張曉麗，米小軼

(1.沈陽市婦嬰醫(yī)院生殖中心, 遼寧 沈陽 110014； 2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 病理科， 遼寧 沈陽 110001)

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研究論文

轉(zhuǎn)染pcDNA3-TRAF4-DM-TRAF促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB- 231細(xì)胞增殖

張曉麗1，米小軼2*

(1.沈陽市婦嬰醫(yī)院生殖中心, 遼寧 沈陽 110014； 2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 病理科， 遼寧 沈陽 110001)

目的探討TRAF4在人乳腺癌細(xì)胞高表達(dá)時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響。方法本實(shí)驗(yàn)共分兩組：實(shí)驗(yàn)組(在乳腺癌細(xì)胞MDA-MB- 231中轉(zhuǎn)染pcDNA3-TRAF4-DM-TRAF質(zhì)粒)、對(duì)照組(轉(zhuǎn)染pcDNA3空質(zhì)粒)，用細(xì)胞免疫熒光及免疫印跡法檢測TRAF4的表達(dá)及定位，免疫印跡法檢測p70S6K及S6蛋白磷酸化，用流式細(xì)胞術(shù)檢測各期細(xì)胞比例，MTT方法檢測增殖能力。結(jié)果TRAF4在乳腺癌細(xì)胞MDA-MB- 231細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中均有表達(dá)，并且其在細(xì)胞核中的表達(dá)顯著低于細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)(P< 0.05)。在該細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3-TRAF4-DM-TRAF質(zhì)粒后，其細(xì)胞核內(nèi)TRAF4表達(dá)顯著升高(P< 0.05)， p70S6K及S6蛋白磷酸化水平顯著增加(P< 0.05，P< 0.01)，S期細(xì)胞比例顯著增加 (P< 0.01)，并且細(xì)胞增殖能力顯著上調(diào)(P< 0.01)。結(jié)論上調(diào)TRAF4在乳腺癌細(xì)胞MDA-MB- 231細(xì)胞核中的表達(dá)，可能通過促進(jìn)p70S6K及S6蛋白磷酸化而促進(jìn)該細(xì)胞的增殖。

乳腺癌；TRAF4；細(xì)胞增殖

腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(tumor necrosis factor receptor associated factors，TRAFs)是一類重要的胞質(zhì)銜接蛋白，主要參與腫瘤壞死因子受體(TNFR)家族和toll/白介素-1受體(TIR)家族成員的信號(hào)傳導(dǎo)。TRAF家族可以直接或間接的與TNFR的胞質(zhì)部分結(jié)合，調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路[1- 3]，如調(diào)節(jié)NF-κB和JNK的激活等，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、存活，分化與凋亡[4- 7]。TRAF4是腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子家族的一員，分子含有470aa，相對(duì)分子質(zhì)量53 ku，是首先從一組乳腺癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織中提取mRNA，構(gòu)建cDNA文庫，應(yīng)用cDNA文庫差異篩選法克隆出的。目前大多數(shù)學(xué)者的實(shí)驗(yàn)證明了TRAF4在人類癌癥中，例如乳腺癌、肺癌、卵巢腺癌、胰腺癌、膀胱癌等均呈高表達(dá)[8]。但TRAF4具體作用機(jī)制及其核、漿蛋白表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響是否一致仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)主要研究TRAF4在乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB- 231中的表達(dá)與定位，以及轉(zhuǎn)染pcDNA3-TRAF4-DM-TRAF后，對(duì)該細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞周期的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB- 231(美國菌種保藏中心)；L15培養(yǎng)基及胎牛血清(Gibico公司)；胰蛋白酶(Sigma公司)；抗體：TRAF4、S6、pS6、p70S6K、p-p70S6K、β-actin、NF-κB和Lamin B1(Abcam公司)；核漿蛋白抽提試劑盒(Pirece公司)；pcDNA3-TRAF4-DM-TRAF序列(Addgene公司)；Attractene質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑(Qiagen公司)；細(xì)胞裂解液及磷酸酯酶抑制劑(碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞用添加10%標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清及100單位青鏈霉素的L15培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 Western blot：細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS清洗3次，加入適量細(xì)胞裂解液和磷酸酯酶抑制劑，提取總蛋白。加樣，上樣蛋白量為50 μg。聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜后，室溫下5%正常小牛血清封閉2 h，將膜放在含相應(yīng)一抗的封閉液中，抗TRAF4(1∶1 000)、S6(1∶1 000)、pS6(1∶1 000)、p70S6K(1∶1 000)、p-p70S6K(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)、NF-κB(1∶500)和Lamin B1(1∶500)，4 ℃孵育過夜，與相應(yīng)二抗室溫孵育2h，膜取出后ECL顯色液顯色。結(jié)果經(jīng)自動(dòng)電泳凝膠成像分析儀采集，進(jìn)行吸光度值測定。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。

1.2.3 核漿蛋白抽提：詳見NE-PER蛋白抽提試劑盒說明書。

1.2.4 質(zhì)粒及轉(zhuǎn)染：根據(jù)制造商說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)?？召|(zhì)粒pcDNA3作為陰性對(duì)照。

1.2.5 四甲基偶氮唑鹽(tetrazolium, MTT)法：處于對(duì)數(shù)增殖期的乳腺癌細(xì)胞用0.25%的胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液(3×105個(gè)/ml)，分別接種于4 個(gè)96孔板培養(yǎng)板，將不同處理組細(xì)胞培養(yǎng)第24、48、72和96 h后分別加入MTT(5 g/L) 20 μL，繼續(xù)孵育4 h后，每孔加入150 μL DMSO 溶解結(jié)晶，選擇波長550 nm，在酶聯(lián)免疫(ELISA)檢測儀上測定各孔吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)：處于對(duì)數(shù)增殖期的乳腺癌細(xì)胞用不含有EDTA的胰蛋白酶消化，離心細(xì)胞(1 000 r/min，5 min)，收集5×105個(gè)細(xì)胞，加入500 μL結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，避光加入Annexin V 5 μL混勻后，再加入Propidium Iodide 5 μL混勻，室溫避光10 min，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測不同細(xì)胞周期細(xì)胞所占百分比。

1.2.7 免疫熒光檢測TRAF4蛋白的表達(dá)：取細(xì)胞1×104個(gè)接種于24孔板中進(jìn)行細(xì)胞爬片，待細(xì)胞增殖至70%左右進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光操作。4%多聚甲醛固定15 min，0.5% Triton-X- 100作用10 min，5%牛血清白蛋白(BSA)封閉30 min，加入TRAF4(1∶100)一抗，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，4 ℃濕盒16 h，PBS洗去一抗，加入相應(yīng)熒光二抗(1∶200)37 ℃避光孵育30 min，PBS洗去二抗，DAPI(1∶20)染核，室溫孵育30 min,PBS清洗封片，熒光顯微鏡觀察。

1.2.8 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：尼康倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，拍照記錄。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩樣本間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 TRAF4在乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB- 231中的表達(dá)與定位

TRAF4在乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB- 231的細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中均有表達(dá)，并且其在細(xì)胞核中的表達(dá)顯著低于細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)(P< 0.05)(圖1)。

2.2 轉(zhuǎn)染pcDNA3-TRAF4-DM-TRAF質(zhì)?？娠@著上調(diào)MDA-MB- 231細(xì)胞核表達(dá)

在人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB- 231中轉(zhuǎn)染pcDNA3-TRAF4-DM-TRAF質(zhì)粒之后， TRAF4在細(xì)胞核中的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)(圖2，3)。

2.3 MDA-MB- 231細(xì)胞核表達(dá)上調(diào)可明顯促進(jìn)p70S6K及S6蛋白磷酸化

在人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB- 231中轉(zhuǎn)染pcDNA3-TRAF4-DM-TRAF質(zhì)粒之后， p70S6K及S6蛋白磷酸化水平顯著上調(diào)(P<0.05,P<0.01)(圖4)。

2.4 MDA-MB- 231細(xì)胞核表達(dá)上調(diào)對(duì)細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞周期的影響

在該細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3-TRAF4-DM-TRAF質(zhì)粒后，該細(xì)胞增殖能力顯著上調(diào)(P<0.01)(圖5A)。S期細(xì)胞比例顯著增加(P<0.01)，G1期細(xì)胞所占比例顯著減少(P<0.01)(圖5B)。

3 討論

TRAF家族成員在以往的大多數(shù)研究中被證實(shí)在癌組織中高表達(dá)。研究組在之前的研究中也證實(shí)了TRAF1及TRAF2在乳腺癌組織中是過表達(dá)的[9- 10]。TRAF4在乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB- 231中的表達(dá)高于人正常乳腺細(xì)胞系MCF- 10A，在乳腺癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常乳腺組織[11- 12]。這些證據(jù)均提示TRAF4在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中可能起到了重要的作用。但其具體作用機(jī)制仍然不清楚。TRAF4是至今為止TRAF家族中唯一一個(gè)在細(xì)胞核中有表達(dá)的成員，這提示了也許細(xì)胞核中的TRAF4表達(dá)在其可能參與的信號(hào)傳導(dǎo)通路中起到一定的作用。本研究分別檢測了TRAF4在人乳腺癌MDA-MB- 231細(xì)胞中的表達(dá)及定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它可同時(shí)表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核，并且在細(xì)胞核中的表達(dá)要顯著低于細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)。基于不同細(xì)胞定位的表達(dá)差異，由此我們設(shè)想也許其亞細(xì)胞定位與其生物學(xué)功能相關(guān)。

在隨后的實(shí)驗(yàn)中，在人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB- 231中轉(zhuǎn)染pcDNA3-TRAF4-DM-TRAF質(zhì)粒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TRAF4細(xì)胞核表達(dá)顯著增加，細(xì)胞質(zhì)表達(dá)沒有明顯改變，這首先證明了在該細(xì)胞中TRAF結(jié)構(gòu)域缺失的TRAF4質(zhì)粒主要定位于細(xì)胞核。并且當(dāng)外源性干預(yù)導(dǎo)致TRAF4單純細(xì)胞核表達(dá)增加時(shí)，該細(xì)胞處于有絲分裂期的S期細(xì)胞所占比例顯著增加，同時(shí)在TNF-α誘導(dǎo)下，p70S6K及S6蛋白磷酸化水平顯著增加。p70S6 絲/蘇氨酸蛋白激酶是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞生長的重要蛋白激酶，p70S6K磷酸化可激活核糖體40S小亞基S6蛋白，使其易于結(jié)合翻譯復(fù)合物，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及細(xì)胞新陳代謝，從而影響細(xì)胞生長、增殖、分化及凋亡[13- 14]。p70S6K與TRAF4蛋白一樣，都是核漿穿梭蛋白，TRAF4與p70S6 K可以相互作用，并可激活其底物核糖體小亞基S6蛋白磷酸化[15]。也許TRAF4在細(xì)胞核中的高表達(dá)可能通過某種方式促進(jìn)p70S6K及S6蛋白磷酸化，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖，其具體的作用機(jī)制還有待于我們進(jìn)一步的探討。

A.immunofluorescent staining； B.Western blot圖1 TRAF4在乳腺癌細(xì)胞MDA-MB- 231中的表達(dá)Fig 1 The expression of TRAF4 in the breast cancer cell MDA-MB- 231(×400)

圖2 免疫熒光檢測pcDNA3-TRAF4-DM-TRAF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDA-MB- 231細(xì)胞后定位于細(xì)胞核

*P<0.01 compared with vector圖3 免疫印跡法檢測pcDNA3-TRAF4-DM-TRAF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDA-MB- 231細(xì)胞后定位于細(xì)胞核Fig 3 pcDNA3-TRAF4-DM-TRAF localized in nuclei after being transfected into MDA-MB- 231 by Western blot

*P<0.05 compared with vector and blank

A.the cell cycle by FCM；B.the cell proliferation by MTT; *P<0.01 compared with vector圖5 MDA-MB- 231細(xì)胞核中TRAF4表達(dá)上調(diào)Fig 5 Up-regulation the nuclei expression of TRAF4 in MDA-MB- 231

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Transfecting pcDNA3-TRAF4-DM-TRAF
improves proliferation of human breast cancer cell MDA-MB- 231

ZHANG Xiao-li1, MI Xiao-yi2*

(1.Dept. of Assisied Reproduction, Shenyang Women’s and Children’s Hospital, Shenyang 110014; 2.Dept. of Pathology, the First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110001,China)

Objective To investigate whether overexpression of TRAF4 in human breast cancer may have impact on its cell proliferation. Methods This study has two groups, MDA-MB- 231 transfected with pcDNA3-TRAF4-DM-TRAF or pcDNA3. We detected the expression and localization of TRAF4 with immunofluorescence and western blot. We detected the expression of the phosphorylation level of p70S6K and S6 with westernblot. Flow cytometry was used to detecte cell cycle. MTT Assay was used to detected cell reproductive capacity.Results TRAF4 localized in both cytoplasm and nuclei in MDA-MB- 231. Nuclear expression of TRAF4 in nuclei was lower than that in cytoplasm (P<0.05). After pcDNA3-TRAF4-DM-TRAF was transfected into the cells, the expression of TRAF4 in nuclei was increased (P<0.05). The phosphorylation level of p70S6K and S6 significantly increaseced (P<0.05，P< 0.01). More S phase cells were recorded(P< 0.01) by FCM. The cell proliferation was promoted by MTT (P< 0.01). Conclusions The expression of TRAF4 in nuclei may play an important role in the cell proliferatuion by promoting p70S6K and S6 activation.

breast cancer；TRAF4；cell proliferation

2015- 04- 23

2015- 07- 02

1001-6325(2015)10-1382-05

R737.9

A

*通信作者(corresponding author)：xiaoyi_mi@163.com