張 晶，邵 月，張力恒，冉瑞圖，孫嘉政，張巖巖，賈道勇，張夢(mèng)思，王亞平

(重慶醫(yī)科大學(xué) 干細(xì)胞與組織工程研究室 組織胚胎學(xué)教研室， 重慶 400016)

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研究論文

人參皂苷Rg1緩解D-半乳糖致衰老大鼠脾損傷

張 晶，邵 月，張力恒，冉瑞圖，孫嘉政，張巖巖，賈道勇，張夢(mèng)思，王亞平*

(重慶醫(yī)科大學(xué) 干細(xì)胞與組織工程研究室 組織胚胎學(xué)教研室， 重慶 400016)

目的探討人參皂苷Rg1對(duì)D-半乳糖致衰老大鼠脾組織結(jié)構(gòu)與功能的影響及其機(jī)制。方法SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、衰老模型組(D-半乳糖120 mg/kg,qd×42 d)、Rg1干預(yù)組(建模，第15 天起Rg1 20 mg/kg,qd×28 d)、Rg1對(duì)照組(0.9%氯化鈉注射液+Rg1)。取脾臟測(cè)定脾指數(shù)，石蠟切片觀察脾臟顯微形態(tài)，β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色檢測(cè)脾細(xì)胞衰老，CCK-8檢測(cè)脾細(xì)胞對(duì)刀豆蛋白A刺激的增殖能力，ELISA檢測(cè)IL- 2、IL- 6和晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)含量，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞活性氧(ROS)，酶法檢測(cè)丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)含量，Western blot檢測(cè)細(xì)胞衰老相關(guān)蛋白P53、P21及Rb的表達(dá)。結(jié)果與衰老模型組比較，Rg1干預(yù)組大鼠脾指數(shù)、脾臟白髓面積比及脾細(xì)胞增殖能力提高(P<0.05)；脾細(xì)胞分泌IL- 2、IL- 6水平和SOD活性明顯增強(qiáng)(P<0.01)；脾細(xì)胞的SA-β-Gal陽(yáng)性率、ROS和MDA含量下降(P<0.01)；AGEs 下降(P<0.05)；P53、P21及RB蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)。結(jié)論人參皂苷Rg1能緩解D-半乳糖致衰大鼠脾損傷，其機(jī)制可能與抑制氧化損傷和下調(diào)P53-P21-RB信號(hào)通路有關(guān)。

人參皂苷Rg1；衰老模型；脾臟；大鼠

人參皂苷Rg1(ginsenoside Rg1)是人參重要的藥效成分，可調(diào)控衰老及延緩造血干細(xì)胞衰老[1]。免疫系統(tǒng)的主要細(xì)胞起源于造血干細(xì)胞，推測(cè)人參皂苷Rg1可以延緩免疫系統(tǒng)衰老，調(diào)控免疫細(xì)胞的功能。脾臟是機(jī)體最大的免疫器官，在免疫功能調(diào)控中具有重要作用。本研究探討人參皂苷Rg1對(duì)D-半乳糖致衰大鼠脾結(jié)構(gòu)與功能的影響及其機(jī)制，為尋找延緩免疫系統(tǒng)衰老的天然藥物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

3月齡清潔級(jí)雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量180～200 g，[重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK(渝)2007- 0001]。人參皂苷Rg1(吉林宏久生物技術(shù)有限公司，純度≥98.6%)；D-半乳糖和ConA(Sigma公司)；IL- 2和IL- 6檢測(cè)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；RPMI- 1640培養(yǎng)基(Gibco公司)；胎牛血清(Hyclon公司)；CCK- 8試劑盒(上海七海復(fù)泰生物公司)；SA-β-Gal染色試劑盒、ROS與MDA試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)； AGEs 試劑盒(上海源葉生物技術(shù)有限公司)；P53、P21和RB兔抗鼠多克隆抗體(Prointech公司)；羊抗兔二抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠衰老模型復(fù)制與給藥[2- 3]:將大鼠隨機(jī)分為4組，每組10只。正常對(duì)照組：注射0.9%氯化鈉溶液qd×42 d；衰老模型組：皮下注射D-半乳糖120 mg/kg,qd×42 d；Rg1干預(yù)組：注射D-半乳糖劑量與時(shí)間同衰老模型組，第15天起腹腔注射Rg1 20 mg/kg,qd×28 d；Rg1對(duì)照組：注射等量0.9%氯化鈉溶液qd×14 d，第15天起腹腔注射Rg1(同Rg1干預(yù)組)。

1.2.2 脾指數(shù)測(cè)定與形態(tài)學(xué)觀察:藥物注射后第2 天稱大鼠體質(zhì)量(kg)，取脾臟稱濕重(mg)，測(cè)定脾指數(shù)[脾指數(shù)=脾臟濕重(mg)/體質(zhì)量(kg)]。常規(guī)石蠟切片，HE染色，連續(xù)切片顯微鏡下觀察，以Image J 軟件計(jì)算脾白髓占脾組織切片的比例。

1.2.3 β-半乳糖苷酶染色檢測(cè)脾細(xì)胞衰老:制備脾臟冷凍組織切片，按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行SA-β-Gal酶染色[3]，光鏡下觀察分析，計(jì)算各組大鼠衰老脾細(xì)胞百分比。

1.2.4 CCK- 8檢測(cè)脾細(xì)胞增殖能力:制備脾單細(xì)胞懸液[4]，每孔5×103細(xì)胞 /200 μL 接種于96孔板中，每孔加終濃度5 mg/L的ConA，分別培養(yǎng)0、1、2、3和4 d，各孔加10 μL CCK- 8，450 nm波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值(A值)。

1.2.5 ELISA檢測(cè)脾細(xì)胞分泌IL- 2及IL- 6水平:按1.2.4方法制備和培養(yǎng)脾細(xì)胞，培養(yǎng)48 h，收集培養(yǎng)上清液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)各組上清液中IL- 2及IL- 6含量。

1.2.6 ELISA檢測(cè)血清中晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)含量:采取外周血，4 ℃過(guò)夜后收集血清，2 500 r/min×20 min，離心2次，吸上清液，按ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清中AGEs含量。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)及酶法檢測(cè)細(xì)胞氧化及抗氧化能力:收集1.2.4制備的各組脾細(xì)胞，加入1 mL DCFH-DA，37 ℃ 孵育 25 min，培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾細(xì)胞內(nèi)ROS水平，以 DCF的平均熒光強(qiáng)度表示其含量。收集培養(yǎng)上清液，酶法檢測(cè)SOD與 MDA的含量。

1.2.8 Western blot檢測(cè)衰老相關(guān)蛋白:提取各組脾細(xì)胞總蛋白，調(diào)整蛋白濃度40 μg/泳道，12% SDS-PAGE凝膠電泳分離，移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，P53、P21和RB一抗(均1∶200)、β-actin抗體(1∶4 000)4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h，洗膜，ECL發(fā)光系統(tǒng)顯色。用FluorSTM Multimager 圖像分析儀，Quality-One4.11軟件進(jìn)行圖像灰度掃描。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷Rg1對(duì)衰老大鼠脾指數(shù)與組織形態(tài)學(xué)的影響

衰老模型組脾臟指數(shù)明顯下降(P<0.01)，Rg1干預(yù)組能顯著增加脾指數(shù)(P<0.05)(表1)。衰老模型組白髓與紅髓界限模糊，白髓面積比顯著下降(P<0.01)， Rg1干預(yù)組大鼠脾白髓面積比增加(P<0.05)(表1，圖1)。

表1 各組大鼠的脾指數(shù)及白髓面積比

*P<0.01 compared with normal control group；#P<0.05 compared with aging model group.

圖1 各組大鼠脾臟的組織形態(tài) Fig 1 Spleen structure in each group (×100)

2.2 人參皂苷Rg1對(duì)衰老大鼠SA-β-Gal染色陽(yáng)性脾細(xì)胞影響

脾細(xì)胞胞質(zhì)呈藍(lán)色為SA-β-Gal陽(yáng)性細(xì)胞，著色深淺與著色面積同脾細(xì)胞衰老程度呈正相關(guān)。衰老模型組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增多(P<0.01)，Rg1干預(yù)組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.01)(圖2，3)。

圖2 各組大鼠脾臟SA-β-Gal染色結(jié)果Fig 2 SA-β-Gal staining positive splenocytes in each group(×200)

*P<0.01 compared with normal control group；#P<0.01 compared with aging model group圖3 各組大鼠SA-β-Gal染色陽(yáng)性脾細(xì)胞數(shù)量比較Fig 3 SA-β-Gal staining positive splenocytes

2.3 人參皂苷Rg1對(duì)衰老大鼠血清中晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)含量的影響

衰老模型組的AGEs含量顯著增加(P<0.05)；Rg1干預(yù)組能顯著降低血清AGEs含量(P<0.01)(表2)。

表2 各組大鼠血清中AGEs含量比較

*P<0.01 compared with normal control group；#P<0.05 compared with aging model group.

2.4 人參皂苷Rg1對(duì)衰老大鼠脾細(xì)胞增殖能力的影響

衰老模型組大鼠脾細(xì)胞對(duì)ConA刺激的增殖能力明顯降低(P<0.05)；Rg1干預(yù)組大鼠脾細(xì)胞對(duì)ConA刺激的增殖能力增強(qiáng)(P<0.05)(圖4)。

*P<0.05,**P<0.01 compared with normal control group；#P<0.05 compared with aging model group圖4 各組大鼠脾細(xì)胞增殖能力比較Fig 4 Proliferative rate of splenocytes in each

2.5 人參皂苷Rg1對(duì)衰老大鼠脾細(xì)胞分泌IL- 2和IL- 6水平的影響

衰老模型組大鼠脾細(xì)胞分泌IL- 2和IL- 6水平明顯降低(P<0.01)；Rg1干預(yù)組大鼠脾細(xì)胞分泌IL- 2和IL- 6水平回升(P<0.01)(表3)。

2.6 人參皂苷Rg1對(duì)衰老大鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生活ROS、SOD及MDA水平的影響

衰老模型組大鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生ROS、MDA水平顯著升高(P<0.01)，SOD 活性顯著下降(P<0.01)；Rg1干預(yù)組大鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生ROS、MDA水平明顯降低(P<0.01)，SOD 活性顯著升高(P<0.01)(表4)。

表3 各組大鼠脾細(xì)胞分泌IL- 2和 IL- 6水平比較

*P<0.01 compared with normal control group；#P<0.01 compared with aging model group.

表4 各組大鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生活ROS、SOD與MDA水平比較

*P<0.01 compared with normal control group；#P<0.01 compared with aging model group.

2.7 人參皂苷Rg1對(duì)衰老大鼠脾細(xì)胞表達(dá)P21、P53及RB蛋白的影響

正常對(duì)照組P21、P53及RB蛋白低表達(dá)，衰老模型組P21、P53及Rb蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，Rg1干預(yù)組脾細(xì)胞中P21、P53及RB蛋白表達(dá)量有所降低(P<0.01)(表5，圖5)。

表5 各組大鼠脾細(xì)胞P53、P21及RB蛋白表達(dá)

*P<0.01 compared with normal control group；#P<0.01 compared with aging model group.

1.normal control group；2.Rg1 control group；3.aging model group；4.Rg1 intervention group圖5 各組大鼠脾細(xì)胞P53、P21及RB蛋白條帶Fig 5 P21、P53 and RB protein bands in each group

3 討論

本實(shí)驗(yàn)探究Rg1對(duì)D-半乳糖致衰大鼠脾結(jié)構(gòu)與功能影響，從抗氧化損傷和調(diào)控P53-P21-RB信號(hào)通路兩方面研究Rg1緩解脾損傷及脾衰老的機(jī)制。

本研究采用D-半乳糖致大鼠衰老模型，發(fā)現(xiàn)大鼠脾指數(shù)、脾臟白髓面積比、脾細(xì)胞對(duì)ConA作用的增殖能力及分泌IL- 2、IL- 6水平均明顯下降，SA-β-Gal染色陽(yáng)性率增加，提示D-半乳糖建立的衰老模型可導(dǎo)致大鼠脾臟結(jié)構(gòu)與功能損傷，可用于免疫器官衰退相關(guān)生物學(xué)研究[5- 6]。

脾指數(shù)是代表脾臟大體形態(tài)的重要指標(biāo)，而脾臟白髓是脾臟組織學(xué)的實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)。Rg1明顯減輕脾臟萎縮程度，提高脾指數(shù)和脾臟白髓面積比例，提示Rg1能拮抗D-半乳糖對(duì)脾臟結(jié)構(gòu)的破壞。研究脾細(xì)胞的功能狀態(tài)能有效反映脾臟功能。Rg1可提高脾細(xì)胞對(duì)ConA刺激的增殖能力和分泌IL- 2及IL- 6水平，減少SA-β-Gal染色陽(yáng)性率及AGEs積聚，提示Rg1能緩解D-半乳糖誘導(dǎo)的脾細(xì)胞衰老，促進(jìn)脾細(xì)胞增殖，激活脾細(xì)胞功能。

細(xì)胞內(nèi)ROS水平增加和抗氧化能力下降是導(dǎo)致細(xì)胞衰老的關(guān)鍵因素[7]。ROS可作用于脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，產(chǎn)生MDA，其具有細(xì)胞毒性；還可作為細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和基因表達(dá)調(diào)控分子，對(duì)細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞衰老具有調(diào)控作用[8- 9]。機(jī)體中SOD能有效清除生物氧化產(chǎn)生的超氧陽(yáng)離子自由基[10]。本實(shí)驗(yàn)證明， Rg1可明顯減少脾細(xì)胞產(chǎn)生ROS和MDA水平，顯著提升SOD的活性，表明Rg1可能通過(guò)抑制D-半乳糖所致的氧化損傷，延緩大鼠的脾衰老。

P53-P21-Rb是重要的細(xì)胞衰老信號(hào)傳導(dǎo)通路，抑癌基因P53的激活可上調(diào)P21的表達(dá)，從而抑制CDK2/Cyclin E復(fù)合物的活性，阻止細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)變[11- 12]。P21是一種細(xì)胞周期抑制蛋白，可通過(guò)抑制細(xì)胞CDK2 和CDK4 的活性，進(jìn)而抑制Rb和轉(zhuǎn)錄因子(E2F)的磷酸化過(guò)程，誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)停滯[13]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1能顯著降低衰老大鼠脾細(xì)胞P53、P21及RB蛋白的表達(dá)，推測(cè)Rg1可以下調(diào)P53-P21-RB衰老信號(hào)通路，這可能是Rg1緩解大鼠脾衰老或損傷機(jī)制之一。

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新聞點(diǎn)擊

對(duì)抗腦癌新療法——釣出癌細(xì)胞

據(jù)英國(guó)《BBC新聞》(BBC NEWS)2014年2月19日?qǐng)?bào)道，美國(guó)研究人員公布治療腦癌的新療法，使用納米纖維從腦部誘出癌細(xì)胞。

這套療法利用與腫瘤擴(kuò)散相同的方法，將癌細(xì)胞“誘離”。研究人員利用聚合物制作出一種纖維，纖維表面模仿癌細(xì)胞通常通過(guò)的神經(jīng)與血管結(jié)構(gòu)，植入長(zhǎng)有人類神經(jīng)膠母細(xì)胞瘤的小鼠腦部。這種纖維的直徑只有人類頭發(fā)的一半，用來(lái)引導(dǎo)腫瘤，將移動(dòng)中的癌細(xì)飽引至含有環(huán)巴胺(cyclopamine)的“腫瘤采集膠”。環(huán)巴胺可用來(lái)毒殺癌細(xì)胞。

專家認(rèn)為，這項(xiàng)技術(shù)能有效反對(duì)最具侵襲性癌癥之一的神經(jīng)膠母細(xì)胞瘤(glioblastom)。神經(jīng)膠母細(xì)胞瘤如此難以治愈的因素之一是惡性細(xì)胞，可通過(guò)神經(jīng)纖維與血管擴(kuò)散到其他部位。

如今研究人員已經(jīng)學(xué)會(huì)如何阻滯這種移動(dòng)機(jī)制，使用比人發(fā)纖細(xì)的納米纖維膜，把腫瘤細(xì)胞誘離。

主要研究人員、美國(guó)喬治亞理工學(xué)院暨艾莫瑞大學(xué)(Georgia Tech and Emory University)柯?tīng)柼厣镝t(yī)學(xué)工程系(Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering)系主任貝勒康達(dá)(Ravi Bellamkonda)說(shuō)：“我們?cè)O(shè)計(jì)了聚合物納米纖維膜，模仿腦瘤細(xì)胞用來(lái)入侵其他部位的神經(jīng)與血管結(jié)構(gòu)?！?/p>

這項(xiàng)技術(shù)發(fā)表于2014年《自然材料》(Nature Materials)期刊上。

高齡產(chǎn)婦胎兒出現(xiàn)先天性異常概率未必增高

據(jù)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(PNAS)網(wǎng)站(2014-02-19)報(bào)道，最近在母體與胎兒醫(yī)學(xué)會(huì)年會(huì)上，一項(xiàng)美國(guó)研究報(bào)導(dǎo)了一個(gè)令人驚訝的新發(fā)現(xiàn)，與年輕產(chǎn)婦相比，高齡產(chǎn)婦所懷的胎兒出現(xiàn)某些先天性異常的狀況反而比較少。這顯然與過(guò)去的認(rèn)知相反，研究也表示這是初步性的發(fā)現(xiàn)，未來(lái)還需進(jìn)一步研究。

研究分析，華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院進(jìn)行第二孕期超聲波檢查的76 000個(gè)胎兒數(shù)據(jù)分析，這些數(shù)據(jù)橫跨18年。研究以孕婦35歲作為分界線，經(jīng)過(guò)調(diào)整煙酒使用、妊娠糖尿病、非裔美國(guó)人族群等變項(xiàng)后，發(fā)現(xiàn)只有1.7%高齡產(chǎn)婦的胎兒有重大先天性缺陷，但35歲以下的年輕孕婦有相同情形的比例卻為2.6%。其中高齡產(chǎn)婦之胎兒出現(xiàn)較少的重大缺陷項(xiàng)目，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腎臟及腹壁缺陷。心臟缺陷兩組無(wú)顯著差異。

研究推測(cè)這可以用“適者生存”的道理來(lái)解釋，年長(zhǎng)女性若懷有重大缺陷的胎兒，最后可能都會(huì)以妊娠失敗或流產(chǎn)結(jié)束，而可以存活下來(lái)的通常會(huì)是正常的胎兒。此外，年長(zhǎng)的媽媽可能也比較注重健康的生活型態(tài)(補(bǔ)充產(chǎn)前維生素、均衡飲食及運(yùn)動(dòng))，有益胎兒健康發(fā)展。不過(guò)由于研究缺乏包括父親年齡、罕見(jiàn)不良事件等信息，所以難以找出造成這個(gè)研究結(jié)果背后真正的原因。

研究主要作者Goetzinger醫(yī)學(xué)博士認(rèn)為，這個(gè)結(jié)果并非要降低對(duì)高齡產(chǎn)婦進(jìn)行基因性異常的檢測(cè)或其他懷孕風(fēng)險(xiǎn)的重視，高齡婦女懷孕生下健康寶寶的概率可能比我們以前所想的要高一些。

該研究刊登于新一期母體與胎兒醫(yī)學(xué)會(huì)年會(huì)(Annual meeting of the Society of Maternal-Fetal Medicine)。

Ginsenoside Rg1 relieves the injure of the spleen in aging rats induced by D-galactose

ZHANG Jing, SHAO Yue, ZHANG Li-heng, RAN Rui-tu, SUN Jia-zheng, ZHANG Yan-yan,JIA Dao-yong, ZHANG Meng-si, WANG Ya-ping*

(Dept. of Histology and Embryology, Laboratory of Stem Cell and Tissue Engineering, Chongqing Medical University, Chongqing 400016,China)

Objective To investigate the effect of ginsenoside Rg1 on the spleen structure and function of aging rats and its relative mechanism.Methods Forty SD rats were randomly divided into normal control group, aging model group (D-galactose 120 mg/kg,qd×42 d), Rg1 intervention group(D-galactose 120 mg/kg,qd×42 d and Rg1 20 mg/kg, from day 15th,qd×28 d) and Rg1 control group. After finishing injections the spleen index was measured, paraffin sections were then made to observe spleen microscopic structure. Senescence-associated β-Galactosidase(SA-β-Gal) stain was used to detect aging splenocytes. The proliferative capacity of splenocytes stimulated with Concanavalin A (ConA) was measured by CCK- 8. The content of IL- 2,IL- 6 and advanced glycosylation end products(AGEs) was detected by ELISA. The level of ROS was analyzed by flow cytometry(FCM). Malondialdehyde(MDA), superoxide dismutase (SOD) were detected by enzymatic assay. The expression of senescence-associ-ated protein P53,P21 and RB were detected by Western blot analysis. Results Comparing the Rg1 intervention group with the aging model group, spleen index, splenic white pulp area proportion, the proliferative capacity of splenocytes were significantly increased (P<0.05);The secretory capability of IL- 2 and IL- 6, the active content of SOD were obviously increased(P<0.01);The percentage of SA-β-Gal positive splenocytes, the productions of ROS and MDA were significantly decreased (P<0.01);The production of AGEs was decreased (P<0.05);The expressions of P53,P21 and Rb were also significantly down-regulated (P<0.01).Conclusions Ginsenoside Rg1 relieves injure of the spleen in aging rats induced by D-galactose.It is suggested that the mechanism may be Rg1 inhibiting oxidative stress and down-regulating P53-P21-RB signaling pathway.

ginsenoside Rg1; aging model; spleen; rat

2015- 03- 19

2015- 05- 27

國(guó)家自然科學(xué)基金(30973818)；國(guó)家教育部博士導(dǎo)師基金(20125503110006)；重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)生創(chuàng)新基金(201314)

1001-6325(2015)10-1308-06

R392.5

A

*通信作者(corresponding author)：ypwangcq@aliyun.com