楊軍平，田昌隆

(江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南 昌330006)

目前原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌是我國(guó)城市當(dāng)中發(fā)病率最高的惡性腫瘤，其發(fā)病率呈不斷上升趨勢(shì)[1，2]。該病病因至今尚未完全明確，目前認(rèn)為吸煙是其最重要的高危因素，由于煙草中多鏈芳香烴類(lèi)化合物和亞硝胺可通過(guò)多種機(jī)制導(dǎo)致支氣管上皮細(xì)胞DNA損傷，使得癌基因激活和抑癌基因失活或表達(dá)下降從而導(dǎo)致細(xì)胞分裂失控，細(xì)胞粘附性下降，最終癌變，因此研究細(xì)胞粘附因子對(duì)攻克腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)具有重要的意義。 已有研究表明，T-cadherin表達(dá)的下調(diào)與肝癌、結(jié)腸癌、宮頸癌和鼻咽癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有關(guān)[3-7]，但是該基因的表達(dá)下調(diào)是否與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有關(guān)尚無(wú)定論。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料來(lái)源 本實(shí)驗(yàn)選用非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本50例全部來(lái)自于2011年6月至2013年9月在江西省中醫(yī)院胸外科進(jìn)行非小細(xì)胞肺癌根治術(shù)的患者。術(shù)后將腫瘤及周邊組織石蠟包埋。

1.1.2 臨床資料 實(shí)驗(yàn)組非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本50例，組織標(biāo)本全部來(lái)自于江西省中醫(yī)院胸外科非小細(xì)胞肺癌患者手術(shù)切除的標(biāo)本，所有患者術(shù)前均未接受過(guò)放療或化療，手術(shù)患者均病理診斷為非小細(xì)胞肺癌，按組織學(xué)分型為鱗狀細(xì)胞癌占32例，腺癌16例，腺鱗癌2例，男性39例，女性11例，患者年齡分布從42.5歲至73.2歲，平均年齡61.4歲。標(biāo)本取自肉眼可見(jiàn)腫瘤區(qū)(未壞死)。

非小細(xì)胞肺癌的腫瘤病理分期標(biāo)準(zhǔn):結(jié)合有關(guān)腫瘤、附近淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移的信息，而分期用來(lái)指特定的TNM分組。分組分期使用數(shù)字0和羅馬數(shù)字ⅠⅡⅢⅣ來(lái)描述。T代表腫瘤(其大小以及在肺內(nèi)和鄰近器官的擴(kuò)散程度)，N代表淋巴結(jié)擴(kuò)散，M表示轉(zhuǎn)移(擴(kuò)散到遠(yuǎn)處器官)。對(duì)照組(1)癌旁正常肺組織50例，取距離同一實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織邊緣5cm以上的遠(yuǎn)癌正常肺組織為對(duì)照。對(duì)照組(2)良性病變肺組織20例，組織標(biāo)本取自江西省中醫(yī)院胸外科2011年6月至2013年9月間8例肺結(jié)核球、10例支氣管擴(kuò)張、2例肺錯(cuò)構(gòu)瘤患者手術(shù)切除的肺組織。

1.1.3 主要試劑 兔抗人T-cadherin多克隆抗體(I抗)，購(gòu)自美國(guó) eBioscience公司。DAB顯色試劑盒購(gòu)自于上海波谷生物科技有限公司；羊抗兔Ⅱ抗、0.1 M 磷酸鈉、0.25 M NaCl(pH7.6)和 15 mg/ml BSA購(gòu)自生興生物技術(shù)(南京)有限公司。即用型免疫組化S-P試劑盒購(gòu)自于上海倍尼菲生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 調(diào)查、收集臨床資料 查閱病歷，收集患者年齡、腫瘤大小、組織類(lèi)型、組織分級(jí)、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等全部資料并錄入SPSS19.O軟件數(shù)據(jù)庫(kù)。所有標(biāo)本切片請(qǐng)江西省中醫(yī)院病理科有經(jīng)驗(yàn)的主任醫(yī)師指導(dǎo)復(fù)查。

1.2.2 按常規(guī)方法進(jìn)行玻片處理及切片制備。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)方法 組織切片按常規(guī)方法進(jìn)行脫蠟水化后，用0.03%H2O2在室溫條件下處理15～30 min，以封閉內(nèi)源性過(guò)氧化酶的活性，然后通過(guò)煮沸法進(jìn)行抗原修復(fù)，再采用兔抗人T-cadherin多克隆抗體為一抗進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，具體方法如下：先滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育10min，甩去多余液體，滴加預(yù)稀釋I抗(兔抗人T-cadherin多克隆抗體，工作濃度1:100)50μl，將組織切片放入4℃冰箱中保存過(guò)夜(PBS液替代I抗作陰性對(duì)照)，取出組織切片37℃下復(fù)溫30min，用PBS液沖洗5min，重復(fù)3次，擦干組織周?chē)鷼埩舻腜BS液后，再滴加生物素標(biāo)記的Ⅱ抗，室溫靜置1h，PBS液沖洗5min，重復(fù)3次，滴加HRP標(biāo)記鏈親和素(辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素)，室溫靜置15min，PBS液沖洗5min，重復(fù)3次，擦干殘留的PBS，最后在暗室中取1ml去離子水，分別滴加DAB顯色試劑盒中A、B、C試劑各一滴，混勻后立即滴加切片，置暗盒中室溫下顯色，顯微鏡下控制顯色反應(yīng)時(shí)間約3min，蒸餾水終止反應(yīng)，用自來(lái)水充分沖洗10min后，蘇木精復(fù)染1min，流水沖洗返藍(lán)2 min，0.5%鹽酸酒精分化2s，流水沖洗2min，遞升梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，鏡下觀察。

1.2.4 結(jié)果判定 T-cadherin的免疫組化染色以細(xì)胞膜及胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒者為陽(yáng)性染色。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照Bames[8]等提出的基于3個(gè)參數(shù)的半定量計(jì)數(shù)方法，即染色強(qiáng)度、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和兩者記分的乘積。染色強(qiáng)度計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)為:無(wú)色為0分，淺黃色為1分，中度著色為2分，深棕黃色為3分。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)為:100倍光鏡下任意選取10個(gè)視野，200倍光鏡下觀察每一視野，連續(xù)觀察計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，記錄其中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行評(píng)分，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)后從0到4評(píng)分:0分:＜10%陽(yáng)性細(xì)胞數(shù);1分:11%~30%陽(yáng)性細(xì)胞數(shù);2分:31%~50%陽(yáng)性細(xì)胞數(shù);3分:51%~75%陽(yáng)性細(xì)胞數(shù);4分:＞76%陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。兩者相乘計(jì)分之積為最后得分:0分為(-)，1~2分為(+)，3~4 分為(++)，大于 4 分為(+++)。評(píng)分(-)和(+)視為T(mén)-cadherin陰性表達(dá)，(++)和(+++)視為 T-cadherin陽(yáng)性表達(dá)。如在同一標(biāo)本中存在多個(gè)不同評(píng)分的視野，則取最大值和最小值的平均值做為免疫組化評(píng)分。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析處理，組間陽(yáng)性率的比較及陽(yáng)性率與臨床病理特征之間的相關(guān)性分析用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 T-cadherin在非小細(xì)胞肺癌組織、癌周組織和良性病變肺組織中的表達(dá) 在50例非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本中，T-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率為20%(10/50),對(duì)照組1含50例癌周組織標(biāo)本，T-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率為62%(31/50)，對(duì)照組2含20例良性病變標(biāo)本，T-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率為65%(13/20)(見(jiàn)表1)，非小細(xì)胞肺癌組織、癌周5cm外的正常肺組織及良性肺腫瘤組織率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。T-cadherin在非小細(xì)胞肺癌組織中的細(xì)胞免疫組化染色后的鏡下形態(tài)見(jiàn)圖1所示。

圖1 T-cadherin在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)(免疫組化染色結(jié)果，左圖為陰性，右圖為陽(yáng)性，×200倍視野)

表1 T-cadherin在非小細(xì)胞肺癌組織、癌周組織和良性病變肺組織中的表達(dá)情況(%)

2.2 T-cadherin基因在有無(wú)肺門(mén)和/或縱膈淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá) 表2所示為按有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(肺門(mén)和/或縱膈淋巴結(jié))來(lái)分析T-cadherin的表達(dá)情況，其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌組織中T-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率為4.17%，而無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌組織中T-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率為34.6%。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌組織與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌組T-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 T-cadherin基因在有無(wú)肺門(mén)和/或縱膈淋巴轉(zhuǎn)移非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)情況

2.3 基于臨床病理特性分型的T-cadherin的表達(dá)表3所示為按照TNM分期來(lái)分析，TNM分期I期非小細(xì)胞肺癌組織中T-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率為70%，TNM分期Ⅱ期非小細(xì)胞肺癌組織中T-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率為10.5%，TNM分期Ⅲ及IV期非小細(xì)胞肺癌組織中T-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率為4.76%。兩兩比較，TNM分期I期非小細(xì)胞肺癌組織與TNM分期Ⅱ期非小細(xì)胞肺癌組織中T-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。TNM分期Ⅱ期非小細(xì)胞肺癌組織與TNM分期Ⅲ及IV期非小細(xì)胞肺癌組織中T-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表3 T-cadherin基因在各TNM分期的非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)情況

2.4 T-cadherin基因在不同分化程度的非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá) 表4所示為按腫瘤組織分化程度來(lái)分析，將其分高中分化組和低分化組。高中分化的非小細(xì)胞肺癌組織中T-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率為19.23%，而低分化的非小細(xì)胞肺癌組織中T-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率為20.83%。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，高中分化的非小細(xì)胞肺癌組織與低分化的非小細(xì)胞肺癌組織中T-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表4 T-cadherin基因在不同分化程度的非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)情況

2.5 T-cadherin基因在各組織學(xué)分型的非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá) 表5所示為按病理學(xué)分類(lèi)分析，由于鱗腺癌樣本只有兩例，且無(wú)陽(yáng)性表達(dá)，統(tǒng)計(jì)誤差可能過(guò)大，暫不將鱗腺癌做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，鱗狀細(xì)胞癌組織中T-cadherin分子陽(yáng)性表達(dá)率為9.38%(3/32)，而腺癌組織中T-cadherin分子陽(yáng)性表達(dá)率為43.75%(7/16)。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，鱗狀細(xì)胞癌與腺癌中T-cadherin分子陽(yáng)性表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P<0.05)。

3 討論

細(xì)胞黏附分子(Cell adhesion molecule，CAM)是介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)相互接觸和結(jié)合的一類(lèi)糖蛋白分子[9-11]，Cadherin家族成員主要包括 E-cadherin、N-cadherin、P-cadherin、T-cadherin[12，13]。正常細(xì)胞在cell adherin的作用下發(fā)生黏附，從而不易脫落和轉(zhuǎn)移，但當(dāng)Cadherin表達(dá)下降時(shí)，細(xì)胞的黏附力會(huì)下降，從而導(dǎo)致細(xì)胞的移動(dòng)[14-16]。T-cadherin表達(dá)的下調(diào)與腫瘤的發(fā)生已經(jīng)被廣泛的接受了，但是T-cadherin表達(dá)的下調(diào)是否與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有關(guān)尚無(wú)定論。本研究探討了非小細(xì)胞肺癌組織、癌周組織和良性病變肺組織中T-cadherin表達(dá)水平，并從有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，TNM分期，病理學(xué)分類(lèi)及分化程度四個(gè)因素來(lái)分別討論，以期發(fā)現(xiàn)T-cadherin在非小細(xì)胞肺癌患者中的表達(dá)及其惡性生物學(xué)特征關(guān)系。

表5 T-cadherin基因在各組織學(xué)分型的非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)情況

從本研究中可以看到，非小細(xì)胞肺癌組織、癌周5cm外的正常肺組織、肺結(jié)核球、支氣管擴(kuò)張、錯(cuò)構(gòu)瘤肺組織中的T-cadherin表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)正常肺組織、癌周組織、肺結(jié)核球、支氣管擴(kuò)張、錯(cuò)構(gòu)瘤肺組織中絕大多數(shù)細(xì)胞均呈強(qiáng)陽(yáng)性或陽(yáng)性染色，細(xì)胞漿內(nèi)不染色，而在肺腺癌組織中腫瘤細(xì)胞呈黃色到棕黃色染色，且染色數(shù)量較前明顯減少。非小細(xì)胞肺癌組織、癌周5cm外的正常肺組織及良性肺腫瘤組織率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。我們推論腫瘤組織與癌周正常組織中T-cadherin表達(dá)的顯著差別，可能與兩者間細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力差別存在一定的相關(guān)性。T-cadherin分子是細(xì)胞外的黏蛋白分子，其水平下降可以導(dǎo)致細(xì)胞黏附力下降，從而細(xì)胞移動(dòng)、轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。這與以往相關(guān)研究結(jié)果相似。

非小細(xì)胞肺癌組織與良性肺病變組織中的T-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。良性病變與惡性腫瘤間最重要的差異是轉(zhuǎn)移能力，我們推測(cè)T-cadherin表達(dá)的下降與腫瘤細(xì)胞的惡變存在密切聯(lián)系。

良性肺病變組織中及癌周正常組織中T-cadherin表達(dá)則基本相似，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，由此推論由于癌周組織和良性病變組織細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力弱，而肺腫瘤細(xì)胞有明顯的遷移能力，而T-cadherin分子正是細(xì)胞黏附分子的一員，其表達(dá)的下降導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)，而在非腫瘤細(xì)胞中則無(wú)這種情況。

本研究還揭示了T-cadherin在有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的表達(dá)差異。無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞之間可能通過(guò)T-cadherin的作用而發(fā)生黏附,不易脫落,而有肺門(mén)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或縱膈淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞T-cadherin表達(dá)下降，因細(xì)胞間的黏附力減弱,易引起腫瘤細(xì)胞沿淋巴管轉(zhuǎn)移到附近淋巴結(jié)。T-cadherin表達(dá)下降，使腫瘤細(xì)胞黏附性下降，細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)，因此更容易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

T-cadherin與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移有著密切的聯(lián)系，可能扮演抑癌基因的角色。從實(shí)驗(yàn)中我們可以看到，TNM分期I期非小細(xì)胞肺癌組織中T-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率最高，I期非小細(xì)胞肺癌沒(méi)有肺內(nèi)轉(zhuǎn)移及肺外轉(zhuǎn)移，Ⅱ期非小細(xì)胞肺癌侵犯臟層胸膜或者出現(xiàn)轉(zhuǎn)移到同側(cè)支氣管周?chē)蛲瑐?cè)肺門(mén)和肺動(dòng)脈淋巴結(jié)，其細(xì)胞T-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率已經(jīng)有明顯下降，而TNM分期Ⅲ及IV期非小細(xì)胞肺癌已經(jīng)有明顯轉(zhuǎn)移灶出現(xiàn)，推測(cè)T-cadherin表達(dá)下降，使腫瘤細(xì)胞黏附性下降，細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)，因此更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。

按腫瘤組織分化程度來(lái)分析，高分化的非小細(xì)胞肺癌組織與低分化的非小細(xì)胞肺癌組織中T-cadherin陽(yáng)性表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。就實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，鱗癌與腺癌中的分化高低與T-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率無(wú)相關(guān)性。按病理學(xué)分類(lèi)分析，鱗癌與腺癌組織中T-cadherin陽(yáng)性表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。我們推測(cè)這與鱗癌細(xì)胞間有橋粒聯(lián)接，張力微絲附著有關(guān)。鱗癌其生長(zhǎng)速度較慢，因此轉(zhuǎn)移較晚。而腺癌出現(xiàn)轉(zhuǎn)移則較早出現(xiàn)。

綜上所述，在非小細(xì)胞肺癌患者中，T-cadherin的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)性。非小細(xì)胞肺癌組織中T-cadherin表達(dá)下調(diào)與腫瘤TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性。腺癌發(fā)生與T-cadherin表達(dá)下調(diào)存在相關(guān)性。

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