朱 江,高 蕾
(1.成都學(xué)院 醫(yī)護(hù)學(xué)院 病原免疫教研室,四川 成都610106;2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 輸血研究所,四川 成都610052)
中國(guó)是乙型肝炎的高流行區(qū),一般人群乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)陽(yáng)性率為7.18%[1]。目前,治療乙型肝炎的主要方法是干擾素和核苷類似物。使用的干擾素均是外源性干擾素,有很多乙肝患者對(duì)于干擾素不敏感,導(dǎo)致治療無(wú)效,且干擾素需要長(zhǎng)期使用,增加了患者的負(fù)擔(dān)[2]。重組腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus,AAV)載體被廣泛應(yīng)用到基因治療和臨床前或臨床實(shí)驗(yàn)中,嘗試著進(jìn)行多種疾病的治療[3-4]。HepG2.2.15細(xì)胞能產(chǎn)生完整的HBV,穩(wěn)定分泌HBsAg 和HBeAg,常被作為體外評(píng)估抗HBV 藥物效果的細(xì)胞模型[5]。本實(shí)驗(yàn)利用重組病毒AAV-IFN 感染HepG2.2.15細(xì)胞的方法,介導(dǎo)干擾素在體內(nèi)表達(dá),產(chǎn)生內(nèi)源性干擾素并對(duì)其抗病毒效果進(jìn)行評(píng)估。
1.1.1 材料:細(xì)胞及質(zhì)粒:293T細(xì)胞、HepG2.2.15細(xì)胞、pAAV-IFN(將IFN 基因克隆于去除Rep 和Cap 基因的含有腺相關(guān)病毒6型TR 結(jié)構(gòu)的pAAV骨架質(zhì)粒中獲得)、Pxx680(輔助質(zhì)粒)、Pxr2、Pxr6、Pxr7、pXR8(包裝質(zhì)粒)、pSC-gfp (含有綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒)和PCP10(含有2個(gè)拷貝HBV 基因組的質(zhì)粒作為Q-PCR 進(jìn)行HBV 定量的標(biāo)準(zhǔn)品)(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院輸血研究所輸血傳播疾病研究實(shí)驗(yàn)室凍存)。
試劑:DMEM 高糖培養(yǎng)基和青霉素-鏈霉素(Hyclone 公司);血清(Gbico 公司);G418 和MTT 試劑盒(Sigma 公司);DNeasy blood& tissue kits(Qiagen 公司);人HBsAg ELISA 檢測(cè)試劑盒和人HBeAg ELISA檢測(cè)試劑盒(泉州市藍(lán)圖生物技術(shù)有限公司);小鼠ALT ELISA 檢測(cè)試劑盒和小鼠AST ELISA 檢測(cè)試劑盒(Quantikine? ELISA 公司);Fast Start Universal SYBR Green Master[Rox](Roche 公司);小鼠α 干擾素(IFNα)定量檢測(cè)試劑盒(R&D 公司)。
1.1.2 小鼠:SPF級(jí)BABL/c 小鼠,雄性,8~10周齡,體質(zhì)量(18±2)g[成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司,合格證號(hào):scxk(川)2013-24]。
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):293T細(xì)胞培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基(DMEM 加入10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素);HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基并加入終濃度為400 mg/L的G418;培養(yǎng)條件均為37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
1.2.2 重組病毒的制備與純化:轉(zhuǎn)染的前1 d,將匯合度達(dá)到90%以上的293T細(xì)胞,5% CO2、37℃培養(yǎng)。當(dāng)293T細(xì)胞匯合度達(dá)到80%~90%時(shí)按1∶3的比例分成3盤,接種于新的培養(yǎng)皿內(nèi),利用3 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)染,培養(yǎng)72 h 以后,收獲病毒。收獲的病毒利用氯化銫超速離心法進(jìn)行純化。
1.2.3 重組病毒AAV-GFP 感染HepG2.2.15細(xì)胞:感染的前1 d,將HepG2.2.15細(xì)胞以4×104個(gè)/孔接種于6孔板。次日,吸取6孔板內(nèi)培養(yǎng)基,將2、6、7 和8 血清型的AAV-GFP 以MOI =103的感染劑量,分別接種于HepG2.2.15細(xì)胞,孵育1 h,傾倒出感染液,加入新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。感染72 h后,在熒光顯微鏡下觀察GFP 在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)情況。
同時(shí)以質(zhì)粒pSC-GFP 轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照,HepG2.2.15細(xì)胞接種初始4×104個(gè)/孔,質(zhì)粒pSC-GFP 用量3μg,轉(zhuǎn)染試劑PEI 用量9 μg,轉(zhuǎn)染72 h,熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)情況。
1.2.4 IFN 體內(nèi)和體外穩(wěn)定表達(dá)驗(yàn)證:設(shè)置PBS 空白對(duì)照組、AAV-GFP 陰性對(duì)照組、pAAV-IFN 轉(zhuǎn)染陽(yáng)性對(duì)照組和AAV6-IFN 實(shí)驗(yàn)組。
AAV6-IFN 感染HepG2.2.15細(xì)胞,感染方法同上,感染劑量為MOI =104,分別于1,3,6和9 d 收獲培養(yǎng)上清,并利用ELISA 試劑盒測(cè)量上清中IFNα的表達(dá)量。
同時(shí)將AAV6-IFN 以5×1010μg/只的劑量,經(jīng)尾靜脈注射,在1、2、3 及6月取小鼠血液,將小鼠血液冰上放置30 min后,3 000 r/min 離心,收獲血清-20℃凍存?zhèn)溆?。全部樣本用ELISA 試劑盒檢測(cè)小鼠血清中IFN表達(dá)情況、ALT(丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶)和AST(天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶)含量變化。
1.2.5 重組AAV6-IFN 病毒感染HepG2.2.15細(xì)胞:AAV6-IFN 感染HepG2.2.15細(xì)胞,感染劑量為MOI=104,于1,3,6和9 d 收獲各組培養(yǎng)上清及細(xì)胞。ELISA 試劑盒測(cè)量上清中HBsAg 和HBeAg的變化,并利用DNeasy blood & tissue kits 提取培養(yǎng)上清和細(xì)胞中總DNA,qPCR 方法定量培養(yǎng)上清和細(xì)胞中HBV DNA 含量的變化。對(duì)HBV DNA 定量的qPCR 反應(yīng)上游引物為5'-CGTTTTTGCCTTCTGACTT CTTTC-3',下游引物為5'-ATAGGATAGGGGCATTTG GTGGTC-3',擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為372 bp;同時(shí)以質(zhì)粒PCP10(包含2個(gè)拷貝的HBV 基因組的質(zhì)粒)為標(biāo)準(zhǔn)品,進(jìn)行10倍梯度稀釋,以1.0×103~1.0×109copy/mL繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.2.6 MTT法檢測(cè)HepG2.2.15細(xì)胞增殖:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板中,每孔接種4×104個(gè)。培養(yǎng)12 h后,洗掉培養(yǎng)液,換1% 胎牛血清的培養(yǎng)基同步化12 h。設(shè)置PBS 為空白對(duì)照組;AAV-GFP 為陰性對(duì)照組;pAAV-IFN 為轉(zhuǎn)染陽(yáng)性對(duì)照組;AAV6-IFN 為實(shí)驗(yàn)組。劑量同上,每組樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔,37℃、5% CO2孵箱分別培養(yǎng)24、48和72 h,每孔加入20 μL MTT 溶液(5 g/L),繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清液,每孔加入150 μL 二甲基亞砜,置搖床上低速振蕩10 min,使結(jié)晶物充分溶解。用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)570 nm 處測(cè)定A值,按以下公式計(jì)算抑制率:
抑制率=(空白對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值)/空白對(duì)照組A值×100%。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用SPSS 17.0 軟件,隨機(jī)分組進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn),結(jié)果以小鼠測(cè)量值的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較使用方差分析。
在感染72 h后,AAV6-GFP(圖1B)較其他血清型AAV2-GFP(圖1A),AAV7-GFP(圖1C),AAV8-GFP(圖1D),對(duì)于HepG2.2.15細(xì)胞有更強(qiáng)的感染效率。同時(shí)以PBS代替AAV-GFP 作為陰性對(duì)照(圖1F),72 h后未見(jiàn)GFP表達(dá);以質(zhì)粒pSC-GFP 轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞的陽(yáng)性對(duì)照可明顯觀察到GFP表達(dá)(圖1E)。
圖1 不同血清型AAV-GFP 感染HepG2.2.15細(xì)胞后GFP的表達(dá)Fig1 Expression of GFP in HepG2.2.15 cells infected with different serotype AAV(×400)
AAV6-IFNα 感染HepG2.2.15細(xì)胞3 d后,培養(yǎng)上清液中能檢測(cè)出IFNα的表達(dá);持續(xù)感染9 d后,表達(dá)量可達(dá)(36.63±3.27)ng/mL;同時(shí)質(zhì)粒pAAV-IFNα 轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)上清中也檢測(cè)到IFN表達(dá),但是IFNα表達(dá)量沒(méi)有AAV6-IFNα 感染組多(P<0.01)(圖2A)。
將AAV6-IFNα 尾靜脈注射小鼠1個(gè)月后即可檢測(cè)出血清中IFNα 為(191±19)ng/mL,隨后血清中IFNα濃度保持穩(wěn)定,6個(gè)月時(shí)IFNα濃度降低了29.28%(圖2B)。
注射AAV6-IFNα 6個(gè)月后小鼠血清中ALT 和AST 與對(duì)照PBS組和AAV6-GFP 組相對(duì)比沒(méi)有區(qū)別(圖2C,D)。
對(duì)各組HepG2.2.15細(xì)胞表達(dá)HBV DNA 檢測(cè)顯示,培養(yǎng)9 d后AAV6-IFNα 組抑制率[(空白組-實(shí)驗(yàn)組)/空白組×100%]可達(dá)40.13%(圖3A);而AAV6-IFNα 組對(duì)培養(yǎng)上清中HBV DNA的抑制效果在感染3 d時(shí)即逐漸呈現(xiàn),在感染9 d時(shí)抑制率可達(dá)62.93%(圖3B)。同時(shí)測(cè)量培養(yǎng)上清中HBsAg 和HBeAg 含量變化,感染9 d后HBsAg 和HBeAg的抑制率分別為47.33%和37.49%(圖3C,D)。HBsAg的抑制效果在感染3 d 以后逐漸呈現(xiàn),而HBeAg的抑制效果在感染6 d 以后逐漸呈現(xiàn)。AAV6-IFNα 組與轉(zhuǎn)染陽(yáng)性對(duì)照組相比,對(duì)于HBV的復(fù)制和表達(dá)抑制效果更為明顯,持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)(P<0.05)。
圖2 AAV6 有效介導(dǎo)IFN 在體內(nèi)外表達(dá)且不引起急性反應(yīng)Fig2 Expression of IFN mediated effectively by AAV6 with no acute inflammatory reaction in vivo and in vitro
圖3 AAV6-IFNα體外有效抑制HBV的復(fù)制與表達(dá)Fig3 The replication and expression of HBV inhibited by AAV-IFNα in vitro
AAV6-IFN 作用于HepG2.2.15細(xì)胞48、72 h后,可表現(xiàn)明顯的抑制作用,抑制率分別為35%、69%,并呈現(xiàn)時(shí)間依賴關(guān)系(圖4)。
圖4 AAV6-IFNα 對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用Fig4 The proliferation of HepG2.2.15 cells inhibited by AAV6-IFNα
乙肝為高發(fā)傳染病,目前治療主要以干擾素及核苷類似物為主。干擾素的長(zhǎng)期使用給患者帶來(lái)痛苦和金錢負(fù)擔(dān)。AAV 載體具有無(wú)致病性,低免疫原性,可介導(dǎo)外源基因長(zhǎng)期表達(dá)等優(yōu)點(diǎn),已嘗試用于多種疾病的治療[3-4]。本實(shí)驗(yàn)嘗試用AAV 載體來(lái)介導(dǎo)IFNα的長(zhǎng)期表達(dá),從而減少IFNα 注射次數(shù),減輕乙肝患者的痛苦。
不同AAV 血清型對(duì)組織的感染率不同,用重組AAV 轉(zhuǎn)染獼猴、小鼠和人的造血干細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)AAV1 轉(zhuǎn)染小鼠造血干細(xì)胞的能力強(qiáng),而AAV6 轉(zhuǎn)染人造血干細(xì)胞的能力強(qiáng)[6],但采用AAV 對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的感染效率的評(píng)估鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)AAV6 對(duì)于HepG2.2.15細(xì)胞具有更強(qiáng)的感染性,更適合作為體外介導(dǎo)IFN 在HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的載體。
利用AAV6-IFNα 感染HepG2.2.15細(xì)胞和尾靜脈注射小鼠的方法,在培養(yǎng)上清液和小鼠血清中均檢測(cè)到IFNα的表達(dá),說(shuō)明利用AAV 載體介導(dǎo)HepG2.2.15細(xì)胞表達(dá)IFN 具有可行性。模型小鼠在長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月內(nèi)均有IFN的表達(dá),說(shuō)明AAV6 載體可介導(dǎo)IFN 長(zhǎng)期表達(dá),體現(xiàn)了AAV6 作為載體的優(yōu)越性。同時(shí)實(shí)驗(yàn)還對(duì)AAV6-IFN 安全性進(jìn)行了檢測(cè),注射AAV6-IFN 小鼠的血清中反應(yīng)肝細(xì)胞損傷的指標(biāo)ALT 和AST 變化均與對(duì)照組沒(méi)有顯著區(qū)別。
體外AAV6-IFNα 感染HepG2.2.15細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)表達(dá)的內(nèi)源性IFNα 對(duì)HBV DNA、HBsAg 和HBeAg均有顯著的抑制作用,抑制率可達(dá)50%以上,與陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒pAAV-IFN 轉(zhuǎn)染組相比,AAV6-IFNα 組抑制時(shí)間更長(zhǎng)效果更顯著。
AAV6-IFNα 能顯著抑制HepG2.2.15細(xì)胞的增殖,并有時(shí)間依賴性,這可能是AAV6-IFNα 抑制HepG2.2.15細(xì)胞HBV 復(fù)制與表達(dá)的原因。因此,AAV6-IFNα是一種潛在的抗HBV 藥物。但是還需要進(jìn)一步將AAV6-IFN 在乙型肝炎小鼠模型上進(jìn)行抗病毒效果的評(píng)估,觀察其體內(nèi)抑制HBV的復(fù)制和表達(dá)的能力及機(jī)制,本研究為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
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