鄒 敏，楊旭兵，鄭 輝，王 紅，李陸梅，孫 健，王福軍，吳發(fā)興，范根成

（1.青島易邦生物工程有限公司，山東 青島 266114；2.中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東 青島 266032）

偽狂犬?。╬seudorabie，PR）是由偽狂犬病病毒（pseudorabie virus，PRV）感染引起的豬、牛、羊、犬等多種動(dòng)物共患、急性傳染病[1-2]，我國將其列為二類動(dòng)物傳染病。豬是PRV的貯存宿主，病豬、帶毒豬以及帶毒鼠類為本病重要傳染源[3]。豬感染PRV后的臨床癥狀因感染日齡而異，仔豬常表現(xiàn)明顯的神經(jīng)癥狀或頑固性腹瀉，病死率達(dá)100%；斷奶仔豬病死率為10%～20%；育肥豬常呈隱性感染，僅表現(xiàn)增重減慢；成年豬感染后多耐過，但長期排毒；母豬則現(xiàn)為返情、不發(fā)情、屢配不孕；妊娠母豬通常表現(xiàn)為流產(chǎn)、產(chǎn)死胎和木乃伊胎；公豬則常發(fā)生睪丸腫脹、萎縮、種用性能降低或喪失等[4]。

本病于1902年由匈牙利學(xué)者Aujeszky最先發(fā)現(xiàn)，此后陸續(xù)在各養(yǎng)豬國家或地區(qū)被發(fā)現(xiàn)。我國自1947年首次報(bào)道此病以來[5]，此病幾乎遍布全國各地，嚴(yán)重阻礙了我國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。

控制本病最優(yōu)先的方式是進(jìn)行疫苗免疫接種。目前，美國、德國、荷蘭、比利時(shí)等西方發(fā)達(dá)國家均通過接種PRV基因缺失弱毒疫苗、疫情監(jiān)測等制訂一整套豬偽狂犬病根除計(jì)劃，消滅了該病[6]。我國對豬偽狂犬病實(shí)施預(yù)防為主的策略，通過開展疫苗（主要是PRV弱毒活疫苗）免疫、流行病學(xué)調(diào)查、監(jiān)測及綜合性措施進(jìn)行防控。2012年，我國首次頒布了《國家中長期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃（2012—2020年）》，明確提出采取分病種、分區(qū)域、分步驟的策略，通過加大疫病監(jiān)測、流行病學(xué)調(diào)查、提升科技支撐能力等措施，在2020年將生豬發(fā)病率降至5%，使豬偽狂犬病、豬瘟等豬群疫病得到凈化或根除。

為了摸清PRV感染情況，我們陸續(xù)對采集或收集的豬場組織樣品、血清樣品進(jìn)行了PRV PCR和野毒感染抗體檢測，現(xiàn)將有關(guān)情況報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織樣品。2012年至2013年，青島易邦公司技術(shù)服務(wù)部采集或收集來自我國東北、華北、華中、華東、華南、西南等地區(qū)14個(gè)省份、169個(gè)疑似繁殖障礙發(fā)病豬場的組織樣品1127份，經(jīng)查詢來樣登記表，其中明確使用豬偽狂犬病弱毒活疫苗的豬場有151個(gè)。

1.1.2 血清樣品。2012年至2013年，共采集或收到來自我國東北、華北、華中、華東、華南、西南等地區(qū)18個(gè)省份、393個(gè)豬場的豬血清樣品14801份，經(jīng)查詢來樣登記表，曾明確使用過豬偽狂犬病弱毒活疫苗的豬場有291個(gè)。

1.1.3 PRV gE-PCR檢測用試劑。PRV gE-PCR檢測引物直接引用吳發(fā)興等[7]的設(shè)計(jì)，上、下游引物的序列是：TCCACTCgCAgCTCTTCTCg、gCACgTCATCACgAAggAgC，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小約632bp，引物序列送上海生工進(jìn)行合成，溶解成20 pmol的濃度，-20℃凍存?zhèn)溆?。DNAzol購自Invitrogen公司，Ex-Taq酶、GC BufferI、DNA 2000Marker等PCR檢測用試劑購自大連寶生物。

1.1.4 ELISA檢測用試劑。偽狂犬病毒gpI ELISA（即gE-ELISA，用于檢測PRV野毒感染抗體）檢測試劑盒購自美國IDEXX公司。

1.1.5 主要儀器。3K15型臺(tái)式冷凍離心機(jī)由德國Sigma公司生產(chǎn)，TP600型PCR儀由寶生物公司生產(chǎn)，電泳儀及凝膠成像儀由北京六一儀器公司生產(chǎn)，Mutiskan MK3型酶標(biāo)儀由美國Thermo公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 待檢樣品處理

1.2.1.1 組織樣品的預(yù)處理。將凍存的組織樣品（主要是脾臟、淋巴結(jié)，少量樣品還含有腦組織）取出置室溫解凍，然后在超凈工作臺(tái)中用滅菌處理的剪刀、鑷子先剪至米粒大小，然后轉(zhuǎn)移至預(yù)先滅菌處理的玻璃研磨器中，加入5倍體積的滅菌生理鹽水，再研磨至糊狀，然后分裝到2mL滅菌離心管中，-70℃凍存待檢。

1.2.1.2 血清樣品的預(yù)處理。將采集或收集到的血清樣品平衡至室溫，觀察樣品是否呈淡黃色、透明狀液體，否則需經(jīng)過低速離心處理后方能進(jìn)行抗體檢測。

1.2.2 樣品檢測

1.2.2.1 組織樣品PRV gE-PCR檢測。從-70℃冰箱中取出經(jīng)預(yù)處理的樣品混懸液在室溫融解，4℃ 12000 r/min離心10 min，取250μL上清加入750μL DNAzol中提取PRV DNA，按照參考文獻(xiàn)[7]中的PRV野毒感染PCR檢測體系及方法進(jìn)行PRV gE-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行電泳檢測，用凝膠成像儀觀察是否有目的條帶出現(xiàn)，在陽性對照成立前提下進(jìn)行PCR檢測結(jié)果判定。

1.2.2.2 血清樣品檢測。取1.2.1.2節(jié)預(yù)處理過的豬血清和gE-ELISA試劑盒平衡至室溫進(jìn)行檢測，檢測過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，在陰陽性對照成立的前提下，如果待檢樣品的S/N值＜0.60，結(jié)果判定為PRV gE抗體陽性；如果待檢樣品的S/N值﹥0.70，結(jié)果判定為PRV gE抗體陰性；如果0.6＜S/N值≤0.7，則判定為可疑，需再次檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 組織樣品PRV PCR檢測結(jié)果

2.1.1 PRV病原學(xué)檢測結(jié)果。對1127份發(fā)病豬組織樣品進(jìn)行PRV gE-PCR檢測，結(jié)果共檢出PRV核酸陽性樣品98份，總體陽性率為8.69%；169個(gè)場中有31個(gè)豬場檢出PRV核酸陽性，場陽性率為18.34%。其中，明確使用豬偽狂犬病弱毒疫苗的151個(gè)豬場中檢出PRV核酸陽性場21個(gè)，場陽性率為13.91%；未進(jìn)行PRV弱毒活疫苗免疫或免疫背景不清楚的18個(gè)豬場中PRV核酸陽性場為10個(gè)，場陽性率為55.56%。組織樣品的PRV野毒感染PCR檢測結(jié)果說明，上述地區(qū)豬群中存在PRV野毒感染（表1）。

表1 2012—2013年14省份規(guī)模豬場PRV野毒感染PCR檢測結(jié)果

2.1.2 不同年份組織樣品PRV gE-PCR檢測結(jié)果比較。為了解采自不同年份發(fā)病豬場組織樣品中PRV野毒感染情況差異，對來自不同區(qū)域的發(fā)病豬組織樣品中PRV野毒感染PCR檢測結(jié)果進(jìn)行了比較，總體表現(xiàn)為隨著時(shí)間的推移，上述地區(qū)豬群中PRV野毒感染情況存在差異，有上升趨勢（表2）。

表2 2012—2013年不同地區(qū)規(guī)模豬場PRV野毒感染情況PCR檢測結(jié)果比較

2.1.3 PRV gE-PCR檢測情況區(qū)域差異比較。為比較各地區(qū)PRV病原學(xué)檢測結(jié)果差異，對組織樣品PCR檢測數(shù)據(jù)按地區(qū)進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同年份、不同地區(qū)被采樣豬群中均存在不同程度的PRV野毒感染，其中，華東地區(qū)被采樣豬群中PRV的病原學(xué)檢出率較高，其次是華中地區(qū)（圖1）。

圖1 不同年份、不同地區(qū)規(guī)模豬場PRV PCR檢測結(jié)果比較

2.2 血清樣品PRV gE-ELISA抗體檢測結(jié)果

2.2.1 PRV gE-ELISA檢測結(jié)果。對14801份血清樣品進(jìn)行檢測，共檢出PRV gE抗體陽性樣品2388份，平均陽性率達(dá)16.13%；393個(gè)場中173個(gè)豬場檢出PRV gE抗體陽性，場陽性率為44.02%。其中，曾進(jìn)行過豬偽狂犬病弱毒疫苗免疫的291個(gè)豬場中檢出陽性場158個(gè)，場陽性率達(dá)54.29%；未進(jìn)行疫苗免疫或免疫背景不清楚的102個(gè)豬場中有15個(gè)場檢出陽性，陽性率為14.71%（表3）。說明，上述18個(gè)省份豬群中可能存在PRV野毒感染，且較為普遍。

表3 2012—2013年18省份規(guī)模豬場PRV gE抗體檢測結(jié)果

2.2.2 不同年份PRV gE抗體陽性率比較結(jié)果。為了解采自不同年份豬血清樣品中PRV gE抗體陽性率差異，我們對來自不同區(qū)域的豬血清樣品PRV gE抗體陽性率進(jìn)行了比較，總體表現(xiàn)為隨著時(shí)間的推移，上述地區(qū)豬群中PRV gE抗體陽性率呈上升趨勢（表4）。

表4 2012—2013年不同地區(qū)規(guī)模豬場PRV gE抗體陽性率比較

2.2.3 PRV gE抗體檢測區(qū)域差異比較。為比較各地區(qū)PRV感染情況，我們對檢測數(shù)據(jù)按地區(qū)進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同年份、不同地區(qū)被采樣豬群中均存在不同程度的PRV野毒感染，其中華東地區(qū)感染情況最為嚴(yán)重，2012—2013年被檢測群體的PRV gE抗體陽性率均超過了20%，其次是華中、華南地區(qū)，西南、華北、東北地區(qū)相對較低（圖2）。

圖2 不同年份豬群規(guī)模豬場PRV gE抗體陽性率示意圖

2.2.4 不同日齡豬群PRV gE抗體檢測差異比較。為比較不同年份、不同日齡的豬群中PRV感染情況，我們對檢測數(shù)據(jù)按照年份、豬的日齡進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)（剔出日齡不明確的樣品），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同日齡的豬群PRV感染情況也存在差異，總體感染情況由高到低依次為種豬、哺乳仔豬、育肥豬、保育豬，但隨著時(shí)間推移，各年齡階段豬群中PRV野毒感染呈逐年上升趨勢（表5）。

3 討論

3.1 本研究中的樣品病原學(xué)檢測結(jié)果顯示，從14個(gè)省份、169個(gè)豬場、1127份發(fā)病豬組織樣品中檢出PRV核酸陽性樣品98份，總體陽性率為8.69%；169個(gè)豬場有中31個(gè)檢出PRV核酸陽性，場陽性率為18.34%。其中，明確使用PRV弱毒活疫苗的151個(gè)豬場中有21個(gè)陽性場，陽性率為13.91%；未進(jìn)行PRV弱毒活疫苗免疫或免疫背景不清楚的18個(gè)豬場中陽性場為10個(gè)，場陽性率為55.56%。表明在上述省份的被采樣豬群中存在PRV野毒感染。同時(shí)，按區(qū)域進(jìn)行歸類分析，可見華東、華中地區(qū)被檢測豬群PRV野毒檢出率高于東北、華北、華南、西南地區(qū)；從年份上看，上述地區(qū)被檢測豬群PRV野毒感染情況總體呈上升趨勢。

3.2 2012—2013年，18個(gè)省份、393個(gè)豬場檢出PRV gE抗體的總體陽性率達(dá)16.13%，場陽性率達(dá)到22.02%，剔除未免疫PRV弱毒疫苗場后的豬場陽性率高達(dá)54.29%，未進(jìn)行PRV弱毒疫苗免疫的場陽性率也達(dá)到了14.71%，說明上述地區(qū)的豬場的確存在PRV野毒感染。比較數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，曾經(jīng)使用過PRV弱毒活疫苗的豬場PRV野毒感染陽性率

反而比未免疫場或沒有明確免疫信息場PRV野毒感染陽性率還高，主要原因是本研究的數(shù)據(jù)全部來自疑似發(fā)病豬場，不排除已發(fā)生豬偽狂犬病的可能。規(guī)模化養(yǎng)豬場的免疫程序是根據(jù)本場疫病流行情況、防控需要制定的；疫苗免疫場陽性檢測率較高，可能是在免疫空白期感染了PRV野毒，因?yàn)镻RV一旦感染就會(huì)終身潛伏在豬體內(nèi)，會(huì)產(chǎn)生gE抗體本底，也不排除個(gè)別豬場使用過PRV全病毒滅活疫苗的可能性。

3.3 本研究先期主要開展的針對發(fā)病場或臨床不穩(wěn)定豬場的PRV野毒感染血清學(xué)鑒別檢測，對揭示被采樣地區(qū)相關(guān)豬場的PRV感染本底指導(dǎo)豬場開展本病的免疫與防控具有一定指導(dǎo)價(jià)值。同時(shí)，為掌握上述地區(qū)豬場PRV感染情況，我們還進(jìn)行了PRV野毒感染情況PCR檢測，盡管樣品數(shù)量相對較少，但檢測結(jié)果也充分證實(shí)這些豬場的確存在PRV的感染或發(fā)病。在后續(xù)監(jiān)測中我們將加大病原學(xué)檢測數(shù)量，進(jìn)一步掌握上述地區(qū)豬場PRV的感染狀況。

3.4 比較不同采樣時(shí)間、不同采樣地區(qū)以及不同日齡（即生產(chǎn)階段）豬群組織及血清樣品中PRV野毒感染檢測數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)樣品所在地區(qū)均存在不同程度的PRV野毒感染，以華東、華中最為嚴(yán)重；且各個(gè)地區(qū)豬群中PRV感染情況隨時(shí)間推移有上升趨勢。提示，上述地區(qū)應(yīng)加強(qiáng)該病的防控，各豬場應(yīng)確實(shí)做好豬偽狂犬病免疫和監(jiān)測，特別是要加強(qiáng)對種豬的免疫工作，必須確保從源頭做好凈化。查驗(yàn)樣品登記表發(fā)現(xiàn)，多數(shù)豬場盡管進(jìn)行了本病免疫，但多限于種豬，為降低生產(chǎn)成本，很少對后備豬、育肥豬進(jìn)行免疫，結(jié)合后備豬及育肥豬血清樣品PRV野毒感染抗體陽性率上升的這一結(jié)果，說明必須加強(qiáng)對后備豬的免疫工作，以確保豬場生產(chǎn)平穩(wěn)，避免發(fā)生疫情。

3.5 本研究結(jié)果充分說明，控制與凈化偽狂犬病對各養(yǎng)豬場來說仍然是一項(xiàng)挑戰(zhàn)性工作，特別是在當(dāng)前養(yǎng)殖密度高、流通頻繁、環(huán)境污染嚴(yán)重的大背景下。為有效預(yù)防和控制該病的發(fā)生與流行，借鑒歐美等發(fā)達(dá)國家消滅豬偽狂犬病的成功經(jīng)驗(yàn)，引導(dǎo)相關(guān)豬場采取以下綜合防控措施：一是堅(jiān)持自繁自養(yǎng)、全進(jìn)全出的養(yǎng)殖模式。二是嚴(yán)格引種管理，應(yīng)從無偽狂犬地區(qū)的豬場引種，做好引種前的隔離觀察、檢疫工作，從源頭堅(jiān)決阻斷外疫傳入。三是做好疫苗免疫接種工作，選擇臨床免疫預(yù)防效果確實(shí)的疫苗（建議使用安全有效的gE基因完全缺失弱毒疫苗），有效降低豬場豬偽狂犬病的發(fā)病率、死亡率，避免野毒感染。四是定期進(jìn)行免疫抗體和野毒感染抗體監(jiān)測，依據(jù)檢測結(jié)果及時(shí)進(jìn)行免疫或補(bǔ)免，當(dāng)檢測到陽性動(dòng)物時(shí)，結(jié)合病原學(xué)檢測結(jié)果，及時(shí)、堅(jiān)決剔除陽性動(dòng)物，以便凈化種群。五是加強(qiáng)豬場的飼養(yǎng)管理、營養(yǎng)和保健，以提升群體抗病能力。此外，還應(yīng)加強(qiáng)豬場的滅鼠、消毒工作，嚴(yán)格禁止外來人員、車輛入場。

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