張夏夢，壽折星，陳望隆，張繼紅，馬澤洪，任俊紅

(1.宜昌市第二人民醫(yī)院 中西醫(yī)結合科，湖北 宜昌443000;2.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院中西醫(yī)結合科，湖北 武漢430022;3.三峽大學 醫(yī)學院，湖北 宜昌443000)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是一類病因尚未完全明確的腸道非特異性炎癥反應性疾病。骨髓細胞是唯一的胃腸道以外來源的有助于腸上皮再生的細胞，其中骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一種具有多分化潛能的細胞，在特定條件下能誘導分化形成各種非造血組織[1-2]，且具有很強的免疫調節(jié)作用[3]。本實驗通過大鼠UC模型，旨在研究MSCs 向結腸黏膜上皮細胞的分化情況，并通過檢測MSCs 移植對炎性因子白介素-4(interleukin-4，IL-4)及核因子-κB(nuclear factorκB，NF-κB)表達的影響，為MSCs 移植治療炎性腸病提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

2，4，6-三硝基苯磺酸(Sigma 公司，P2297);大鼠SRY DNA 原位熒光雜交染色系統(tǒng)(天津市灝洋生物公司，RAT2009BIO);兔抗大鼠CK20 單克隆抗體(Abcam 公司，ab76126);NF-κB p65 多克隆抗體(Santa Cruz 公司，sc-8000);濃縮型DAB 顯色劑(Bioss 公司，C-0010);羊抗小鼠IgG、SABC-Cy3 試劑盒(武漢博士德公司);SYBR Green 定量PCR 試劑盒(Roche 公司);大鼠白介素4 (IL-4)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(伊萊瑞特公司，E-EL-R0014)。

1.2 實驗動物

SPF級SD大鼠，由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供，實驗動物質量合格證SCKY(鄂)2008-0005，No:4200696100;實驗動物設施使用證明SYXK(鄂)2010-0057，No:00116132。3～4周齡雄性大鼠5只，體質量(160±20)g，用于制備MSCs;6～8周齡雌性大鼠30只，體質量(250±20)g，用于分組實驗。

1.3 MSCs的分離、傳代與鑒定

收集雄性大鼠骨髓細胞，置于CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)，取第3代細胞留用。采用熒光標記的CD29、CD90、CD45 及CD11b，用流式細胞學方法鑒定MSCs。

1.4 UC模型制備及干預

1.4.1 模型制備:用三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇復合法局部灌腸法建立潰瘍性結腸炎大鼠模型。

1.4.2 分組:將雌性大鼠隨機分為:正常組、模型組、MSCs組，每組10只。模型組和MSCs組建立大鼠UC模型。24 h后，正常組和模型組經尾靜脈注入0.9% 氯化鈉溶液1 mL;MSCs組經尾靜脈注入1×106MSC s 懸液1 mL。

1.4.3 取材:建立模型后，觀察大鼠日?；顒印⑦M食以及腹瀉和黏液膿血便情況。2周后，留取每只大鼠遠端結腸組織長約8 cm，比較各組大鼠結腸組織病理學變化。取病變明顯的結腸組織標本。

1.5 熒光原位雜交結合免疫熒光染色

1.5.1 Y染色體DNA 熒光原位雜:交采用熒光原位雜交(SRY FISH)及DAPI 復染技術檢測，按照大鼠SRY FISH 試劑盒說明書操作以及按DAPI 說明書步驟染色。

1.5.2 免疫熒光染色檢測CK20表達:結腸組織連續(xù)切片、拷片、脫蠟復水;抗原修復后，孵育，封閉，滴加兔抗大鼠CK20 單克隆抗體，4℃過夜;滴加生物素化羊抗大鼠抗體，孵育;加SABC-CY3，封片;滴加DAPI 避光孵育，核復染;用含抗熒光淬滅劑的封片液封片。

1.5.3 采集熒光圖像:各組結腸組織切片按以上步驟處理后，在熒光顯微鏡下，F(xiàn)AM 激發(fā)波長λ=510 nm，觀察采集位于細胞核內的黃綠色熒光圖像。DAPI 激發(fā)波長λ= 360 nm，觀察采集細胞核內的藍色熒光圖像。CY 3 激發(fā)波長λ = 550 nm，觀察采集位于細胞質的紅色熒光。應用Imagepro3Dss.1 圖像處理軟件進行圖片掃描、取圖、圖像疊加。

1.6 RT-PCR 技術檢測CK20、NF-κB、IL-4的表達

按照TRIzol 試劑盒說明書提取結腸組織細胞總RNA，反轉錄成cDNA。取2 μL 轉錄產物作模板，引物序列如下:β-actin 正向:5'-CACGATGGA GGGGCCGGACTCATC-3'，β-actin 反向:5'-TAAAG ACCTCTATGCCAACACAGT-3'，擴增長度240 bp;Rat CK20 正向:5'-ATGCGGATAACTGTGGAAGC-3'，Rat CK20 反 向:5'-CCTCCACGTTGACATTGTTG-3'，擴增長度187 bp;Rat NF-κB 正向:5'-CCGTGAGGC TGTTTGGTTTG-3'，Rat NF-κB 反 向:5'-GGTCTGCC CTCCTGACTCTA-3'，擴增長度92 bp;Rat IL-4 正向:5'-GTACCAGACGTCCTTACGGC-3'，Rat IL-4 反向:5'-CTCAGTTCACCGAGAACCCC-3'，擴增長度143 bp;反應條件為:94℃4 min，94℃30 s，54℃30 s，72℃25 s;30個循環(huán)，72℃4 min，4℃4 min。采用2－△△Ct方法分析各組相對基因表達差異。

1.7 Westen blot檢測NF-κB蛋白的表達

取－80℃低溫保存的結腸組織，測定蛋白濃度，制成含蛋白量相等的樣品，經電泳、轉膜、封閉，加入一抗，4℃孵育過夜;TBS 洗膜3次，加入辣根過氧化物酶耦聯(lián)的二抗室溫孵育2 h，ECL 顯色劑顯色，用Bio Rad 密度掃描儀進行掃描，測定各蛋白的相對吸光度值。

1.8 ELISA 檢測結腸組織中IL-4 含量

將組織樣品稱重，按組織質量∶PBS 體積=1∶9的比例用預冷的PBS 將組織樣品勻漿，4℃10 000 r/min 離心10 min，小心吸取上清檢測。ELISA 實驗步驟參照說明書進行，采用酶標儀測A值。

1.9 統(tǒng)計學分析

采用SPSS17.0 軟件進行統(tǒng)計學數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD 法。

2 結果

2.1 MSC 形態(tài)學特征及鑒定

接種24 h后可見散在分布的貼壁細胞，為短梭形、橢圓形、長梭形;15 d后，細胞的體積增大，呈旋渦狀排列。經消化、傳代后，第3代MSCs 在24 h 內即可完全貼壁、伸展，呈紡錘狀形態(tài)。第3代MSCs表達CD29 和CD90，不表達CD45 和CD11b，可判定最終培養(yǎng)的細胞為MSCs(圖1，2)。

2.2 造模臨床觀察

模型組和MSCs組大鼠大部分出現(xiàn)豎毛、活動減少、飲食減少，并出現(xiàn)稀便和黏液膿血便，說明UC造模成功。

圖1 第3代MSCsFig1 The MSCs of passage 3(×200)

圖2 F3代MSCs 流式細胞儀檢測結果Fig2 Flow cytometry analysis of passage 3 MSCs

2.3 組織病理觀察

模型組大鼠結腸有明顯的充血水腫，黏膜結構異常，伴壞死和糜爛，部分黏膜上皮損傷脫落，杯狀細胞減少，炎性細胞侵襲全層;MSCs組大鼠結腸黏膜結構尚完整，上皮輕度損傷，杯狀細胞增多，充血水腫較輕，潰瘍較淺表，炎性細胞侵襲減少(圖3)。

2.4 Y染色體和CK20 雙陽性細胞表達

結腸組織切片可見位于細胞質的紅色熒光，即CK20 陽性，主要分布于結腸黏膜上皮細胞;MSCs組結腸組織切片可藍色熒光的細胞核內有綠色熒光亮點，即Y染色體SRY FISH 陽性表達，在結腸組織腸黏膜上皮和固有層均有分布。部分Y染色體陽性細胞，可見位于細胞質的紅色熒光，即Y染色體和CK20 雙陽性細胞表達(圖4)。

2.5 RT-PCR檢測結果

模型組及MSCs組CK20表達較正常組增高P＜0.01)，MSCs組表達高于模型組(P＜0.01)，模型組和MSCs組NF-κB表達高于正常組，IL-4表達低于正常組(P＜0.01);MSCs組NF-κB表達低于模型組，IL-4表達高于模型組(P＜0.01)(表1)。

圖3 各組大鼠病變結腸組織病理觀察Fig3 Pathologic changes of the colonic tissues of rats in respective experimental group(×100)

圖4 SRY FISH 和CK20 免疫熒光染色Fig4 Fluorescent Y chromosome in situ hybridization and immunofluorescent staining of CK20(×400)

表1 各組CK20、NF-κB、IL-4 mRNA 相對表達結果Table1 The mRNA expression of CK20，NF-κB and IL-4 in different groups (±s，n=10)

表1 各組CK20、NF-κB、IL-4 mRNA 相對表達結果Table1 The mRNA expression of CK20，NF-κB and IL-4 in different groups (±s，n=10)

*P＜0.01 compared with normal control group;#P＜0.01 compared with model group.

group CK20 NF-κB IL-4 normal control 1.060±0.193 0.981±0.130 1.03 5±0.104 model 1.758±0.320* 3.546±0.593* 0.178±0.038*MSCs 2.564±0.429# 1.758±0.221# 0.518±0.029#

2.6 Westen blot檢測結果

模型組NF-κB表達顯著高于正常組(P＜0.01)，MSCs 干預組NF-κB表達顯著下降(P＜0.01)，但仍高于正常組(P＜0.01)(圖5)。

2.7 ELISA 檢測結果

模型組及MSCs組IL-4的水平較正常組顯著減低(P＜0.01)，而MSCs組中IL-4的水平比模型組升高(P＜0.01)(圖6)。

圖5 Western blot檢測NF-κB蛋白的表達Fig5 The expression of NF-κB proteins detected by Western blot(±s，n=10)

圖6 ELISA 檢測IL-4的表達Fig6 The expression of IL-4 detected by ELISA(±s，n=10)

3 討論

結腸黏膜上皮細胞是維持腸道功能的結構基礎，UC 常常伴結腸黏膜上皮細胞凋亡加速[4]，且由于腸道內產生大量炎性細胞因子及介質，加劇損傷腸黏膜屏障功能[5]。因此抑制腸道炎性反應、修復上皮細胞從而改善腸上皮屏障功能是治療UC的新思路。

MSCs 有提高受損上皮再生的能力，可能是上皮細胞再生的來源[6]。有研究證明MSCs 能通過分化為上皮細胞促進損傷氣道黏膜的修復[7]。本實驗檢測到雌性大鼠結腸組織中出現(xiàn)帶Y染色體標志的雄性供體來源的細胞，主要分布在結腸黏膜上皮及固有層。同時檢測大鼠結腸組織上皮細胞表型特征標志物細胞角蛋白20(CK20)，CK20表達范圍特異，能在胃腸道組織的上皮細胞中表達，可作為檢測結腸黏膜上皮細胞的特征性指標。證明結腸組織部分上皮細胞是雄性供體來源的MSCs 分化而成的新生上皮細胞。

免疫異常是UC 發(fā)病的重要因素[8]。MSCs 具有很強的免疫調節(jié)能力，可以抑制T細胞、B 細胞增殖、影響樹突細胞的成熟及功能[9]。NF-κB 和IL-4與UC的發(fā)生發(fā)展密切相關。本研究表明，MSCs 能通過調節(jié)NF-κB 和IL-4的表達，改善腸道的炎性反應狀態(tài)，另外通過分化為結腸組織上皮細胞，促進黏膜上皮的修復。

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