.3%)例融合基因未轉(zhuǎn)陰，隨訪中有2例(22.2%)復(fù)發(fā)，1(11.1%)例死亡。見表2。

3 討論

MRD是指白血病患者經(jīng)誘導(dǎo)緩解治療達(dá)到臨床緩解后，其體內(nèi)殘存的用形態(tài)學(xué)方法無法檢出的微量白血病細(xì)胞，這些殘存的白血病細(xì)胞是患者復(fù)發(fā)的根源[5]。MRD檢測有較高的敏感性，為治療效果的評(píng)估提供了更加直接、客觀的依據(jù)。目前以MRD風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估為基礎(chǔ)的治療方案的臨床試驗(yàn)表明，以MRD為指導(dǎo)的治療可能成為今后ALL的治療標(biāo)準(zhǔn)[6]。

以PCR方法檢測白血病融合基因是目前常用的MRD檢測方法，敏感度可達(dá)10-6數(shù)量級(jí)。以融合基因作為標(biāo)志物的優(yōu)點(diǎn)是初發(fā)時(shí)所檢測到的融合基因在治療過程中不會(huì)發(fā)生進(jìn)一步的改變，可以在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行監(jiān)測[7]。TEL/AML1、BCR/ABL、E2A/PBX1、MLL/AF4 是 ALL 中最常見的四種融合基因，已經(jīng)成為兒童ALL從診斷到治療的常用的檢測項(xiàng)目。

表2 各組患兒的治療反應(yīng)

急性淋巴細(xì)胞白血病患兒體內(nèi)t(12;21)染色體結(jié)構(gòu)異常,將導(dǎo)致12p12的TEL基因與21q22的AML基因發(fā)生融合,最終形成TEL-AML1融合基因。TEL-AML1是兒童ALL中最常見的融合基因。在我院兒童ALL的樣本研究中，TEL-AML1融合基因陽性患兒占24.2%，這與其他研究中心的結(jié)果接近[8]。大多數(shù)研究認(rèn)為，TEL/AML1陽性是兒童ALL預(yù)后好的標(biāo)志[9]，史利歡等[10]最近的研究指出，TEL／AML1陽性兒童ALL臨床總有效率高于TEL/AML1陰性兒童ALL。本研究中發(fā)現(xiàn)大多數(shù)TEL/AML1陽性患兒對化療敏感度高，CR期長，前期隨訪無復(fù)發(fā)。

9號(hào)染色體和22號(hào)染色體易位形成的BCR/ABL融合基因是慢性髓系白血病的特征性標(biāo)志，在兒童ALL中的陽性僅有3%～5%[11]，我院兒童ALL的樣本研究中，BCR/ABL融合基因陽性患兒占6.9%，比例偏高，與Na等[12]相近。BCR/ABL融合基因陽性ALL是一類高度異質(zhì)惡性疾病，該類疾病容易合并中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病，緩解率低，復(fù)發(fā)率高，預(yù)后極差，BCR/ABL融合基因陽性的ALL患者中位生存期為6～10個(gè)月[13]。本研究中BCR/ABL融合基因陽性患兒在誘導(dǎo)化療結(jié)束有73.1%未轉(zhuǎn)陰，強(qiáng)化治療末仍有34.6%未轉(zhuǎn)陰，且隨訪中有19.2%的患兒復(fù)發(fā)，7.7%的患兒死亡，與文獻(xiàn)報(bào)道相符。

兒童ALL中t(1;19)(q23;p13)易位，即19p13的E2A和1q23上的PBX1易位融合，形成E2A/PBX1融合基因，比例約為5%[14]。在我院兒童ALL的樣本研究中，E2A/PBX1融合基因陽性患兒占7.1%，比文獻(xiàn)偏高，可能是樣本量偏少所致。已往認(rèn)為，該融合基因陽性ALL患兒對化療的反應(yīng)差，且預(yù)后不佳，近年來通過對化療強(qiáng)度的提高，預(yù)后得到了明顯改善[15]，本研究亦證實(shí)E2A/PBX1融合基因陽性患兒化療敏感性較高，早期復(fù)發(fā)率低。

混合譜系白血病MLL基因位于11q23，MLL基因重排是造血系統(tǒng)惡性腫瘤中常見的遺傳學(xué)改變，在兒童ALL中發(fā)生率約為 6%[16]，目前發(fā)現(xiàn)MLL基因易位重排類型有60多種，其最常見的是MLL/AF4。過去研究發(fā)現(xiàn)此類ALL大多惡性程度高，常規(guī)化療反應(yīng)差，生存期短[17]，孫豫蘭等[18]研究發(fā)現(xiàn)，MLL-AF4融合基因陽性患兒完全緩解率和5年EFS都顯著低于非MLL-AF4患兒。本研究亦證實(shí)MLL-AF4融合基因陽性患兒化療敏感性低，早期復(fù)發(fā)率高22.2%。

遺傳學(xué)異常在兒童ALL中有很強(qiáng)的預(yù)后因素。不同類型白血病可有不同的融合基因，同一種類型白血病具有不同的融合基因，其療效和預(yù)后亦不相同。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)可以有效地檢測出白血病常見融合基因并進(jìn)行定量分析，為指導(dǎo)治療、判斷預(yù)后提供重要依據(jù)，尤其是檢測MRD水平的應(yīng)用，對臨床白血病患者的個(gè)體化治療發(fā)揮越來越重要的作用。隨著全基因組掃描技術(shù)的廣泛應(yīng)用，將可能為MRD檢測發(fā)現(xiàn)更多的遺傳標(biāo)志，服務(wù)于臨床。此外，近十年提出殘留的白血病干細(xì)胞(leukemia stem cells,LSCs)是疾病復(fù)發(fā)的根源[19]，分子生物學(xué)技術(shù)在白血病化療后監(jiān)測中的運(yùn)用將更為廣泛，地位將更為突出。

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