樊江浩，劉揆亮，周 躍，吳 靜*

(1.蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 消化內(nèi)科，甘肅 蘭州730000;2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院消化內(nèi)科，北京100038)

腫瘤新生血管生成是腫瘤發(fā)展的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，近年研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)中的各種蛋白多糖在腫瘤血管生成中發(fā)揮重要作用[1]。SRPX2是近年新發(fā)現(xiàn)的一種硫酸軟骨素蛋白多糖，研究發(fā)現(xiàn)在小鼠t.End.1V 內(nèi)皮細(xì)胞、人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)均有SRPX2表達(dá)，沉默SRPX2 可以抑制小鼠t.End.1V內(nèi)皮細(xì)胞遷移及早期出芽的形成，提示其參與調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和管腔形成[2]，但尚不清楚在人體中SRPX2是否具有類似作用。本研究通過觀察SRPX2對(duì)HUVECs 體外增殖、遷移和管腔形成能力的影響，明確其是否具有促進(jìn)HUVECs血管生成能力的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑:Lipofectamine 2000(Invitrogen 公司);Opti-MEM I 還原型血清培養(yǎng)基(Gibco 公司);SRPX2抗體(兔抗人多克隆抗體，1 ∶500，Novus 公司);β-actin(小鼠抗人單克隆抗體)、二抗(辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 和辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG)(1∶2 000，中杉金橋公司);ECL 化學(xué)發(fā)光試劑(北京普利萊基因技術(shù)有限公司);CCK-8 試劑(日本同仁公司);Matrigel 膠(BD 公司);Transwell 小室(Corning 公司)。

1.1.2 細(xì)胞:HUVECs 和HEK293T細(xì)胞系(北京協(xié)和細(xì)胞資源中心)。

1.2 方法

1.2.1 條件培養(yǎng)基的制備:用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基在37℃、5% CO2條件下分別培養(yǎng)HUVECs 及HEK293T細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)增殖期時(shí)進(jìn)行傳代。pcDNA3.1-SRPX2 質(zhì)粒按此前方法構(gòu)建[3]。將處于對(duì)數(shù)增殖期的HEK293T細(xì)胞接種于6孔板中。待細(xì)胞匯合率為50%～60%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，質(zhì)粒(μg)∶lipo2000(μL)=1∶2，各加入100 μL Opti-MEM I 稀釋，混勻，室溫靜置5 min，將混合液均勻滴入6孔板中。實(shí)驗(yàn)分為3組:轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SRPX2 質(zhì)粒)、陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染空載的pcDNA3.1 質(zhì)粒)和空白對(duì)照組(未添加質(zhì)粒)。按上述條件完成轉(zhuǎn)染后，棄去舊培養(yǎng)基，換做無血清的DMEM 培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別于24 和48 h時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，混勻后1 200 r/min 離心10 min，過濾，分別得到轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組HEK293T細(xì)胞的SRPX2條件培養(yǎng)基備用。

1.2.2 Western blot檢測(cè):配制8%的SDS-PAGE 分離膠及濃縮膠，以每孔20 μg 蛋白樣品上樣電泳，濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用5%的BSA 封閉2 h后，分別與SRPX2 及β-actin 一抗4℃孵育過夜，洗膜后分別孵育二抗，室溫孵育2 h，TBST 洗膜30 min，膜表面滴加ECL 化學(xué)發(fā)光試劑，生物分子成像儀中曝光顯影。

1.2.3 CCK-8 實(shí)驗(yàn):將處于對(duì)數(shù)增殖期的HUVECs用胰蛋白酶消化，離心，用含胎牛血清體積分?jǐn)?shù)10%的各組條件培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞為5×104個(gè)/mL，加入96孔板中，100 μL/孔，放入培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48 和72 h后，加入含10% CCK-8 試劑的DMEM完全培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱孵育4 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度(A450)。

1.2.4 Matrigel 管腔形成實(shí)驗(yàn):96孔板加入4℃過夜液化的Matrigel 膠，50 μL/孔，輕輕搖勻鋪于培養(yǎng)板底部，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育1～2 h，待Matrigel膠凝固后，用含胎牛血清體積分?jǐn)?shù)10%的各組條件培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞為5×105個(gè)/mL，加入已鋪好膠的孔中，100 μL/孔，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)6 h，200倍相差顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)管腔樣結(jié)構(gòu)分支點(diǎn)數(shù)量。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn):取處于對(duì)數(shù)增殖期的HUVECs，用胰蛋白酶消化吹打使細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞為1×105個(gè)/mL，接種于提前畫好標(biāo)記線的6孔板中，2 mL/孔，放入37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞完全貼壁后，用無菌槍頭垂直標(biāo)記線輕輕畫出一條劃痕，用PBS 洗去被劃掉的細(xì)胞，分別加入含胎牛血清體積分?jǐn)?shù)為10%的各組條件培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別于0、6和12 h時(shí)間點(diǎn)在倒置顯微鏡下拍照，用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析圖片，計(jì)算6和12 h時(shí)的細(xì)胞遷移距離。

1.2.6 Transwell 實(shí)驗(yàn):將Transwell 小室置于24孔板中，下室加入上述轉(zhuǎn)染48 h后，含胎牛血清體積分?jǐn)?shù)0.5%的HEK293T細(xì)胞懸液500 μL/孔，細(xì)胞密度為2×105個(gè)/mL;上室加入含胎牛血清體積分?jǐn)?shù)0.5%的HUVECs 懸液100 μL/孔，細(xì)胞密度1×105個(gè)/mL。放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h后，棄去小室上下培養(yǎng)基，PBS 沖洗，無水甲醇固定，結(jié)晶紫染色后用棉簽輕輕刮去未穿膜的細(xì)胞，PBS 沖洗后室溫晾干，置于倒置顯微鏡下，隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞，取其平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。本研究檢測(cè)指標(biāo)的數(shù)據(jù)資料經(jīng)W 檢驗(yàn)呈正態(tài)分布，組間均數(shù)經(jīng)F 檢驗(yàn)方差齊，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。各項(xiàng)指標(biāo)均采用方差分析，采用雙側(cè)檢驗(yàn)法。

2 結(jié)果

2.1 SRPX2 在HEK293T細(xì)胞中的表達(dá)

轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞48 h后，檢測(cè)到轉(zhuǎn)染組細(xì)胞裂解液中有SRPX2 蛋白表達(dá)(圖1)。

圖1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后SRPX2 在HEK293T細(xì)胞的Western blot檢測(cè)結(jié)果Fig1 Expression levels of SRPX2 were detected by Western blot after construction vetor transfected into HEK293T cells

2.2 CCK-8 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞培養(yǎng)24、48 和72 h后，各組間吸光度(A450)值均無差異(圖2)。

圖2 各組細(xì)胞增殖能力Fig2 Proliferation of HUVECs of each groups(±s，n=6)

2.3 Matrigel 管腔形成實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染組管腔樣結(jié)構(gòu)分支點(diǎn)數(shù)為(97±4)個(gè)/視野，明顯多于陰性對(duì)照組(57±3)個(gè)/視野和空白對(duì)照組(54±3)個(gè)/視野(P＜0.05)(圖3)。

2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

6 h后轉(zhuǎn)染組細(xì)胞遷移的距離顯著高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，分別為(90±6)、(37±7)和(36±4)μm(P＜0.05);劃痕12 h后細(xì)胞傷口愈合更加明顯，遷移距離分別為(135±5)、(65±8)和(63±4)μm (P＜0.05)。

2.5 Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染組遷移細(xì)胞數(shù)明顯多于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，分別為(549±10)、(334±11)和(329±12)個(gè)/視野(P＜0.05)(圖4)。

圖3 各組HUVECs 形成管腔樣結(jié)構(gòu)分支點(diǎn)數(shù)Fig3 Total branch point of capillary tubes of each groups(×200)

圖4 各組HUVECs 遷移細(xì)胞數(shù)Fig4 Number of migrating cells of each groups(×200)

3 討論

腫瘤血管生成是指在已有血管基礎(chǔ)上新血管的形成，包括靜止?fàn)顟B(tài)內(nèi)皮細(xì)胞的激活、基底膜與ECM的蛋白降解、細(xì)胞連接的斷裂、內(nèi)皮細(xì)胞增殖、趨化性遷移入周圍基質(zhì)和新管腔形成[4]。ECM 在腫瘤血管生成中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。含糖胺聚糖(glycosaminocan，GAG)鏈的蛋白多糖(proteoglycan，PG)是ECM 中主要的非膠原糖蛋白成分之一，包括硫酸肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycan，HSPG)與硫酸軟骨素蛋白多糖(chondroitin sulphate proteoglycan，CSPG)，均可與細(xì)胞表面受體及多種促血管生成因子結(jié)合，參與腫瘤血管生成。SRPX2 蛋白是一種新發(fā)現(xiàn)的CSPG[5]，在胃癌、肺癌、間皮瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多種惡性腫瘤高表達(dá)，并與腫瘤惡性程度及患者的預(yù)后相關(guān)[6]。SRPX2 還可能具有促血管生成作用。SRPX2 在HUVECs 中高表達(dá)[6]，在血管生成激活狀態(tài)下的小鼠t.End.1V內(nèi)皮細(xì)胞中，用siRNA 沉默SRPX2 基因表達(dá)可特異性抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移，抑制血管出芽形成。SRPX2上游的轉(zhuǎn)錄后抑制性調(diào)節(jié)因子具有抑制腫瘤新生血管生成的作用[7]。在轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1-SRPX2 質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞的培養(yǎng)基中檢測(cè)到有SRPX2 存在，證實(shí)SRPX2是一種分泌性蛋白，且來源于高表達(dá)SRPX2的HEK293T細(xì)胞的條件培養(yǎng)基可以增強(qiáng)胃癌細(xì)胞系SUN-16的遷移能力[6]。本研究采用類似方法提取了HEK293T條件培養(yǎng)基，觀察SRPX2對(duì)HUVECs 體外血管生成能力的影響。經(jīng)轉(zhuǎn)染SRPX2高表達(dá)質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞的條件培養(yǎng)基可顯著促進(jìn)HUVECs的遷移能力及管腔形成能力，證實(shí)其可能具有促進(jìn)血管生成的作用。轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞提高其SRPX2 水平并不能促進(jìn)其增殖[6]。與之相符，SRPX2 高表達(dá)的HEK293T細(xì)胞的條件培養(yǎng)基不能促進(jìn)HUVECs增殖。

尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator receptor，uPAR)可以調(diào)節(jié)細(xì)胞外蛋白水解、整合素激活和信號(hào)傳導(dǎo)[8]。SRPX2 作為uPAR的配體，在血管生成激活狀態(tài)下的小鼠t.End.1V 內(nèi)皮細(xì)胞可與血管內(nèi)uPAR 直接結(jié)合形成SRPX2/uPAR 復(fù)合體，參與血管生成過程[2]。黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)作為一種胞質(zhì)蛋白激酶，可以通過與生長因子和整合素結(jié)合被激活，調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附和遷移[9]，SRPX2 高表達(dá)可激活FAK信號(hào)通路增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和黏附能力[6]。研究報(bào)道SRPX2 可能通過與uPAR 結(jié)合后激活FAK通路發(fā)揮作用[10]，推測(cè)其在HUVECs 中也可能具有類似作用。這還需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。

[1]Iozzo R，Sanderson R.Proteoglycans in cancer biology，tumour microenvironment and angiogenesis[J].J.Cell.Mol.Med，2011，15:1013-1031.

[2]Miljkovic-licina M，Hammel P，Garrido-urbani S，et al.Sushi repeat protein X-linked 2，a novel mediator of angiogenesis[J].FASEB J，2009，23:4105-4116.

[3]劉揆亮，周躍，吳靜，等.SRPX2 真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在SW480 細(xì)胞中的表達(dá)[J].世界華人消化雜志，2014，22:2553-2558.

[4]Folkman J.Fundamental concepts of the angiogenic process[J].Curr Mol Med，2003，3:643-651.

[5]Wilson R，Norris E，Brachvogel B，et al.Changes in the chondrocyte and extracellular matrix proteome during postnatal mouse cartilage development [J].Mol Cell Proteomics，2012，11，doi:10.1074/mcp.M111.014159.

[6]Tanaka K，Arao T，Maegawa M，et al.SRPX2 is overexpressed in gastric cancer and promotes cellular migration and adhesion[J].Int J Cancer，2009，124:1072-1080.

[7]Chamorro-jorganes A，Araldl E，Rotllan N，et al.Autoregulation of glypican-1 by intronic microRNA-149 fine tunes the angiogenic response to FGF2 in human endothelial cells[J].J Cell Sci，2014，127:1169-1178.

[8]Tarui T，Andronicos N，Czekay R，et al.Critical role of integrin alpha 5 beta 1 in urokinase (uPA)/urokinase receptor (uPAR，CD87)signaling[J].J Biol Chem，2003，278:29863-29872.

[9]Tilghman R，Slack-davis J，Sergina N，et al.Focal adhesion kinase is required for the spatial organization of the leading edge in migrating cells[J].J Cell Sci，2005，118 2613-2623.

[10]Royer-zemmour B，Ponsole-lenfant M，Gara H，et al.Epileptic and developmental disorders of the speech cortex:ligand/receptor interaction of wild-type and mutant SRPX2 with the plasminogen activator receptor uPAR[J].Hum Mol Genet，2008，17:3617-3630.