王 娟，黃秀梅，崔曉娜，蓋文燕，曲志娜，王玉東，趙思俊，王君瑋

（1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心動(dòng)物產(chǎn)品安全監(jiān)測(cè)室，山東 青島 266032；2.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東 濰坊 261061）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），簡(jiǎn)稱金葡菌，是造成人類食物中毒的常見致病菌之一，在自然界分布廣泛，因此食品受其污染的機(jī)會(huì)較多。腸毒素是金葡菌引起食物中毒的主要致病因子，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易被破壞。據(jù)資料顯示，金黃色葡萄球菌腸毒素（staphylococcal enterotoxin，SE）有多種類型，不同類型腸毒素的毒力強(qiáng)弱不同，其中A型腸毒素（SEA）毒力最強(qiáng)[1]，引起的食物中毒事件最多。由于金葡菌是引起奶牛乳房炎的主要原因，極易造成生鮮牛奶中金葡菌污染，金葡菌在鮮牛奶中生長(zhǎng)繁殖過程中產(chǎn)生的腸毒素不容易通過加熱等方式分解。本文旨在了解目前我國(guó)生鮮牛奶中產(chǎn)腸毒素金葡菌污染狀況，分析產(chǎn)不同類型腸毒素金葡菌在不同區(qū)域的流行狀況，為有效控制我國(guó)牛奶中金葡菌腸毒素提供技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株。金黃色葡萄球菌（ATCC29213）、表皮葡萄球菌（ATCC12228），購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.2 主要試劑和培養(yǎng)基。7.5%NaCl肉湯、Baird-Parker瓊脂、MH肉湯、生化反應(yīng)管，均為北京陸橋技術(shù)有限公司生產(chǎn)；科瑪嘉顯色培養(yǎng)基，鄭州科瑪嘉生物有限公司生產(chǎn)；凍干兔血漿，廣東環(huán)凱生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；Master Mix，美國(guó)Promega公司生產(chǎn)；瓊脂糖，西班牙Biowest生產(chǎn)；Marker 2000，寶生物工程（大連）有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 主要儀器設(shè)備。可見分光光度計(jì)、基因擴(kuò)增儀（BIO-RAD）、凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD）等。

1.1.4 樣品。在山東、湖南、內(nèi)蒙等三省區(qū)的擠奶站和奶牛場(chǎng)共采集鮮奶樣品360份，冷藏，24h內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離。取1mL牛奶樣品接種到10mL7.5%NaCl肉湯中，37℃溫箱培養(yǎng)20h后，將增菌后的液體接種于Baird-Parker平板，37℃培養(yǎng)48h，然后挑取可疑菌落接種到科瑪嘉金葡菌顯色培養(yǎng)基上。

挑取可疑菌落，劃線接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板純化培養(yǎng)后，待進(jìn)一步細(xì)菌鑒定。

1.2.2 生化鑒定。挑取純化好的單個(gè)菌落進(jìn)行觸酶試驗(yàn)和血漿凝固酶試驗(yàn)。觸酶試驗(yàn)陽(yáng)性的菌落再進(jìn)行血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)；血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)中，呈現(xiàn)凝集者該菌判為金黃色葡萄球菌。

1.2.3 金黃色葡萄球菌PCR鑒定。用DNASTAR軟件，針對(duì)金黃色葡萄球菌設(shè)計(jì)1對(duì)引物，上游引 物 P1：5'- GCGATTGATGGTGATACGGTT-3'，下 游 引 物 P2：5'- AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC -3'。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約為279pb。煮沸法[2]提取DNA，反應(yīng)體系（25μL）如下：上下游引 物（25pmol/μL） 各 0.5μL，DNA 模 板 1μL，Mix 12.5μL ，加ddH2O補(bǔ)至25μL。PCR循環(huán)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性1min，57℃退火50s，72℃延伸50s，擴(kuò)增36個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5μL進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳（含EB0.5%μg/mL），電泳結(jié)束后，在紫外燈下觀察并用電泳圖像分析系統(tǒng)拍照，記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.4 金黃色葡萄球菌腸毒素基因擴(kuò)增。參照J(rèn)ohnson等[3]報(bào)道合成SEA、SEB、SEC、SED、SEE基因的PCR引物，根據(jù)Jarraud S等[4]報(bào)道合成SHE、SEI、SEG，根據(jù)Monday等[5]報(bào)道合成SEJ基因的PCR引物（表1）。

表1 金葡菌腸毒素引物序列

反應(yīng)體系為：上、下游混合引物（10μM）各2.0 μL，DNA 模板 1.0μL，Mix 12.5μL，加 ddH2O補(bǔ)至25μL。反應(yīng)程序?yàn)椋合?4℃預(yù)變性5min；再94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃終延伸10min；反應(yīng)完成后4℃保存。

1.2.5 金葡菌及其腸毒素污染差異性統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SAS軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 金葡菌分離鑒定結(jié)果

2.1.1 生化鑒定結(jié)果。分離菌株生化結(jié)果：觸酶試驗(yàn)陽(yáng)性，葡萄糖、麥芽糖、甘露醇陽(yáng)性，明膠陽(yáng)性，山梨醇陰性，血漿凝固酶陽(yáng)性。

2.1.2 PCR鑒定結(jié)果。以標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC29213為陽(yáng)性對(duì)照，從牛奶樣品中分離菌株能擴(kuò)增出大小約為279pb基因片段（圖1），陽(yáng)性對(duì)照樣品均能擴(kuò)增出與預(yù)期大小的DNA基因片段。對(duì)分離菌株P(guān)CR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果表明，該基因片段長(zhǎng)度為279bp。序列結(jié)果與GenBank公布的序列同源性達(dá)99.5%以上，說(shuō)明擴(kuò)增的基因片段為金黃色葡萄球菌16S-23SrRNA基因的保守區(qū)序列。鑒定結(jié)果與生化鑒定結(jié)果一致。

圖1 金黃色葡萄球菌PCR擴(kuò)增結(jié)果

從采集的360份生牛奶中，檢出金黃色葡萄球菌102株，檢出陽(yáng)性率為28.33%；其中從山東分離36株，湖南分離36株，內(nèi)蒙分離30株。

2.2 金葡菌腸毒素檢測(cè)結(jié)果

檢測(cè)結(jié)果顯示，102株金葡菌中，有96株產(chǎn)SEA、SEB、SEC等9種不同腸毒素基因，占94.12%，同時(shí)含2種及以上毒素的菌株有71株，占69.61%。產(chǎn)SEI的菌株最多，有86株，占84.31%。產(chǎn)其它腸毒素的有：產(chǎn)SEA的有20株，占19.61%；產(chǎn)SEB的有9株，占8.82%；產(chǎn)SEC的有5株，占4.90%；產(chǎn)SED的有 8株，占7.84%；產(chǎn)SEE的有2株，占1.96%；產(chǎn)SEG的有50株，占49.02%；產(chǎn)SHE的有39株，占38.24%；產(chǎn)SEJ的有7株，占6.86%。（圖3）。

圖2 各型腸毒素陽(yáng)性菌擴(kuò)增結(jié)果

圖3 產(chǎn)不同腸毒素的菌株比例

2.3 不同區(qū)域分產(chǎn)毒素金葡菌株分布狀況

通過比較發(fā)現(xiàn)，湖南和內(nèi)蒙所有分離菌株均產(chǎn)SEA—SAJ中的不同毒素，而從山東省分離菌株中產(chǎn)SEA—SAJ中不同腸毒素的菌株占的分離菌株數(shù)的55.56%；其中湖南和內(nèi)蒙分離所有菌株均產(chǎn)SEI，而約有55.56%的山東分離菌株產(chǎn)該毒素；山東和內(nèi)蒙約有55%的分離菌株產(chǎn)SEG，而約有35%的湖南分離菌株產(chǎn)該毒素；山東和湖南分離菌株中產(chǎn)SEA的菌株均高于20%，而內(nèi)蒙只有不足10%的分離菌株產(chǎn)該毒素；山東分離株有50%的產(chǎn)SHE，而湖南和內(nèi)蒙約有30%左右的分離菌株產(chǎn)該毒素，具體見圖4。

3 討論

由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒已經(jīng)成為世界性公共衛(wèi)生問題之一[6]。本次實(shí)驗(yàn)從360份生鮮牛奶中，檢出金黃色葡萄球菌102株，陽(yáng)性率為28.33%；分離菌株中產(chǎn)各型腸毒素的達(dá)94.12%，同時(shí)能產(chǎn)兩種以上腸毒素的有63株，占分離菌株數(shù)的61.76%。結(jié)果說(shuō)明，生鮮牛奶中金黃色葡萄球菌污染較嚴(yán)重，同時(shí)，產(chǎn)各型腸毒素的菌株普遍存在，對(duì)牛奶及奶制品質(zhì)量安全造成風(fēng)險(xiǎn)較大。

圖4 三省產(chǎn)不同金黃色葡萄球菌腸毒素菌株分布

所有分離菌株中能產(chǎn)毒性最強(qiáng)腸毒素SEA的菌株占近20.0%，這與Hazariwala等[6]報(bào)道的18.86%基本一致，遠(yuǎn)低于張嚴(yán)峻等[7]報(bào)道的食品中分離菌株產(chǎn)該型腸毒素占51.7%，這可能與檢測(cè)產(chǎn)品的單一性有關(guān)。湖南和內(nèi)蒙的所有分離菌都產(chǎn)不同型別的金黃色葡萄球菌腸毒素，山東分離菌株中55.56%的金葡菌產(chǎn)不同型別腸毒素；三個(gè)地區(qū)分離菌產(chǎn)腸毒素類型也各不相同，各地區(qū)生鮮牛奶中產(chǎn)腸毒素的金黃色葡萄球菌存在明顯差異，其原因有待于進(jìn)一步研究。

檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明，我國(guó)生鮮牛奶中金黃色葡萄球菌的污染率處于較高水平，這與國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道相符[8-9]，主要是由于奶牛乳房炎和擠奶過程中的交叉污染造成的。因此，要防止金黃色葡萄球菌的污染，奶牛場(chǎng)應(yīng)定期對(duì)奶牛進(jìn)行乳房炎檢測(cè)，并將擠出的鮮奶及時(shí)冷藏保存、運(yùn)輸，降低細(xì)菌繁殖速度，減少毒素的產(chǎn)生，從源頭上降低金葡菌腸毒素對(duì)牛奶及其制品帶來(lái)的安全風(fēng)險(xiǎn)。

本研究表明，從生鮮牛奶中分離的產(chǎn)各型腸毒素的金黃色葡萄球菌陽(yáng)性率較高，且不同地區(qū)間產(chǎn)腸毒素類型有所差異。金黃色葡萄球菌引起人和動(dòng)物的食物中毒事件在世界各國(guó)每年都有發(fā)生。實(shí)驗(yàn)證明，金黃色葡萄球菌引起的食物中毒是由其產(chǎn)生的腸毒素因子、而非活菌所致。食物中若含有足夠量的腸毒素即可引起食物中毒，癥狀為惡心、嘔吐、腹部疼痛和腹瀉[10]。由此可見，對(duì)產(chǎn)不同類型腸毒素金黃色葡萄球菌進(jìn)行研究，掌握不同地區(qū)菌株的分布狀況，對(duì)提高牛奶及其制品質(zhì)量，為食源性疾病的預(yù)防與控制提供可靠的信息和技術(shù)支持。

[1]梁毅珊.金黃色葡萄球菌腸毒素及其檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J].中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2008，8（9）：1658-1659.

[2]張?chǎng)┫?金黃色葡萄球菌腸毒素實(shí)驗(yàn)分析[J].上海預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2008，20（4）：186-188.

[3]Johnson W M，Tyler S D，Ewan E P，et al.Detection of genes for enterotoxins，exfoliative toxins and toxic shock syndrome toxin 1 in Staphylococcus aureus by the polymerase chain reaction[J]. Clin Microbiol，1991，29（3）：426-430.

[4]Jarraud S，Cozon G，Vandenesch F，etal.Involvement of enterotoxins G and I in staphylococcal toxic shock syndrome and staphylococcal scarlet fever[J].Clin Microbiol，1999，37（8）：2446-2449.

[5]Monday S R，Bohach G A.Use of multiplex PCR to detect classical and newly described pyrogenic toxin genes in staphylococcal isolates[J]. Clin Microbiol，1999，37（10）：3411-3414.

[6]Hazariwala A，Sanders Q，Hudson C R，et al.Distrebution of staphylococcal enterotoxin genes among Staphylococcus aureus isolates from poultry and humans with invasive staphylococcal disease[J]. Avian Dis，2002，46（1）：132-136.

[7]張嚴(yán)峻，張俊彥，梅玲玲，等.金黃色葡萄球菌腸毒素基因的分型和分布[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志2005，15（6）：682-684.

[8]巢國(guó)祥，焦新安.食源性金黃色葡萄球菌流行特征、產(chǎn)腸毒素特征及耐藥性研究[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2006，16（8）：904-907.

[9]賀連華，王瑞端.食品中金黃色葡萄球菌的腸毒素檢測(cè)及耐藥性[J].職業(yè)與健康雜志，2006，22（15）：1173-1174.

[10]張傳寶，薛良輝.山東省1984-2002年金黃色葡萄球菌引起食物中毒資料分析[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)信息，2003，9（5）：486.