曾曉明，鄭九生，龔維

(江西省婦幼保健院產(chǎn)科，江西 南昌330006)

乙型肝炎病毒(HBV)感染已成為全世界重大公共衛(wèi)生問題，與各種肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，我國乙肝病毒慢性攜帶者高達(dá)1億多，其中30%~50%是通過母嬰垂直傳播感染導(dǎo)致[1]，因此，故控制和減少HBV母嬰垂直傳播是防治HBV感染的重要途徑。宮內(nèi)感染是HBV母嬰傳播最主要途徑，目前阻斷HBV宮內(nèi)感染的最有效方法為新生兒出生24h內(nèi)聯(lián)合使用乙肝高效價免疫球蛋白及乙肝疫苗，但HBeAg陽性孕婦的新生兒有5%~15%阻斷失敗。因此，有必要進(jìn)一步研究HBV宮內(nèi)感染機(jī)制，尤其是孕產(chǎn)婦HBeAg陽性時宮內(nèi)感染率高的機(jī)制，以便探討更有效的阻斷方法。

目前對于HBV宮內(nèi)感染的機(jī)制仍不十分明確。近年來，CD4+CD25+Treg細(xì)胞(Tregs)對HBV宮內(nèi)感染影響的研究受到關(guān)注。FOXP3是目前公認(rèn)的Tregs特異的免疫標(biāo)志[2];IL-10、TGF-β1是Tregs所分泌的抑制性細(xì)胞因子，對Tregs的抑制功能具有重要作用[3]?，F(xiàn)階段對于Tregs與HBV宮內(nèi)感染關(guān)系主要集中在孕婦外周血及新生兒臍帶血Tregs表達(dá)的研究，對于孕婦胎盤組織中細(xì)胞因子水平與HBV宮內(nèi)感染發(fā)生的研究較少，在這方面有必要進(jìn)一步探索。本研究采用免疫組化(二步法)檢測HBV宮內(nèi)感染孕婦胎盤組織中Foxp3表達(dá)，將Foxp3作為檢測Tregs的指標(biāo)；同時采用免疫組化法檢測胎盤組織中細(xì)胞因子IL-10及TGF-β1的表達(dá)，研究HBV感染孕婦胎盤組織中Tregs及其相關(guān)因子與HBV宮內(nèi)感染的相關(guān)性，探討孕產(chǎn)婦HBeAg陽性時宮內(nèi)感染發(fā)生率高的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2012年6月至2014年10月在我院分娩109例HBV感染孕婦作為研究對象(其中HBsAg及HBeAg雙陽性58例；HBsAg陽性且HBeAg陰性孕婦51例)，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)足月、單胎妊娠；(2)HBsAg陽性但肝功能正常；(3)無子癇前期、胎兒生長受限等并發(fā)癥。HBV宮內(nèi)感染診斷標(biāo)準(zhǔn)：臍靜脈血檢測提示HBsAg陽性或合并HBVDNA陽性，考慮HBV宮內(nèi)感染[4]。

按照HBV宮內(nèi)感染診斷標(biāo)準(zhǔn)，將發(fā)生HBV宮內(nèi)感染的孕婦設(shè)為宮內(nèi)感染組，將未發(fā)生宮內(nèi)感染的孕婦設(shè)為宮內(nèi)未感染組，兩組孕婦的臨床資料(年齡、孕產(chǎn)次、孕周)無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；依據(jù)孕婦HBV血清學(xué)標(biāo)志物檢查結(jié)果，將HBsAg及HBeAg雙陽性孕婦設(shè)為HBeAg陽性組；將HBsAg陽性且HBeAg陰性孕婦設(shè)為HBeAg陰性組，兩組孕婦的臨床資料(年齡、孕產(chǎn)次、孕周)無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

1.2 主要試劑 Foxp3鼠抗人單克隆抗體、IL-10兔抗人多克隆抗體購自艾博抗公司；TGF-β1兔抗人多克隆抗體購自福州邁新公司；通用型二抗、DAB試劑盒購自中杉金橋公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 標(biāo)本采集：新生兒娩出并斷臍后，在胎盤娩出前，抽5ml臍靜脈血，送本院檢驗(yàn)科檢測臍帶血HBV-DNA以及乙肝六項(xiàng)；娩出胎盤后，快速用手術(shù)刀取小塊包括母體面和胎兒面的胎盤組織，采取的部位在胎盤中央附近，避開鈣化點(diǎn)，采取面積約2cm×2cm×2cm大小 ，生理鹽水洗凈，10%多聚甲醛液中固定24h，在病理科脫水，常規(guī)包埋制成石蠟塊，4℃冰箱內(nèi)放置保存待用。

采用免疫組化(二步法)檢測宮內(nèi)感染組及未宮內(nèi)感染組孕婦胎盤組織中Foxp3、IL-10及TGF-β1的表達(dá)，F(xiàn)oxp3工作濃度分別為 1：200，IL-10及TGF-β1工作濃度為1：100，具體操作同說明書。每批染色均設(shè)陽性對照(Foxp3、IL-10陽性對照片由abcam公司提供，TGF-β1陽性對照片由福州邁新公司提供)和陰性對照(PBS代替一抗)。

1.4 結(jié)果判定 陽性細(xì)胞判定：細(xì)胞具有完整結(jié)構(gòu)，細(xì)胞漿呈黃色或棕黃色顆粒，細(xì)胞核為藍(lán)色者為陽性細(xì)胞；陰性細(xì)胞判定：細(xì)胞具有完整結(jié)構(gòu)，細(xì)胞漿未被染成棕褐色，顯示為淺藍(lán)色。半定量分析：在顯微鏡200放大倍數(shù)下觀察陽性細(xì)胞，每張切片隨機(jī)觀察5個視野，綜合陽性細(xì)胞所占比例(A)及細(xì)胞漿著色深淺(B)計分。 陽性細(xì)胞所占比例 (A)：<5% 計 0分，5%～25%計 1分，26%～50%計2分，>50% 計3分；細(xì)胞漿著色深淺(B)：無著色計0分，淺棕黃色計1分，黃色計2分，棕褐色計3分。兩項(xiàng)指標(biāo)的計分?jǐn)?shù)相乘(A×B)進(jìn)行半定量：積分0分為陰性，1～3分為輕度陽性，4～6分為中度陽性，7～9 分為強(qiáng)陽性[5]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSSl7.0軟件分析數(shù)據(jù)，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；細(xì)胞因子表達(dá)強(qiáng)度采用等級資料秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HBV宮內(nèi)感染率 109例HBV感染孕婦共發(fā)生宮內(nèi)感染12例，宮內(nèi)感染率為11.01%。采用χ2檢驗(yàn)方法統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示HBeAg陽性組宮內(nèi)感染率明顯高于HBeAg陰性組(P<0.01)，見表1。

表1 HBV宮內(nèi)感染率

2.2 胎盤組織中 Foxp3、IL-10、TGF-β1 陽性細(xì)胞定位及表達(dá)部位 胎盤組織的病理圖片均為DAB染色，F(xiàn)oxp3、TGF-β1及IL-10陽性細(xì)胞都主要定位于胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞、絨毛血管內(nèi)皮細(xì)胞、蛻膜細(xì)胞，在絨毛間質(zhì)細(xì)胞有少量表達(dá)，表達(dá)部位在細(xì)胞漿。Foxp3、IL-10、TGF-β1陽性細(xì)胞在各組中分布基本一致。各組胎盤組織中Foxp3、IL-10、TGF-β1的表達(dá)及PBS陰性對照見圖1~6。

2.3 宮內(nèi)感染組與宮內(nèi)未感染組孕婦胎盤組織中Foxp3、IL-10、TGF-β1表達(dá)的陽性率比較 宮內(nèi)感染組 Foxp3、IL-10、TGF-β1 在胎盤組織中較宮內(nèi)未感染組表達(dá)的陽性率顯著增高，采用秩和檢驗(yàn)

圖1 Foxp3在宮內(nèi)未感染組與宮內(nèi)感染組胎盤組織中的表達(dá)(×200)

圖3 TGF-β1在宮內(nèi)未感染組與宮內(nèi)感染組胎盤組織中的表達(dá)(×200)

圖5 IL-10在HBeAg陰性組與HBeAg陽性組胎盤組織中的表達(dá)(×200)

圖4 Foxp3在HBeAg陰性組與HBeAg陽性組胎盤組織中的表達(dá)(×200)

圖6 TGF-β1在 HBeAg陰性組與HBeAg陽性組胎盤組織中的表達(dá)(×200)

方法統(tǒng)計分析，顯示差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見 表2~4。

表2 宮內(nèi)感染組與宮內(nèi)未感染組孕婦胎盤組織中Foxp3表達(dá)的陽性率[n(%)]

表3 宮內(nèi)感染組與宮內(nèi)未感染組孕婦孕婦胎盤組織中IL-10表達(dá)的陽性率[n(%)]

表4 宮內(nèi)感染組與宮內(nèi)未感染組孕婦胎盤組織中TGF-β1表達(dá)的陽性率[n(%)]

2.4 HBeAg陽性組及HBeAg陽性組胎盤組織中Foxp3、IL-10、TGF-β1 表達(dá)的陽性率比較 HBeAg陽性組 Foxp3、IL-10、TGF-β1 在胎盤組織中較HBeAg陰性組表達(dá)的陽性率顯著增高，采用秩和檢驗(yàn)方法統(tǒng)計分析，顯示差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)，見表 5~7。

3 討論

3.1 胎盤組織中CD4+CD25+Treg細(xì)胞與HBV宮內(nèi)感染發(fā)生的關(guān)系 Tregs是一種具有抑制功能的T細(xì)胞亞群 ,能抑制自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞、CD4+和CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞、B細(xì)胞及其他免疫細(xì)胞的功能[6]。其表面表達(dá)很多表面分子，主要有FOXP3、TNFR、CD122、CTLA4、CD134 等[7]， 其 中 Foxp3 是目前公認(rèn)的Tregs特異的免疫標(biāo)志，國內(nèi)也有許多研究檢測胎盤組織中Foxp3表達(dá)作為胎盤組織Tregs 的指標(biāo)[8，9]。

表5 HBeAg陽性組與HBeAg陰性組孕婦胎盤組織中Foxp3表達(dá)的陽性率[例(%)]

表6 HBeAg陽性組與HBeAg陰性組孕婦胎盤組織中IL-10表達(dá)的陽性率[例(%)]

表7 HBeAg陽性組與HBeAg陰性組孕婦胎盤組織中TGF-β1表達(dá)的陽性率[例(%)]

輔助性T淋巴細(xì)胞 (Th)屬于CD4+T細(xì)胞亞群，分為Th1和 Th2細(xì)胞，Th1細(xì)胞產(chǎn)生IL-2和IFN-γ 等細(xì)胞因子，Th2 細(xì)胞產(chǎn)生 lL-4、IL-10、與IL-13等細(xì)胞因子，Th1/Th2細(xì)胞處于動態(tài)平衡才能維持細(xì)胞免疫和體液免疫正常的功能。近年許多研究表明，發(fā)生HBV宮內(nèi)感染時，新生兒及其母親外周血 Tregs數(shù)量增多，并存在Th1/Th2細(xì)胞免疫失衡[10，11]。鄭九生等采用流式細(xì)胞儀檢測HBV宮內(nèi)感染的母親及其新生兒Tregs表達(dá)水平和DAS-ELISA法檢測IFN-γ水平及IL-4水平，提示宮內(nèi)感染組孕婦存在Th1/Th2細(xì)胞免疫失衡，Th1細(xì)胞免疫反應(yīng)下調(diào)而 Th2細(xì)胞免疫反應(yīng)增強(qiáng)，病毒難以被清除，參與HBV宮內(nèi)感染[12]。

胎盤中絨毛間隙充滿著母體的血液，HBV病毒可以通過感染胎盤再而感染胎兒[13]。但胎盤感染發(fā)生的細(xì)胞因子機(jī)制尚不明確，現(xiàn)階段對于Tregs與HBV宮內(nèi)感染關(guān)系主要集中在孕婦外周血及新生兒臍帶血Tregs水平的研究，對于孕婦胎盤組織中細(xì)胞因子水平與HBV宮內(nèi)感染發(fā)生的研究較少，有必要進(jìn)一步研究。本研究采用免疫組化(二步法)檢測HBV感染孕婦胎盤組織中Foxp3表達(dá)水平，作為檢測 Tregs的指標(biāo)，研究胎盤組織Tregs表達(dá)與HBV宮內(nèi)感染發(fā)生的關(guān)系。我們的研究顯示胎盤組織中Foxp3陽性細(xì)胞主要定位于胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞、絨毛血管內(nèi)皮細(xì)胞、蛻膜細(xì)胞，在絨毛間質(zhì)細(xì)胞有少量表達(dá)，主要表達(dá)部位為細(xì)胞漿，這與何永文等報道基本一致[8]；宮內(nèi)感染組孕婦胎盤組織中Foxp3表達(dá)陽性率91.6%，明顯高于宮內(nèi)未感染組的42.2%，說明Tregs數(shù)量增多可能是HBV宮內(nèi)感染發(fā)生的危險因素之一，推測胎盤感染HBV時，Tregs通過其免疫抑制功能，抑制HBV特異性免疫應(yīng)答，使清除HBV和抑制炎癥反應(yīng)對組織的損傷達(dá)到免疫平衡，當(dāng)Tregs增多，這種免疫平衡被打破，胎盤組織中HBV難以被清除，導(dǎo)致胎盤感染持續(xù)，參與HBV宮內(nèi)感染的發(fā)生。但是目前國內(nèi)外對于胎盤組織中Tregs與HBV宮內(nèi)感染的相關(guān)研究不多，其發(fā)生機(jī)制并不明確，胎盤組織中Tregs增多在HBV宮內(nèi)感染的發(fā)生中是否起關(guān)鍵作用并不清楚。

3.2 胎盤組織中TGF-β1和IL-10與HBV宮內(nèi)感染 TGF-β1和IL-10是具有免疫抑制作用的細(xì)胞因子，主要是由Tregs分泌產(chǎn)生，妊娠過程中胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞也可產(chǎn)生。TGF-β1可以明顯抑制T細(xì)胞增生及NK細(xì)胞、CTL的活性；IL-10可阻止T細(xì)胞受體介導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞的活化，能抑制TNF等細(xì)胞因子，兩者在免疫功能調(diào)節(jié)中具有重要作用。周建研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)慢性乙肝患者HBV載量越高，IL-10的水平越高，說明IL-10水平增高不利于HBV 的清除[14]。

解長銀等[15]發(fā)現(xiàn)，TGF-β1主要表達(dá)于胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜細(xì)胞，主要表達(dá)部位為細(xì)胞漿 ；趙芳等[16]發(fā)現(xiàn)，IL-10主要表達(dá)于胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞中。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組化二步法對HBV感染孕婦患者胎盤的TGF-β1和IL-10的表達(dá)進(jìn)行定位和半定量檢測，結(jié)果顯示，TGF-β1及IL-10陽性細(xì)胞都主要定位于胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞、絨毛血管內(nèi)皮細(xì)胞、蛻膜細(xì)胞，在絨毛間質(zhì)細(xì)胞有少量表達(dá)，主要表達(dá)部位在細(xì)胞漿。與解長銀、趙芳等報道分布基本一致。

同時，我們的研究還顯示HBV宮內(nèi)感染孕婦胎盤組織中TGF-β1和IL-10陽性表達(dá)率均較宮內(nèi)未感染組明顯增高，說明胎盤組織中細(xì)胞因子IL-10、TGF-β1表達(dá)水平升高可能是HBV宮內(nèi)感染發(fā)生機(jī)制之一，推測胎盤組織中細(xì)胞因子TGF-β1和IL-10表達(dá)水平升高時，通過其免疫抑制作用，導(dǎo)致Th1/Th2細(xì)胞免疫失衡，HBV特異性免疫應(yīng)答受到抑制，胎盤組織中病毒難以被清除，導(dǎo)致HBV宮內(nèi)感染的發(fā)生。

3.3 HBeAg陽性與HBV宮內(nèi)感染 HBeAg是HBV復(fù)制和傳染的指標(biāo)，大量研究表明孕婦血HBeAg陽性是HBV宮內(nèi)感染的高危因素。謝小娟等[17]發(fā)現(xiàn)大三陽孕婦宮內(nèi)感染率其新生兒HBV感染率明顯升高，且隨HBV-DNA量的升高而增加。我們的研究發(fā)現(xiàn)HBeAg陽性組宮內(nèi)感染率18.96%，遠(yuǎn)高于HBeAg陰性組(1.96%)，差異有顯著意義，說明孕產(chǎn)婦HBeAg陽性會增加HBV宮內(nèi)感染發(fā)生率，這與謝小娟等研究結(jié)果一致。

目前關(guān)于孕產(chǎn)婦HBeAg陽性增加HBV宮內(nèi)感染發(fā)生風(fēng)險的機(jī)制存在爭議，馬麗娟等[18]研究認(rèn)為孕婦HBeAg陽性者其新生兒存在Th1/Th2細(xì)胞免疫失衡，導(dǎo)致不能及時有效地清除HBV使宮內(nèi)感染易于發(fā)生；張永臣等[19]研究發(fā)現(xiàn)HBeAg陽性組孕產(chǎn)婦的新生兒外周血Tregs明顯高于HBeAg陰性組，導(dǎo)致新生兒免疫調(diào)節(jié)功能低下；也有學(xué)者認(rèn)為HBeAg導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)育不良，使胎盤喪失其對胎兒的屏障保護(hù)作用，從而導(dǎo)致宮內(nèi)感染的發(fā)生；而張薇莉等[20]認(rèn)為HBeAg可選擇性通過胎盤屏障進(jìn)入胎兒體內(nèi)，使新生兒出生后出現(xiàn)HBeAg血癥；

而我們的研究顯示HBeAg陽性組胎盤組織中Foxp3、IL-10、TGF-β1 較 HBeAg 陰性組陽性表達(dá)率顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明孕產(chǎn)婦HBeAg陽性時，其胎盤組織中存在Tregs增多及其相關(guān)因子表達(dá)水平升高，推測這可能是HBeAg陽性孕產(chǎn)婦HBV宮內(nèi)感染發(fā)生率高的機(jī)制之一。

3.4 總結(jié)與展望 綜上所述，我們的研究說明：HBV感染孕婦胎盤組織中Tregs增多可能是發(fā)生HBV宮內(nèi)感染的危險因素之一；胎盤組織中IL-10和TGF-β1表達(dá)增高可能是HBV宮內(nèi)感染的發(fā)生機(jī)制之一；孕產(chǎn)婦HBeAg陽性時，其胎盤組織中存在Tregs增多及其相關(guān)因子表達(dá)水平升高，推測這可能是HBeAg陽性孕產(chǎn)婦HBV宮內(nèi)感染發(fā)生率高的機(jī)制之一。我們推測Tregs增多及其相關(guān)因子表達(dá)水平升高時，通過其免疫抑制功能，導(dǎo)致Th1/Th2細(xì)胞免疫失衡，抑制HBV特異性免疫應(yīng)答，使胎盤組織中病毒難以被清除，導(dǎo)致感染持續(xù)，進(jìn)一步導(dǎo)致HBV宮內(nèi)感染發(fā)生。

但是目前國內(nèi)外對于胎盤組織中Tregs與HBV宮內(nèi)感染的相關(guān)研究不多，胎盤組織中Tregs增多及其相關(guān)因子表達(dá)水平升高在HBV宮內(nèi)感染的發(fā)生中是否起關(guān)鍵作用并不清楚，仍然需要進(jìn)一步研究，以探索預(yù)防HBV宮內(nèi)感染的更好辦法。

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