王曉玲，陳曼華

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院 心血管內(nèi)科，湖北 武漢430014)

巖藻多糖是裙帶菜主要成分之一，具有抗凝血、抗病毒、抗血管生成、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫活性[1-2]、抗凋亡[3]、抗氧化應(yīng)激[4]及抑制炎性反應(yīng)等多種生物學(xué)作用[5]。巖藻多糖抑制炎性反應(yīng)及抗氧化應(yīng)激的活性引起了廣泛關(guān)注[5]。有研究報(bào)道巖藻多糖還具有抗氧化應(yīng)激及保護(hù)DNA 損傷的作用[6]。

心肌梗死后心臟重構(gòu)是患者發(fā)展成為心力衰竭最主要的機(jī)制[7-8]。心肌梗死后存活心肌的炎性反應(yīng)以及氧化應(yīng)激在其發(fā)展成為心力衰竭的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[9]。巖藻多糖具有抑制炎性反應(yīng)及抗氧化應(yīng)激的作用，其在心肌梗死后心室的重構(gòu)中的作用尚未闡明，本實(shí)驗(yàn)探討巖藻多糖在心肌梗死后心室重構(gòu)中的作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF級(jí)雄性C57BL/6J 小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量20～25 g[南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;合格證號(hào):SCXK(蘇)-2012-0002]。

1.1.2 試劑:巖藻多糖(北京雷力聯(lián)合海洋生物科技有限公司，純度99.7%)，埃文斯藍(lán)(BioSharp 公司)，三苯基氯化物(TTC，Amresco 公司)，Trizol(Invitrogen 公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Roche 公司)，SDSPAGE 凝膠配制試劑盒(谷歌公司)，eNOS、NF-κB、GAPDH 一抗、熒光標(biāo)記羊抗鼠二抗(Cell Signaling公司)，PVDF膜(Millipore 公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物處理:將小鼠隨機(jī)分為以下4 組:1)假手術(shù)組:行冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎術(shù)，開(kāi)胸后只掛線，不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，術(shù)后給予0.9%氯化鈉溶液灌胃，同藥物處理(n =10);2)心肌梗死模型組:結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支建立該模型(n =20);3)＆ 4)低和高濃度巖藻多糖處理組:心肌梗死術(shù)后每日灌胃分別給予200 和500 mg/kg 巖藻多糖處理，持續(xù)給藥3 周(均n =20)。所有小鼠3周后斷椎處死取心臟。

1.2.2 RT-qPCR檢測(cè)SOD、和iNOS 以及TNFα、IL-1β和TGFβ mRNA的表達(dá):用Trizol 提取心肌的總RNA，用寡聚引物和反轉(zhuǎn)錄試劑盒將每組2 mg的總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。把反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋3倍，利用LightCycler 480 SYBR Green 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀進(jìn)行PCR 反應(yīng)。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)管。將其結(jié)果與甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因的表達(dá)進(jìn)行對(duì)比，以2－△△Ct計(jì)算mRNA的表達(dá)。

1.2.3 Western blot檢測(cè)eNOS 和NF-κB蛋白表達(dá):心臟經(jīng)研磨后離心，超聲裂解細(xì)胞，離心后取上清液，用BCA法定量各組蛋白濃度。每組取20 μg 蛋白質(zhì)裂解液進(jìn)行電泳，在6%～10% SDS-PAGE 凝膠上分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，將膜用含有5%脫脂牛奶在室溫下孵育1 h，用一抗孵育過(guò)夜，然后用二抗孵育1 h，用二色紅外成像系統(tǒng)掃描蛋白印跡，檢測(cè)每組上訴蛋白的表達(dá)水平。同樣每組蛋白表達(dá)水平用GAPDH 蛋白的表達(dá)校準(zhǔn)，結(jié)果以目的蛋白/內(nèi)參蛋白吸光度的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示(n=6)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 巖藻多糖提高小鼠心肌梗死后的存活率，改善心功能，減少心肌梗死面積

巖藻多糖處理組術(shù)后存活率明顯高于模型組小鼠(病死率50%)(P＜0.05)，低濃度和高濃度巖藻多糖小鼠死亡率分別為20%和25%。與模型組相比巖藻多糖明顯減小左室收縮末內(nèi)徑(LVESd)和左室舒張末內(nèi)徑(LVEDd)，增加左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和左室短軸縮短率(LVFS)，高濃度巖藻多糖的效果優(yōu)于低濃度組。MI 術(shù)后3 周巖藻多糖處理的小鼠心重/體質(zhì)量(HW/BW)和肺重/體重(LW/BW)明顯低于模型組，高濃度巖藻多糖作用更加明。巖藻多糖處理后的小鼠心臟心肌梗死面積明顯小于模型組，高濃度巖藻多糖處理組心肌梗死面積最小(表1)。

2.2 RT-qPCR檢測(cè)心臟炎性因子及SOD 和iNOS mRNA的表達(dá)

與假手術(shù)組相比，模型組術(shù)后心肌TNFα、IL-1β、TGFβ 及iNOS mRNA表達(dá)明顯增加，而SOD的mRNA表達(dá)降低。巖藻多糖能降低模型組心臟炎性因子TNFα、IL-1β、TGFβ 及iNOS mRNA表達(dá)，高濃度巖藻多糖明顯增加SOD的mRNA表達(dá)，低濃度巖藻多糖無(wú)明顯影響(表2)。

表1 各組小鼠心功能、心重及心肌梗死面積的比較Table1 The cardiac function，heart weight and myocardial infarct size in each group (±s)

表1 各組小鼠心功能、心重及心肌梗死面積的比較Table1 The cardiac function，heart weight and myocardial infarct size in each group (±s)

*P＜0.05 compared with sham group;#P＜0.05 compared with model group.

group LVESd/mm LVEDd/mm LVEF/%LVFS/%HW/BW(mg/g)LW/BW(mg/g)infraction size/%sham(n=10) 2.35±0.18 3.33±0.06 79.00±1.83 42.30±2.15 4.18±0.25 4.57±0.18 －model(n=20) 4.96±0.76* 5.86±0.49* 48.80±6.83* 23.00±2.41* 8.54±1.51* 8.60±0.71* 52.32±7.15*fucoidan(200 mg/kg)(n=20) 3.67±0.80* # 4.35±0.18* # 64.30±5.54* # 31.50±3.30* # 6.77±0.75* # 6.32±0.49* # 40.14±7.82* #fucoidan(500 mg/kg)(n=20) 3.15±0.27* # 3.95±0.09* # 68.60±2.54* # 35.90±0.58* # 5.76±0.13* # 5.96±0.27* # 38.66±6.88*#

表2 小鼠心臟炎性因子TNFα、IL-1β、和TGFβ 及iNOS 和SOD mRNA表達(dá)Table2 The mRNA expression levels of inflammation factors (±s，n=3)

表2 小鼠心臟炎性因子TNFα、IL-1β、和TGFβ 及iNOS 和SOD mRNA表達(dá)Table2 The mRNA expression levels of inflammation factors (±s，n=3)

*P＜0.05 compared with sham group;#P＜0.05 compared with model group.

group TNFα(×10 －4) IL-1β(×10 －3) TGFβ(×10 －2)iNOS SOD sham 8.39±1.97 2.30±1.16 1.78±1.25 25.12±1.32 1 199±3 model 37.31±3.34* 4.24±0.90* 4.97±0.25* 59.03±0.37* 575±3*fucoidan(200 mg/kg) 18.35±1.69* # 2.75±0.83* # 3.25±0.16* # 37.50±0.66* # 716±2* #fucoidan(500 mg/kg) 12.43±1.71* # 2.62±1.54* # 2.11±0.44* # 33.52±0.62* # 1 007±2*#

2.3 Western blot檢測(cè)

模型組NF-κB的表達(dá)增高(P＜0.05)，而磷酸化eNOS表達(dá)下降;高濃度巖藻多糖處理組NF-κB的表達(dá)顯著下降(P＜0.05)，而磷酸化eNOS的表達(dá)趨于正常(圖1，表3)。

圖1 小鼠心臟eNOS 及NF-κB的蛋白表達(dá)Fig1 The expression levels of eNOS and NF-κB

表3 小鼠心臟eNOS 及NF-κB的蛋白表達(dá)Table3 The expression levels of eNOS and NF-κB(±s，n=6)

表3 小鼠心臟eNOS 及NF-κB的蛋白表達(dá)Table3 The expression levels of eNOS and NF-κB(±s，n=6)

*P＜0.05 compared with sham group;#P＜0.05 compared with model group.

hroup p-NF-κ B/GAPDH p-eNOS/GAPDH sham 0.02±0.02 0.09±0.01 model 0.35±0.06* 0.43±0.03*fucoidan(200 mg/kg) 0.03±0.02* # 0.10±0.02* #fucoidan(500 mg/kg) 0.06±0.02* # 0.06±0.02*#

3 討論

缺血引起的心肌纖維化、炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡是心肌梗死后左心室心肌重構(gòu)的必要因素。而一些促炎因子在心肌重構(gòu)的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，例如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和IL-1β，抑制這些細(xì)胞因子的表達(dá)可以減緩心肌重構(gòu)的進(jìn)程。NF-κB是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在心血管疾病中發(fā)揮著多種作用，包括調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)、細(xì)胞存活、分化和增殖[10]。本研究表明巖藻多糖可以抑制上述炎性因子的mRNA表達(dá)，減少NF-κB的活化，從而抑制心肌梗死后的心臟重構(gòu)。

氧化應(yīng)激在心肌梗死后心臟重構(gòu)中也發(fā)揮重要作用[11]。SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)，在心肌梗死后心臟重構(gòu)的過(guò)程中伴隨著SOD的表達(dá)下降，體內(nèi)氧自由基清除減少，從而加重了心肌重構(gòu)的病理過(guò)程。在心肌梗死后的心臟重構(gòu)過(guò)程中iNOS的表達(dá)增加，刺激機(jī)體產(chǎn)生更多的活性氮，增加心臟的氧化應(yīng)激損傷。eNOS 為內(nèi)源性NOS，活化的eNOS 途徑可誘導(dǎo)eNOS的磷酸化，增加NO 合成。這種eNOS 和NO可通過(guò)調(diào)節(jié)血管保護(hù)心臟重構(gòu)以及血管生成[12]。本結(jié)果表明巖藻多糖能增加心肌梗死后小鼠心臟SOD的表達(dá)，減少iNOS mRNA的表達(dá)，增加活化的的eNOS的蛋白表達(dá)，證明巖藻多糖可以通過(guò)增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化應(yīng)激的作用有效減緩心肌重構(gòu)。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了巖藻多糖可以減緩心肌梗死后的心臟重構(gòu)，其機(jī)制主要是通過(guò)其抗炎及抗氧化應(yīng)激作用。而巖藻多糖是否能減緩心肌梗死后的心肌纖維化尚需要進(jìn)一步證實(shí)。

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