許愛(ài)霞，薛冰，余躍華，吉麗

(江西省婦幼保健院檢驗(yàn)科，江西 南昌330006)

卵巢早衰(Premature ovarian failure,POF)是指女性40歲前發(fā)生的卵巢功能衰竭，臨床表現(xiàn)為絕經(jīng),且伴有雌激素水平下降和促性腺激素水平上升的疾病。POF不但給婦女造成心理創(chuàng)傷，而且患者的低雌激素水平增加了患骨質(zhì)疏松癥和冠心病的危險(xiǎn)[1,2]。POF的病因十分復(fù)雜，涉及到遺傳、免疫、病毒感染、醫(yī)源性及心理等因素，約30%的POF是由遺傳因素引起[3]，而約半數(shù)以上的POF患者找不到病因，稱(chēng)為特發(fā)性POF，其中50%~60%可能與免疫因素有關(guān)[4,5]。近幾年卵泡發(fā)育相關(guān)基因在POF發(fā)病中的作用已有初步研究[6]。本實(shí)驗(yàn)擬探討原癌基因c-erbB2和EGFR在卵巢早衰大鼠卵巢中的表達(dá),為更深入了解卵巢早衰病因以及臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Sprague-Dawley(SD)雌性大白鼠,10周齡,健康,體重200～220g,由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)科部提供,合格證號(hào)為0319602。

1.1.2 主要試劑和儀器 c-erbB2多克隆抗體(北京博奧森公司)、EGFR多克隆抗體 (武漢博士德生物工程有限公司)；生物素標(biāo)記的二抗 (北京中杉公司)；雷公藤多甙片(湖南協(xié)力藥業(yè)有限公司生產(chǎn),國(guó)藥準(zhǔn)字Z43020138)；人促卵泡生成激素放射免疫分析試劑盒、雌二醇放射免疫分析試劑盒、人促黃體生成激素放射免疫分析試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所)；放射免疫檢測(cè)儀 (西門(mén)子 CENTAUR 5802)。

1.2方法

1.2.1 動(dòng)物分組 大白鼠購(gòu)入后適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隔日換墊料,室溫控制在25℃,濕度70%,通風(fēng)良好。其后連續(xù)10d進(jìn)行陰道涂片，以觀(guān)察大鼠的動(dòng)情周期，將有動(dòng)情周期的20只大鼠納入實(shí)驗(yàn)，并隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組10只。實(shí)驗(yàn)組:口服灌胃法，生理鹽水配制的雷公藤多甙片懸浮液按照50mg/Kg·d，共14d,造POF模型。 空白組:同劑量生理鹽水灌胃，1次/d，共14d；自灌藥第4d起，每日進(jìn)行陰道涂片，觀(guān)察動(dòng)情周期，每?jī)商鞙y(cè)1次體重。

1.2.2 標(biāo)本處理 給藥結(jié)束后24h,對(duì)照組和模型組大鼠給予10%水合氯醛麻醉后眶周取血標(biāo)本，處死，留取卵巢。留取的血標(biāo)本靜置后,離心,取上清液保存于低溫冰箱，待激素檢測(cè)。留取的卵巢置于中性福爾馬林液中固定,石蠟包埋,連續(xù)切片,貼附于預(yù)先用多聚賴(lài)氨酸處理好的載玻片上，37~42℃烤片過(guò)夜，以備HE染色和免疫組化用。

1.2.3 黃體生成激素、雌二醇和促卵泡生成激素均采用放射免疫法檢測(cè)，操作步驟和結(jié)果判斷嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.4 免疫組化染色 切片脫蠟，0.3%H202處理，抗原熱修復(fù)后滴加封閉液，封閉后與EGFR或cerbB2多克隆抗體(1:200)孵育，4℃過(guò)夜，次日與生物素偶聯(lián)的二抗工作液，37℃孵育20 min，再與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育20 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。同時(shí)設(shè)置PBS緩沖液代替一抗的空白對(duì)照。

1.2.5 卵泡發(fā)育觀(guān)察和組織學(xué)判斷標(biāo)準(zhǔn) 每個(gè)蠟塊取切片2張,每張切片觀(guān)察5個(gè)視野,每組共觀(guān)察計(jì)數(shù)40個(gè)高倍鏡視野下卵巢最大橫切面上的各級(jí)正常卵泡總數(shù)，最后取均數(shù)。組織學(xué)標(biāo)準(zhǔn)：初級(jí)卵泡為卵母細(xì)胞由單層立方狀顆粒細(xì)胞包圍；次級(jí)卵泡為卵母細(xì)胞由2層或2層以上的立方狀顆粒細(xì)胞包圍；成熟卵泡為卵泡發(fā)育的最后階段,出現(xiàn)大的卵泡腔。閉鎖卵泡為卵母細(xì)胞核固縮，染色體、胞質(zhì)溶解，顆粒細(xì)胞層減少。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSSl3.0版本軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，均數(shù)間的比較用t檢驗(yàn)，以P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組性激素水平檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表1。

表1 兩組大鼠血清性激素水平比較(±s)

表1 兩組大鼠血清性激素水平比較(±s)

注:與空白組比較*P<0.01。

組別 例數(shù) FSH(mIU/ml)LH(mIU/ml)123.586±41.239 64.972±32.684*E2(pg/ml)空白組實(shí)驗(yàn)組10 10 1.639±0.715 1.639±0.715*2.586±0.893 4.524±1.871*

2.2 兩組卵巢組織形態(tài)學(xué)觀(guān)察 空白組卵巢卵泡生長(zhǎng)活躍,可見(jiàn)較多的成熟和次級(jí)卵泡,較少閉鎖卵泡，顆粒細(xì)胞層次多；實(shí)驗(yàn)組卵巢次級(jí)卵泡和成熟卵泡明顯減少(P<0.01)，可見(jiàn)較多閉鎖卵泡(P<0.01)，卵泡的顆粒細(xì)胞層次明顯減少。見(jiàn)圖1,表2。

表2 兩組大鼠各級(jí)卵泡的構(gòu)成(40個(gè)高倍視野)

圖1培養(yǎng)前后的新生太鼠卵巢組織切片HE染色結(jié)果(×400)

2.3 ErbB2蛋白和EGFR蛋白在卵泡中的表達(dá)定位 用免疫組化SP方法檢測(cè)不同組別的卵巢內(nèi)ErbB2蛋白和EGFR蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，空白組ErbB2蛋白和EGFR蛋白陽(yáng)性信號(hào)明顯，主要位于卵母細(xì)胞胞膜上，為深棕色染色顆粒，實(shí)驗(yàn)組則陽(yáng)性表達(dá)極少。見(jiàn)圖2。

圖2 ErbB2蛋白和EGFR蛋白在卵泡中的表達(dá)(SP×400)

3 討論

POF近年來(lái)發(fā)病率不斷升高，研究顯示其在40、30、20歲以前的婦女中發(fā)病率分別為1%~2%、0.1%、0.01%[7,8],且有進(jìn)一步年輕化的趨勢(shì)。POF易導(dǎo)致生育力喪失及雌激素水平低下，由于病因未明，治療效果不佳，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和身心健康。研究表明，POF發(fā)病的主要機(jī)制很可能是卵泡發(fā)育及成熟障礙[9]。由于卵巢卵泡發(fā)育需眾多基因和信號(hào)通路參與，并通過(guò)多種途徑相互協(xié)調(diào)作用，因此任何導(dǎo)致始基卵泡池縮小、卵泡耗竭加速、卵泡募集或功能異常的因素，均可發(fā)生卵巢早衰。近年研究表明POF基因調(diào)控可能與原癌基因有關(guān)[10，11]。

原癌基因是一類(lèi)細(xì)胞內(nèi)高度保守的正?；?這類(lèi)基因在正常細(xì)胞中的表達(dá)嚴(yán)格受時(shí)間、空間、程序的調(diào)控，通過(guò)其表達(dá)產(chǎn)物-蛋白質(zhì)分子調(diào)節(jié)不同組織細(xì)胞增殖及分化。原癌基因c-erbB2屬于孤兒受體，尚無(wú)特異性配體，但同樣具有酪氨酸激酶活性，參與信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)和細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)。表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)是原癌基因c-erbBl所編碼的跨膜糖蛋白，當(dāng)EGFR和配體EGF結(jié)合后，催化多種底物酪氨酸殘基磷酸化，可啟動(dòng)、催化與細(xì)胞生長(zhǎng)增殖有關(guān)的生長(zhǎng)過(guò)程。我們以往研究發(fā)現(xiàn)在原始卵泡啟動(dòng)生長(zhǎng)過(guò)程中有c-erbB2 mRNA的表達(dá)，且隨著卵泡發(fā)育逐漸增加，而且EGF可以上調(diào)c-erbB2 mRNA的表達(dá)，表明原癌基因c-erbB2在原始卵泡啟動(dòng)生長(zhǎng)中起重要的促進(jìn)作用[12,13]。本實(shí)驗(yàn)HE染色發(fā)現(xiàn)空白組卵巢卵泡生長(zhǎng)活躍,可見(jiàn)較多的成熟和次級(jí)卵泡,顆粒細(xì)胞層次多，而早衰卵巢內(nèi)極少次級(jí)卵泡和成熟卵泡(P<0.01)，可見(jiàn)較多閉鎖卵泡(P<0.01)，卵泡的顆粒細(xì)胞層次明顯減少，與文獻(xiàn)結(jié)果一致[14,15]。免疫組化發(fā)現(xiàn)空白組ErbB2蛋白和EGFR蛋白陽(yáng)性信號(hào)明顯，主要位于卵母細(xì)胞胞膜上，為深棕色染色顆粒，實(shí)驗(yàn)組早衰卵巢則陽(yáng)性表達(dá)極少。結(jié)果提示c-erbB2基因和EGFR可能參與了卵巢早衰中的卵泡成熟障礙及卵泡凋亡調(diào)控，但c-erbB2基因和EGFR具體通過(guò)何種途徑影響早衰卵巢中卵泡的發(fā)育，還需進(jìn)一步研究。

[1]Leite-Silva P,Bedone A,Pinto-Neto AM,et al.Factors associated with bone density in young women with karyotypically normal spontaneous premature ovarian failure[J].Arch Gynecol Obstet,2009,280(2):177-181.

[2]Van der Stege JG,Groen H,Van Zadelhoff SJ,et al.Decreased androgen concentrations and diminished general and sexual well-being in women with premature ovarian failure [J].Menopause,2008,15(1):23-31.

[3]Wang J,Wang B,Song J,et al.New candidate gene POU5F1 associated with premature ovarian failure in Chin-ese patients[J].Reprod Biomed online,2011,22(3):312-316.

[4]Venkatesh S,Kumar M,Sharma A,et al.Oxidative stress and ATPase6 mutation is associated with primary ovarian insufficiency[J].Arch Gynecol Obstet,2010,282(3):313-318.

[5]Raiesh S,Kalu E,Bong J,et al.Evisceration 5 years post abdominal hysterectomy[J].JObstet Gynaecol Res,2008,34(3):425-734.

[6]焦雪,汪虹,陳子江.卵泡發(fā)育調(diào)節(jié)關(guān)鍵基因突變與卵巢早衰的關(guān)系[J].診斷學(xué)理論與實(shí)踐,2012,11(3):237-240.

[7]Shelling AN.Premature ovarian failure[J].Reproduction,2010,140(5):633-641.

[8]Kokcu A.Premature ovarian failure from current perspective[J].Gynecol Endocrinol,2010,26(8):555-562.

[9]陳蓓麗,曹云霞.卵巢早衰的病因?qū)W研究進(jìn)展.國(guó)際生殖健康/計(jì)劃生育雜志[J].2013,32(5):339-343.

[10]朱玲,羅頌平,許麗綿,等.左歸丸對(duì)免疫性卵巢早衰小鼠卵巢Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響[J].中藥新藥與臨床藥理,2012,23(4):381-386.

[11]劉慧萍,尤昭玲,雷磊,等.補(bǔ)腎活血方對(duì)免疫性卵巢早衰小鼠卵泡凋亡調(diào)控基因(Bcl-2/Bax)蛋白的影響[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2010,28(5):1036-1038.

[12]黃健,鄭莉萍,李芳,等.原癌基因c-erbB2在原始卵泡啟動(dòng)生長(zhǎng)中的作用[J].中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志,2010,26(2):165-170.

[13]徐良全,許愛(ài)霞,黃健,等.c-erbB2在大鼠卵巢中的表達(dá)及其在原始卵泡生長(zhǎng)啟動(dòng)中的作用[J].生理學(xué)報(bào),2009,61(5):424-430.

[14]郝娟,王春蓮,王培嵩,等.雷公藤多甙片致卵巢早衰大鼠動(dòng)物模型的研究[J].中國(guó)婦幼保健,2012,27(12):1866-1870.

[15]孫莉莉,周酈楠.卵巢早衰動(dòng)物模型造模[J].中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥,2011,6(19):229-230.