梁華，余藝萍，藍毓紅，付向春，劉春菊，李瑋婷，楊軍平

(江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院檢驗科，江西 南昌330006)

目前全球每年約有27萬例女性死于宮頸癌，宮頸癌已經成為女性第二常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率僅次于乳腺癌[1]，人乳頭瘤病毒(HPV)感染是宮頸癌發(fā)生的必要條件，研究證實99%的宮頸癌病例與生殖系統(tǒng)HPV感染有關[2]。HPV是一種微小的雙鏈閉環(huán)DNA病毒，迄今為止已經發(fā)現(xiàn)200多種基因型，其中50多種與生殖道感染相關[3]。目前，HPV基因分型檢測作為臨床篩檢宮頸癌的有效方法，已經受到越來越多的關注[4]。而對于不同種族不同地區(qū)不同感染人群來說HPV亞型分布也會存在差異，明確在某特定區(qū)域HPV的感染率及型別分布差異能為該地區(qū)宮頸癌防治和流行病學調查提供依據(jù)，同時對開發(fā)HPV疫苗也能發(fā)揮積極的指導意義。本研究回顧分析了2014年1月到2015年6月在本院婦科門診就診的患者宮頸細胞HPV基因分型檢測結果，以了解該地區(qū)HPV感染率、21種基因型分布與年齡的關系。

1 材料與方法

2014年1月至2015年6月本院婦科門診就診的2659例女性，年齡16～84歲，平均年齡40.5±10.3歲。

1.1 儀器與試劑 PE9600型PCR擴增儀為美國PE公司產品，HybriMax醫(yī)用核酸分子快速雜交儀為廣東凱普公司自主研發(fā)。HPV-DNA基因組提取試劑盒、PCR擴增試劑盒和核酸分子快速雜交試劑盒(21種基因型)均為廣東凱普公司產品。

1.2 方法

1.2.1 標本采集與保存 標本采集在非月經期，1天內禁性生活，3d內禁陰道用藥或沖洗。先以擴陰器暴露宮頸，用棉拭子將宮頸口過多的分泌物擦去。采用專用的宮頸脫落細胞采集器中的宮頸刷伸入宮頸口處，順時針旋轉3~5周以獲取足量的上皮細胞樣本，再將宮頸刷頭部放入裝有細胞保存液的樣本管中，在管口處將多余的刷柄折斷，旋緊樣本管蓋，做好標記，立即送檢，或置于-20℃冰箱保存待檢。

1.2.2 DNA提取 將帶有刷頭的樣本管在漩渦振蕩器上充分振蕩混勻后，吸取0.5ml細胞保存液于Eppendorf離心管中，14000r/min離心1min，吸棄上清液，留下管底細胞。向每管加入0.4ml細胞裂解液A，充分振蕩混勻后放入100℃金屬浴中15 min，取出后再依次加入0.4ml細胞裂解液B，輕柔混勻后，14000r/min離心5min，小心吸棄上清液，待管底沉淀晾干，最后向每管加入60μl無菌雙蒸水，混勻后，14000r/min離心3min，取上清液作為PCR反應的DNA模板。

1.2.3 PCR擴增 按照擴增試劑盒說明書配置PCR反應混合液，每管加入上述提取的待檢DNA模板1.0μl,同時設置陽性對照品、H2O(陰性對照)，點動離心，立即放入PCR擴增儀進行擴增反應。PCR循環(huán)參數(shù)為：95℃預變性9min，進入循環(huán)部分，95℃變形 20s,55℃退火 30s，72℃延伸 30 s，共40個循環(huán)，最后72℃5min,擴增結束，產物放4℃保存。

1.2.4 導流雜交 雜交前需將PCR產物放入PCR儀中95℃變性至少5 min，立即取出放入冰盒中冰浴至少2 min，從而使擴增后的雙鏈產物變性為單鏈DNA后才能與雜交膜上的單鏈探針進行雜交。打開雜交儀，調好溫度，依次放好金屬板、分隔膜、雜交膜、硅膠圈、分割室、壓扣蓋，將變性好的PCR產物依次全部加入到上述雜交儀內，按照凱普公司提供的導流雜交步驟進行雜交操作。

1.3 統(tǒng)計學處理 使用SPSS13.0進行統(tǒng)計學分析，陽性率的比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HPV基因型分布 在2659例患者中，共有708例檢出HPV基因，陽性率為26.60%；鑒于這708例患者中或存多重感染基因亞型的情況，故統(tǒng)計出HPV總陽性計數(shù)為970例，總陽性率為36.48%；其中812例為高危型HPV，陽性率為30.53%；158例為低危型HPV，陽性率為5.94%。本研究中21種HPV基因型別均有檢出，其中高危型HPV從高到低前五位依次為 HPV52、HPV16、HPV58、HPV39和HPV53型；低危型HPV前三位依次為HPV81、HPV6和HPV11型，見表1。

2.2 不同年齡組HPV基因型分布 從表1可以看出，低危型HPV陽性率<20歲組(20.0%)、≥65歲組 (12.5%)、60～<65 歲組 (7.55%) 和 20～<30 歲組(6.64%)居前四位；高危型HPV陽性率<20歲組(46.67%)、 ≥65 歲 組 (45.83%)、20 ～<30 歲 組(35.25%)、50～<60 歲組 (32.99%) 和 40～<50 歲組(29.0%)居前五位。另外，無論在高危型HPV還是低危型HPV陽性者中，均以20～<30歲年齡組最高(276例和52例)；在高危型HPV陽性者中，<20歲組、20～<30 歲組、30～<40 歲組、40～<50 歲組、50～<60歲組、≥65歲組共6個年齡組最常見的基因型為HPV52型，在低危型HPV陽性者中，20～<30 歲組、30～<40 歲組、40～<50 歲組、50~<60 歲組共4個年齡組最常見的基因型為HPV81型。從各年齡組總陽性率來看，差異均無統(tǒng)計學意義 (P<0.05)。

2.3 單一HPV和多重HPV的感染分布 本研究同時探討了在708例HPV陽性感染者中，單一感染與多重感染以及在各年齡組的分布。從表2可以看出，單一感染 (74.86%)明顯高于多重感染(25.14%)。多重感染中以二重感染居多(19.07%)，其次為三重感染(3.95%)；在各年齡組別中，≥65歲組多重感染比率最高，達到20.83%(P<0.05)，其次為20～<30歲組(8.17%),除外≥65歲組，其他各組之間互相比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表1 708名HPV感染者HPV基因型及其年齡分布[n(%)]

表2 708名HPV感染者單一感染和多重感染結果及其年齡分布

3 討論

根據(jù)致宮頸癌和癌前病變的相關性，HPV可以分為高危型(high-risk)和低危型(low-risk)，高危型HPV持續(xù)感染是女性宮頸癌發(fā)病的重要誘因。美國陰道鏡和宮頸病理學會(ASCCP)建議，HPV基因分型檢測可以作為HPV DNA陽性但細胞學陰性人群的分流管理工具，同時它還可以了解區(qū)域內HPV流行狀況，為宮頸癌疫苗的研發(fā)和效果評估提供數(shù)據(jù)支撐。而HPV疫苗對疫苗病毒型別相關的宮頸癌前病變的保護效果幾乎可達100%[2]。同時，不同地區(qū)感染的HPV基因型別有所不同。本研究顯示，南昌地區(qū)HPV陽性率為26.60%，其中高危型HPV陽性率為30.53%，低危型HPV陽性率為5.94%，表明女性感染高危型HPV遠遠高于感染低危型HPV，故應加強本地高危型HPV感染監(jiān)控。本地區(qū)居前六位的基因型依次為HPV52、16、58、39、81、53， 而國外報道的多以 16 或 18 型為主[5]，其疫苗研制也主要針對這兩個型別[6]；這個結果與吳玉萍等在2005年報道統(tǒng)計的江西省宮頸癌患者 HPV 主要型別為 HPV16、58、33、31、18、66有較大差異[7]，與王其國等[8]報道的山東某三縣區(qū) HPV 感染分布(HPV16、18、58、31、52)有較大差別，與鄰近的衡陽地區(qū)相比(HPV16、52、58、81、53、18)同樣存有較大差異[9]，即便與同省的鷹潭地區(qū)相比(HPV52、43、58、16、6、56)結果也有較大的不同[10]，但與方麗娟等報道的江西地區(qū)HPV感染型別(HPV52、16、58、33、53)基本一致[11]，這可能與受檢人群樣本的差異性和檢測方法不同造成。浙江的一項研究[12]則顯示，該地區(qū)前三位HPV感染型別依次為HPV52、16、58型，與本研究結果相似，而一項福建的研究[13]表明，HPV52和33型是該地區(qū)最常見的型別，北京的一項研究[14]則顯示高危型HPV感染以HPV58、16、52為主，均與HPV16是世界范圍最常見感染型別且無地域差異的說法不一致。可見，感染HPV的任何基因型在人群和地域方面都有可能存在較大的差異。

HPV感染因年齡不同亦有所差異。本地區(qū)無論高危型HPV還是低危型HPV感染，<20歲組和≥65歲組比率為最高，各年齡組陽性率隨年齡增長呈“U”型分布。另外，無論在高危型HPV還是低危型HPV陽性者中，均以20～<30歲年齡組最高(276例和52例)。這也符合我國宮頸癌發(fā)病年齡分布和呈現(xiàn)年輕化趨勢的特點。在高危型患者中，有6個組別最常見基因型為HPV52型，而高危型HPV病毒持續(xù)感染是導致宮頸癌和癌前病變的直接原因。因此，早期積極開展HPV的感染檢測和宮頸癌早期防治具有十分重要的意義。

本研究同時表明，HPV單一感染比例遠高于多重感染。多重感染比例(25.14%)略高于衡陽地區(qū)HPV多重感染比例[9]，主要以二重感染居多。在各個年齡組均可以檢見多重感染的病例，雖然≥65歲組多重感染比率最高，但以20～<30歲年齡組多重感染陽性者最高。這可能與統(tǒng)計的陽性例數(shù)偏少有關。在所有多重感染病例中，最多的一例共檢出了 8種 HPV 基因型， 分別為 HPV6、11、16、52、53、58、39、81型，這在國內外均比較少見。至于多重感染是否會增加罹患宮頸癌的發(fā)病率，目前尚有爭議。楊曉華[15]等認為多重感染危險更大，更容易導致宮頸病變。

總之，宮頸癌的防控是一個系統(tǒng)工程，加強對HPV感染的篩查，以了解不同地區(qū)不同HPV感染基因型別的分布情況，為防治HPV相關疾病提供基礎流行病學資料和我國疫苗研制提供重要的依據(jù)。

[1]尹一兵.分子診斷學[M].北京:高等教育出版社,2007:213-214.

[2]Ronco G,Segnan N.HPV testing for primary cervical cancer screening[J].Lancet,2007,370(9601):1740-1742.

[3]De Villiers EM.Human papillvirus infection in skin cancer[J].Biomed Phannacother,1998,52(1):26-33.

[4]Arbyn M,Snijders PJ,Meijer CJ,et al.Which high-risk HPV assays fulfil criteria for use in primary cervical cancer screening[J].Clin Microbiol Infect,2015,5:S1198.

[5]Mendoza LP,Arbiza J,Paez M,et al.Distribution of human papillomavirus genotypes in Paraguayan women according to the severity of the cervical lesion[J].JMed Virol,2011,83(8):1351-1357.

[6]Franco EL,Cuzick J.Cervical cancer screening following prophylactic human papillomavirus vaccination[J].Vaccine,2008,26(3):A16-23.

[7]吳玉萍,陳裕隆,李隆玉,等.宮頸癌患者人乳頭瘤病毒(HPV)主要型別及其感染研究[J].病毒學報,2005,21(4):269-273.

[8]王其國,藺國祥,楊文東,等.相鄰三縣區(qū)婦女感染人乳頭瘤病毒分子流行病學分析[J].實驗與檢驗醫(yī)學,2013,31(4):317-319.

[9]曹清香,高紅,唐清,等.衡陽地區(qū)女性感染21種型別人乳頭瘤病毒現(xiàn)狀分析[J].國際檢驗醫(yī)學雜志,2014,35(14):1830-1832.

[10]朱紅英,占葆娥,陳飛燕,等.鷹潭地區(qū)女性宮頸HPV感染率及其基因分型特點[J].國際檢驗醫(yī)學雜志,2014,35(11):1419-1421.

[11]方麗娟,袁水斌,王剛,等.江西地區(qū)人乳頭瘤病毒感染分型檢測的研究[J].實驗與檢驗醫(yī)學,2013,31(2):181-182.

[12]Ye J,Cheng XD,Chen XJ,et al.Prevalence and risk profile of cervical human papillomavirus infection in Zhejiang province,south-east China:a population-based study[J].Virol J,2010,7:66-76.

[13]Wu DM,Cai L,Huang M,et al.Prevalence of genital human papillomavirus infection and genotypes among women from Fujian province,PR China[J].Eur JObstet Gynecol Reprod Biol,2010,151(1):86-90.

[14]曾昭瑛,李亞娜,蘇建榮.1294例女性高危型人乳頭瘤病毒基因分型結果回顧性分析[J].國際檢驗醫(yī)學雜志,2015,36(6):796-800.

[15]楊曉華,秦曉紅,夏鳳英,等.成都農村地區(qū)女性宮頸HPV感染基因型別分布狀況[J].中國醫(yī)療前沿,2012,7(3):82-83.