林維浩，馬浙夫，夏浩明 (中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院乳腺甲狀腺外科，廣東 廣州 510080)

甲狀腺癌是最常見(jiàn)的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，在頭頸部腫瘤中居首位。近30 年來(lái)，我國(guó)的甲狀腺癌發(fā)病率由10/100 萬(wàn)上升約30/100 萬(wàn)～40/100 萬(wàn)［1］。甲狀腺癌的病理類型包括乳頭狀癌(PTC)、濾泡狀癌(FTC)，未分化癌(ATC)和髓樣癌(MTC)，其中PTC 占成人的60%和兒童甲狀腺癌的全部［2］。甲狀腺癌的發(fā)生包含了一系列高發(fā)的遺傳學(xué)因素，如RAS 基因點(diǎn)突變、RET 基因重排、p53 基因失活等。BRAF 突變是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)重要基因突變，且BRAFV600E突變成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。本文通過(guò)檢測(cè)BRAFV600E在PTC 中的表達(dá)，探討其表達(dá)與PTC 臨床病理特征關(guān)系，為預(yù)測(cè)PTC 的局部復(fù)發(fā)與治療尋找新途徑。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源:選取2003 年1 月～2005 年8 月于中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院行手術(shù)切除的PTC 石蠟包埋切片140 例，其中男35例，女105 例;年齡8 ～78 歲，平均(38.6±2.6)歲，中位年齡36.7 歲;Ⅰ～Ⅱ期88 例，Ⅲ～Ⅳ期52 例。所有患者術(shù)前均未行內(nèi)、外放射治療，首次術(shù)后原發(fā)灶無(wú)癌殘留。臨床資料見(jiàn)表1。

表1 140 例PTC 的臨床資料

1.2 BRAF 突變檢測(cè):對(duì)140 例PTC 病理閱片，將石蠟包埋的甲狀腺癌組織切片通過(guò)脫蠟、經(jīng)典陰離子去污劑法進(jìn)行基因組DNA 提取。將提取的DNA 行Taqman 熒光定量PCR 檢測(cè)。

1.3 BRAFV600E突變結(jié)果的判斷:以已知的PTC 細(xì)胞WRO 和KAT－5 細(xì)胞提取的DNA 作為對(duì)照。將PTC 細(xì)胞系WRO 作為BRAF 野生型為陰性對(duì)照，PTC 細(xì)胞系KAT－5 為BRAFV600E突變的陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 研究方法:對(duì)140 例PTC 病理學(xué)觀察、DNA 提取，采用Taqman 熒光定量PCR 檢測(cè)突變的結(jié)果，與已知PTC 細(xì)胞系WRO 作為BRAF 野生型、KAT－5 為BRAFV600E突變型的結(jié)果作對(duì)照，分析BRAFV600E突變?cè)赑TC 中不同亞型的表達(dá)與臨床病理特征與預(yù)后的關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，BRAFV600E基因突變與PTC 患者臨床病理特征之間的關(guān)系用卡方檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BRAFV600E與PTC 臨床病理特征的相關(guān)性:140 例患者中，BRAFV600E突變檢測(cè)陽(yáng)性75 例，陰性65 例，突變率為53.6%。BRAFV600E突變與性別、年齡、腫瘤大小、腺外侵襲之間的關(guān)系經(jīng)χ2檢驗(yàn)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，但有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的BRAFV600E突變率顯著高于無(wú)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01);Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期間的BRAFV600E突變率差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)，見(jiàn)表2。

表2 BRAFV600E與PTC 臨床病理特征的關(guān)系

2.2 隨訪:140 例PTC 患者均通過(guò)門(mén)診、電話及信件等方式隨訪。隨訪時(shí)間96.3 ～120.1 個(gè)月，平均104.36 個(gè)月，20 例失訪，隨訪率85%。14 例術(shù)后再次手術(shù)，其中10 例因局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，檢測(cè)BRAFV600E陽(yáng)性8 例(8/14);4 例因局部復(fù)發(fā)，檢測(cè)BRAFV600E陽(yáng)性2 例(2/4)。3 例在術(shù)后5 年內(nèi)死亡，死因?yàn)槿磙D(zhuǎn)移或局部復(fù)發(fā)窒息(檢測(cè)BRAFV600E陽(yáng)性2 例，陰性1 例)。BRAFV600E突變與復(fù)發(fā)率、死亡率經(jīng)χ2檢驗(yàn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3。

表3 BRAFV600E與PTC 術(shù)后隨訪的關(guān)系(n=120)

3 討論

BRAF 基因?qū)儆赗AF 基因家族，是MAPK 通路的一個(gè)重要蛋白激酶。它位于染色體7q34，編碼一個(gè)分子量為67 ～99 kD的絲/蘇氨酸蛋白激酶。RAF 基因家族共有三個(gè)成員，RAF－1、BRAF 和ARAF。在RAF 家族三種絲/蘇氨酸蛋白激酶中，BRAF 是激活MAPK 通路的能力最強(qiáng)的的激活物。BRAF 突變?cè)谌祟惸[瘤最常見(jiàn)于黑色素瘤，其檢出率占所有的黑色素瘤的66%，腸癌、肺癌、卵巢癌和甲狀腺癌中也有一定的發(fā)生率［3］。大部分的BRAF 突變都限定于激酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)，其熱點(diǎn)突變?cè)?1和15 外顯子上。超過(guò)80%的BRAF 突變都為第1799 位脫氧核苷酸的A－T 點(diǎn)突變，這種突變導(dǎo)致第600 位氨基酸由纈氨酸變?yōu)楣劝彼?。這一突變帶來(lái)的負(fù)電荷模擬了蘇氨酸599 和絲氨酸602 的磷酸?；^(guò)程，導(dǎo)致激酶的持續(xù)活化，MAPK 通路持續(xù)激活，使前者原有絲分裂能力增強(qiáng)，引起細(xì)胞異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。BRAF 突變?cè)赑TC 中有很高的發(fā)生率，從29%至83%不等。西方國(guó)家PTC 中BRAFV600E突變的檢出率較韓國(guó)低［4］。本研究BRAFV600E檢出率為53.6%，與西方國(guó)家檢出率相仿。

國(guó)外有不少關(guān)于BRAFV600E突變與甲狀腺癌臨床病理學(xué)參數(shù)相關(guān)性研究，但目前對(duì)于BRAFV600E可否作為預(yù)后不良的指標(biāo)存在較大爭(zhēng)議。有國(guó)外學(xué)者認(rèn)為PTC 中BRAFV600E突變與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和臨床病理分期有顯著相關(guān)性［5］。而國(guó)內(nèi)的研究資料顯示腺外侵犯、頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和甲狀腺癌處于進(jìn)展期(Ⅲ～Ⅳ期)均與PTC 的BRAFV600E突變有顯著相關(guān)性［6］但也有研究認(rèn)為突變與各參數(shù)不存在相關(guān)性［7］。本研究發(fā)現(xiàn)BRAFV600E突變與患者的性別、年齡、腫瘤大小和腺外浸潤(rùn)不相關(guān)。由于遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移的例數(shù)較少(n=2)，暫不能得到BRAFV600E突變與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移不相關(guān)的結(jié)論。研究發(fā)現(xiàn)PTC 中BRAFV600E突變有較高的復(fù)發(fā)、死亡率，因?yàn)楸狙芯恐袕?fù)發(fā)、死亡的PTC 病例較少，所以BRAFV600E突變與PTC 的關(guān)系還需要進(jìn)一步研究。BRAFV600E突變與甲狀腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期顯著相關(guān)。這些結(jié)果提示，BRAFV600E突變與甲狀腺癌的臨床進(jìn)展相關(guān)，其有可能參與了甲狀腺癌的惡性演進(jìn)。

檢測(cè)BRAFV600E突變對(duì)PTC 患者治療和術(shù)后預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)有指導(dǎo)作用。初次手術(shù)方式和切除范圍的選擇是臨床醫(yī)生遇到的最常見(jiàn)的問(wèn)題［8］，如是否應(yīng)該予以甲狀腺全切術(shù)，是否應(yīng)該行頸部淋巴清掃術(shù)，以及術(shù)后是否選擇放射性碘治療［8］。在美國(guó)和其他國(guó)家，甲狀腺全切或甲狀腺次全切除術(shù)后予以放射性碘治療是高危PTC 患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方案［9］。高危的PTC 患者放射性碘治療對(duì)預(yù)防復(fù)發(fā)，提高生存率的作用已經(jīng)得到廣泛證實(shí)。由于BRAFV600E陽(yáng)性的患者在腫瘤復(fù)發(fā)后對(duì)碘放射治療不敏感，建議手術(shù)切除范圍應(yīng)更廣泛，并需要外放射治療［6］。目前有人主張對(duì)于BRAFV600E陽(yáng)性的患者，可以考慮預(yù)防性的中央組淋巴結(jié)清掃，因?yàn)檫@類患者可能存在肉眼下難以發(fā)現(xiàn)的微轉(zhuǎn)移，且甲狀腺細(xì)胞功能攝碘功能受損，對(duì)放射性碘治療不敏感，復(fù)發(fā)和死亡風(fēng)險(xiǎn)更大。此外BRAFV600E陽(yáng)性的患者腫瘤有較高的復(fù)發(fā)率，術(shù)后需更嚴(yán)格隨訪以檢測(cè)是否復(fù)發(fā)。本文研究發(fā)現(xiàn)BRAFV600E陽(yáng)性有較高的復(fù)發(fā)率，及局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。手術(shù)切除范圍應(yīng)更廣泛，患者為此能否獲益，需要進(jìn)一步隨訪研究。

目前甲狀腺癌治療效果良好，然而，首次正規(guī)治療后10 年仍有20%的患者復(fù)發(fā)。對(duì)于手術(shù)不能根治、內(nèi)放射治療不敏感的和分化程度較低的PTC 和ATC，目前仍缺乏有效治療手段。PTC 對(duì)常規(guī)化療藥物不敏感，不良反應(yīng)大，研究發(fā)現(xiàn)BRAF 突變與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，抑制BRAF 編碼的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性對(duì)治療PTC、改善患者預(yù)后具有重要意義。實(shí)驗(yàn)證明RAS 點(diǎn)突變或RET 基因重排，MAPK 激酶抑制劑對(duì)BRAF 突變陽(yáng)性的甲狀腺癌細(xì)胞具有強(qiáng)的生長(zhǎng)抑制作用［9］。抑制MAPK 活性還可以恢復(fù)碘代謝相關(guān)基因的正常表達(dá)，提高對(duì)放射碘治療不敏感PTC 患者的攝碘率［10－11］。近年發(fā)現(xiàn)MAPK激酶的抑制劑Selumetinib 可以提高抗碘的甲狀腺癌患者的攝碘率［12］。針對(duì)MAPK 激酶途徑的抑制劑可望會(huì)成為有效的PTC 治療藥物。

［1］ 陳思睿，曹仁賢.BRAF 基因與甲狀腺癌分子診療的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2013，10(2):161.

［2］ Yu GP，Li JC，Branovan D，et al.Thyroid cancer incidence and survival in National Cancer Institute survcillance'epidemiology'and end results race/ethnicity groups［J］.Thyroid，2010，20(5):465.

［3］ 石光清，曹 艷.Survivin 蛋白和BRAF 基因在甲狀腺癌中的表達(dá)［J］.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2012，22(19):61.

［4］ Kim SJ，Lee KE，Myong JP，et al BRAFV600Emutation is associated with tumor aggressiveness in papillary thyroid cancer［J］.World J Surg，2012，36(2):310.

［5］ Basolo F，Torregrossa L，Giaannini R，et al.Correlation between the BRAFV600Emutation and tumor invasivenese in papillary thyroid carcinomas smaller than 20 millimeters:analysis of 1060 cases［J］.J Clin Endocrinol metab，2010，95(9):4197.

［6］ 易文君，鐘 德，鄒瓊燕.BRAF 基因突變與甲狀腺乳頭狀癌的相關(guān)性［J］.中南大學(xué)學(xué)(醫(yī)學(xué)版)，2012，37(4):370.

［7］ Sassolas G，Hafdi－Nejjari Z，F(xiàn)erraro A，et al.Oncogenic alterations papillary thyroid cancers of young patients［J］.Thyroid，2012，22(1):17.

［8］ 孟憲瑛，王廣義，譚毓銓.分化型甲狀腺癌的規(guī)范性治療［J］.吉林醫(yī)學(xué)，2009，30(5):462.

［9］ Cooper DS，Doherty GM，Haugen BR，et al.Revised management guidelines for patients with thyroid nodules and differentiated thyroid cancer［J］.Thyroid，2009，19(11):1167.

［10］ Kleiman DA，Buitrago D，Crowley MJ，et al.Thyroid stimulating hormone increases iodine uptake by thyroid cancer cells during BRAF silencing［J］.The Journal of surgical research，2013，182(1):85.

［11］ Barollo S，Pennelli G，Vianello F，et al.BRAF in primary and recurrent papillary thyroid cancers:the relationship with(131)I and 2－［(18)F］fluoro－2－deoxy－D－glucose uptake ability［J］.Eur J Endocrinol，2010，163(4):659.

［12］ Ho AL，Grewal RK，Leboeuf R，et al.Selumetinib－enhanced radioiodine uptake in advanced thyroid cancer［J］.N Engl J Med，2013，368(7):623.