劉本榮，熊玉娟，鐘 赟，莫 沛，李愛群，熊龍根

(1.廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 心血管疾病研究所，廣東 廣州510260;2.廣州中醫(yī)藥大學第二臨床學院 檢驗科，廣東 廣州510105)

肌細胞增強因子2A(myocyte enhancer factor 2A，EF2A)是較早被鑒定出來的與冠心病(coronary artery disease，CAD)相關(guān)的常染色體顯性基因[1]，但其遺傳多態(tài)是否與CAD 有關(guān)存在爭議[2]。MEF2A 屬于第二類轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，參與調(diào)控心肌轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)、肌肉組織及血管生成相關(guān)特異基因的表達[3-4]，其自身表達受到miR-1的調(diào)控[5]。MEF2A和MEF2C 缺陷型誘發(fā)擴張性心肌病[6]，MEF2C 調(diào)控心肌發(fā)育可能是通過調(diào)控DOK5 基因的表達而實現(xiàn)的[7]。在小鼠模型中，MEF2A表達單倍型劑量不足更易導致動脈粥樣病變，MEF2A 自身的表達調(diào)控可能在CAD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，發(fā)生在其調(diào)控區(qū)的遺傳多態(tài)或變異可能是導致群體或個體對CAD 易感差異的重要原因，然而國內(nèi)外未見相關(guān)報道。本研究通過測序發(fā)現(xiàn)MEF2A啟動子區(qū)的單核苷酸多態(tài)(single nucleotide polymorphism，SNP)位點，利用雙螢光素酶報告基因系統(tǒng)研究不同MEF2A啟動子單倍型的轉(zhuǎn)錄活性，同時比較各單倍型在CAD組和對照組中的頻率及純合率差異。

1 材料與方法

1.1 材料

樣本收集及基因組DNA的提取:CAD 患者44名，正常對照45名，各抽取靜脈血2 mL，EDTA 抗凝。研究獲得廣州醫(yī)科大學醫(yī)學倫理委員會批準，并與受試者簽訂知情同意書。

全血基因組提取試劑盒和endo-free plasmid midi kit(廣州速研生物公司)，PCR擴增試劑(Toyobo公司)，T 克隆載體pTZ57R/T(中晶生物公司)，限制性內(nèi)切酶Kpn Ⅰ和Bgl Ⅱ(廣州瑞真生物公司)，啟動子載體pGL3.0 Basic、pRL-TK 和dual luciferase reporter assay system (Promega 公司)，人冠狀動脈內(nèi)皮 細 胞(human coronary artery endothelial cell，HCAEC)(Sciencell 公司)，lipofectamineTM2000、引物合成和測序(Life Technology 公司)，內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基EGM-2(廣州儀濤公司)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計:以NCBI 數(shù)據(jù)庫中MEF2A 基因序列(NC_000015)為參考序列，利用引物設(shè)計軟件Primer premier 5.0 進行引物設(shè)計。啟動子區(qū)PCR擴增引物為Kpn Ⅰ_F2AF2:cgg ggtacc CACCTATC TCAGAAAAGGCAAC;Bgl Ⅱ_ F2AR2:ggaagatct G GGGCTATTTTTAGGAGACAAG。測序引物為F2A-S1:CACCTATCTCAGAAAAGGCAAC;F2A-rS1:GGGGC TATTTTTAGGAGACAAG;MEF2AP_seq1:CGATAAG GAGGTTGCTACTG。

1.2.2 PCR擴增:反應(yīng)體系ddH2O 13.1 μL，10×緩沖液2 μL，DMSO 2 μL，MgSO4(25 mmol/L)0.8 μL，dNTP (2.5 mmol/L)0.5 μL，Kpn Ⅰ-F2A2(10 P)0.3 μL，Bgl Ⅱ-F2AR2(10 P)0.3 μL，KOD Taq 酶(1 U/μL)，gDNA(10～30 ng/μL)0.5 μL，總體積20 μL。PCR 反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性1 min，95℃10 s，64℃30 s，68℃1 min，共34個循環(huán)，最后68℃延伸3 min。

1.2.3 載體構(gòu)建:選取12種常見單倍型構(gòu)建MEF2A啟動子載體，載體命名同其代表的單倍型名稱，分別為H1、H3、H5、H6、H8、H9、H10、H13、H14、H15、H16和H17，載體構(gòu)建示意圖如圖1。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞(DH5α)，培養(yǎng)過夜，挑取單克隆于3 mL LB 培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，測序鑒定。啟動子單倍型的確定采用T 載體克隆測序。

圖1 MEF2A啟動子載體示意圖Fig1 Sketch map of the construction of MEF2A promoter vector

1.2.4 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染:HCAEC 培養(yǎng)在含2%FBS 及相關(guān)生長因子的EGM-2 培養(yǎng)基中。轉(zhuǎn)染前24 h 鋪板，按5 000個細胞/cm2接種細胞，于二氧化碳培養(yǎng)箱(37℃，5% CO2)中培養(yǎng)過夜。用去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取的MEF2A啟動子載體與pRL-TK 共轉(zhuǎn)染，按lipofectamineTM2000 說明書操作。

1.2.5 啟動子活性分析:細胞轉(zhuǎn)染后48 h 進行螢光素酶活性分析，按dual luciferase reporter assay system 說明書操作。螢光素酶活性測定在化學發(fā)光檢測儀(Lumat LB 9507，德國)上進行。

1.3 統(tǒng)計學分析

序列比對采用clustalx1.81，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預(yù)測采用 TFSEARCH (http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)，各單倍型轉(zhuǎn)錄活性比較、作圖及顯著性分析采用GraphPad Prism 5，兩單倍型間的螢光素酶活性比較采用T-test，所有單倍型的熒光素酶活性比較采用one-way ANOVA 分析，兩組間的雜合率比較采用卡方檢驗。利用Arlequin3.5 進行Hardy-Weinberg 平衡分析。各單倍型的螢光素酶活性以3次獨立試驗的平均值±標準差(±s)表示。

2 結(jié)果

2.1 SNP 及單倍型分析

在1245 bp MEF2A啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)9個SNP位點，組成18種單倍型(分別為H1，H2，…，H18)，其中H1、H5、H8 和H164種單倍型的頻率較高，占79.21%(表1)。3個SNPs 導致轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(transcription factor binding site，TFBS)發(fā)生改變(圖2)。其中位于啟動子－580位C 變?yōu)锳，導致轉(zhuǎn)錄因子ADR1、Sp1的結(jié)合位點及GC Box 在此區(qū)域丟失(圖2A);－646位G 變?yōu)門，導致Ttk-69、HSF 結(jié)合位點丟失(圖2B);－948位C 變?yōu)門，導致Sp1 和HSF 結(jié)合位點丟失(圖2C)。由－948(C/T)、－646(G/T)和－580(C/A)組成的單倍型有CGC(17.98%)、CGA(3.94%)、TGA(36.51%)、TTC(33.15%)、TTA(3.94%)、TGC(3.37%)和CTC(1.69%)，其中包含TGA的單倍型轉(zhuǎn)錄活性最高。

表1 MEF2A啟動子區(qū)的SNP位點及各單倍型的頻率分布Table1 The relative position of SNP sites in the promoter region of MEF2A and the frequency of each haplotype in the subjects

2.2 各單倍型啟動子的轉(zhuǎn)錄活性

H5 和H8 轉(zhuǎn)錄活性最高，H1 和H9次之，H1、H3、H6、H10、H13、H14、H15、H16和H17 最低(圖3)。含－646 T 等位基因的單倍型(H10、H14、H15、H16、H17)的轉(zhuǎn)錄活性低(圖3)。各單倍型間的轉(zhuǎn)錄活性總體差異顯著(P＜0.001)，H8的轉(zhuǎn)錄活性顯著高于其他單倍型(P＜0.05)。

2.3 冠心病的易感性與MEF2A啟動子區(qū)的純合率呈正相關(guān)

MEF2A 近端啟動子在CAD組中的純合率達到50%，顯著高于對照組中的28.9%(χ2= 4.155，P＜0.05)(圖4)。CAD組中的期望雜合率顯著高于實際觀測值，不符合Hardy-Weinberg 平衡(表2);在對照組中的期望雜合率與實際觀測值之間沒有明顯差異，符合Hardy-Weinberg 平衡(表2)。表明CAD 易感性與MEF2A啟動子區(qū)的純合率存在相關(guān)性。

圖2 預(yù)測的MEF2A啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點Fig2 The predicted transcription factor binding sites in MEF2A promoter region

表2 Hardy-Weinberg 平衡檢測結(jié)果Table2 Results of Hardy-Weinberg balance test

圖3 各MEF2A啟動子單倍型的轉(zhuǎn)錄活性Fig3 The transcription activity of MEF2A promoter haplotypes(±s，n=3)

圖4 MEF2A 近端啟動子的純合率Fig4 The homozygosity of the proximal promoter of MEF2A

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)MEF2A啟動子區(qū)的SNPs 會導致TFBS的改變，由不同SNPs 組成的單倍型具有不同的啟動子活性，可見MEF2A啟動子區(qū)的SNPs 也許會導致不同個體MEF2A的表達水平差異，從而表現(xiàn)出對某些疾病易感性的差異。通常認為，導致TFBS 改變的SNPs 都將致使啟動子活性發(fā)生變化[8]，MEF2A 近端啟動子區(qū)中有3個SNPs 可能導致TFBS 丟失，其中含－646(T)的啟動子單倍型確實表現(xiàn)出較低的轉(zhuǎn)錄活性。然而，由－948、－646和－580 3個SNP位點組成的單倍型中，未丟失任何TFBS的單倍型并未表現(xiàn)出最高的轉(zhuǎn)錄活性，而H5 和H8 在－948 和－580位都有TFBS丟失，卻表現(xiàn)出最強的轉(zhuǎn)錄活性，這種現(xiàn)象可能與基因的穩(wěn)定性選擇有關(guān)[9]。因此，僅從SNPs是否導致TFBS 丟失判斷其對啟動子活性的影響未必準確，必須將由不同等位基因組成的單倍型看作一個整體來考慮，并通過實驗驗證，探索單倍型與疾病的相關(guān)性也許比考察單個SNP 與疾病的相關(guān)性更重要。CAD組中MEF2A 近端啟動子區(qū)的純合率明顯高于對照組，可能是由于MEF2A 在血管內(nèi)皮及血管平滑肌的修復(fù)和功能維護中發(fā)揮重要作用，MEF2A啟動子區(qū)的純合狀態(tài)可能導致基因的表達水平不及雜合狀態(tài)穩(wěn)定，對外界刺激因子的反應(yīng)過激或過慢，從而誘發(fā)血管病變。可見，MEF2A的表達水平或蛋白活性可能與CAD的發(fā)生發(fā)展有更密切的關(guān)系。

[1]Wang L，F(xiàn)an C，Topol SE，et al.Mutation of MEF2A in an inherited disorder with features of coronary artery disease[J].Science，2003，302:1578-1581.

[2]Li J，Chen HX，Yang JG，et al.MEF2A gene mutations and susceptibility to coronary artery disease in the Chinese population[J].Genet Mol Res，2014，13:8396-8402.

[3]Schlesinger J，Schueler M，Grunert M，et al.The cardiac transcription network modulated by Gata4，Mef2a，Nkx2.5，Srf，histone modifications，and microRNAs[J].PLoS Genet 7:e1001313.doi:10.1371/journal.pgen.1001313.

[4]Liu G，Han J，Profirovic J，et al.Galpha13 regulates MEF2-dependent gene transcription in endothelial cells:role in angiogenesis[J].Angiogenesis，2009，12:1-15.

[5]Ikeda S，He A，Kong SW，et al.MicroRNA-1 negatively regulates expression of the hypertrophy-associated calmodulin and Mef2a genes[J].Mol Cell Biol，2009，29:2193-2204.

[6]Xu J，Gong NL，Bodi I，et al.Myocyte enhancer factors 2A and 2C induce dilated cardiomyopathy in transgenic mice[J].J Biol Chem，2006，281:9152-9162.

[7]溫見燕，陰彬，張英姿，等.MEF2C 調(diào)控DOK5 基因的表達[J].基礎(chǔ)醫(yī)學與臨床，2009，29:342-346.

[8]Bandele OJ，Wang X，Campbell MR，et al.Human singlenucleotide polymorphisms alter p53 sequence-specific binding at gene regulatory elements [J].Nucleic Acids Res，2011，39:178-189.

[9]Liu B，F(xiàn)u Y，Wang Z，et al.HLA-DRB1 may be antagonistically regulated by the coordinately evolved promoter and 3'-UTR under stabilizing selection[J].PLoS One，2011，doi:10.1371/journal.pone.0025794.