詹森林 張國良 鐘紅劍 金曉菲 林巧 張明霞 陳心春 周伯平

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·論著·

不同毒性Mtb菌株對Ⅰ型干擾素基因的誘導作用及其在結(jié)核病患者外周血中的表達

詹森林 張國良 鐘紅劍 金曉菲 林巧 張明霞 陳心春 周伯平

目的 研究不同Mtb菌株對Ⅰ型干擾素基因的誘導作用及其在結(jié)核病患者外周血中的表達。 方法 從2012年2月至2012年8月在深圳市第三人民醫(yī)院健康體檢者中利用隨機數(shù)字表法抽取30名健康人外周血標本，并提取單個核細胞中分選出CD14+細胞，用重組人巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，M-CSF)刺激，誘導分化為人巨噬細胞，并分別感染Mtb減毒株H37Ra和Mtb標準株H37Rv，應用實時定量PCR(real-time PCR)檢測2種菌株感染后Ⅰ型干擾素基因IFNB和IFNA的相對表達量2-ΔΔCt值。此外使用上述方法對同期選取的結(jié)核病組(15例)、健康對照組(15例)、Mtb潛伏感染組(15例)的Ⅰ型干擾素基因的相對表達量進行檢測。采用GraphPad 4.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理，兩組均數(shù)間比較采用t檢驗，三組均數(shù)間比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果 經(jīng)H37Rv感染的健康人巨噬細胞的IFNB基因相對表達量2-ΔΔCt值(10.38±2.24)顯著高于空白對照組(6.26±3.42)，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.47,P=0.026)；經(jīng)H37Ra感染的巨噬細胞的IFNB基因相對表達量2-ΔΔCt值(8.92±0.85)與空白對照組(6.26±3.42)比較差異無統(tǒng)計學意義(t=1.84,P=0.09)；IFNA相對基因表達量2-ΔΔCt值在H37Rv感染組(5.11±2.31)、H37Ra感染組(5.17±3.40)及空白對照組(4.41±1.69)之間差異無統(tǒng)計學意義(F=0.16，P=0.85)。結(jié)核病組IFNB基因表達(4.32±1.22)顯著高于健康對照組(2.73±1.23)，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.55,P=0.0014)；IFNA基因在健康對照組(3.91±0.75)、Mtb潛伏感染組(4.25±1.03)、結(jié)核病組(4.73±1.44)之間表達差異無統(tǒng)計學意義(F=1.93，P=0.064)。結(jié)論 Mtb的感染可以誘導Ⅰ型干擾素基因的表達，在結(jié)核病患者中IFNB基因表達上調(diào)顯著。

結(jié)核； 干擾素Ⅰ型 ； 基因表達

結(jié)核病是由Mtb感染引起的一種慢性傳染病。目前全世界已有約20億人感染了Mtb，每年大約有200～300萬例結(jié)核病患者死亡[1]。而且，大多數(shù)人感染Mtb后都是終生持續(xù)的感染，目前Mtb影響宿主免疫信號通路的機制尚不完全清楚。

既往發(fā)現(xiàn)Ⅱ型干擾素[干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)]與Mtb感染關(guān)系密切，并且已有用于臨床診斷的Mtb IFN-γ酶聯(lián)免疫斑點檢測試劑盒。而對Ⅰ型干擾素在Mtb感染中的作用研究很少，Ⅰ型干擾素主要包括IFN-α、IFN-β、IFN-ω等，IFN-α和IFN-β，是典型的Ⅰ型干擾素。此類干擾素是一類具有抗病毒活性、抗細胞增殖和免疫調(diào)節(jié)作用的蛋白。近年越來越多的研究人員發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型干擾素與細菌感染也有一定的關(guān)系。Stanley等[2]在小鼠試驗中發(fā)現(xiàn)Ⅰ型干擾素對于感染Mtb的應答是通過早期分泌性抗原靶-6(early secreting antigenic target-6，ESAT-6)分泌系統(tǒng)-1(secretion system-1)介導分泌的，而ESX-1分泌系統(tǒng)是Mtb毒力的主要決定因素。Remoli等[3]在其體外試驗研究中發(fā)現(xiàn)，Mtb可以誘導人樹突狀細胞選擇性表達Ⅰ型干擾素基因。

由于目前對于結(jié)核病診斷缺乏既快速又敏感的方法，筆者基于國外文獻報道Mtb可以對Ⅰ型干擾素產(chǎn)生影響的基礎(chǔ)上，以標準有毒株H37Rv和弱毒株H37Ra刺激健康人巨噬細胞，觀察Ⅰ型干擾素基因IFNA和IFNB表達情況。同時在不同人群中檢測Ⅰ型干擾素基因表達是否有差異，尋找潛在的結(jié)核病診斷分子標識。

資料和方法

一、研究對象和材料來源

(一)研究對象

1.結(jié)核病組： 2012年2月至2012年8月在深圳市第三人民醫(yī)院接受治療的初治痰培養(yǎng)陽性的近1000例結(jié)核病患者標本庫中用隨機數(shù)字表法隨機抽取15例，年齡在18周歲以上；診斷標準參照2001年版《肺結(jié)核診斷和治療指南》[4]，診斷依據(jù)包括臨床表現(xiàn)、細菌學檢查、放射學檢查及對抗結(jié)核藥物治療效果。

2.健康對照組(healthy controls，HC)：同時期深圳市第三人民醫(yī)院健康體檢人員標本庫中采取上述方法選取15名，納入和排除標準為：年齡在18周歲以上；Mtb特異性IFN-γ 固相酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)(ELISPOT)檢測陰性；無結(jié)核病臨床表現(xiàn)；未合并其他傳染病、慢性疾病及自身免疫疾病。

3.Mtb潛伏感染(latent Mtb infection，LTBI)組：在同時期深圳市第三人民醫(yī)院健康體檢時發(fā)現(xiàn)潛伏感染人員中采用隨機數(shù)字表法隨機選取15例。納入和排除標準為：采用深圳市達科為生物公司外周血IFN-γ檢測試劑盒用ELISPOT法所得斑點數(shù)量陽性(即反應孔中斑點數(shù)減去背景孔中斑點數(shù)后斑點數(shù)>30)，同時TB-PPD試驗硬結(jié)直徑≥10 mm，X線胸片檢查正常并且沒有臨床癥狀的患者，未合并其他傳染病、慢性疾病及自身免疫疾病。

結(jié)核病組男8例，女7例，平均年齡(25.36±5.15)歲。潛伏感染組男7例，女8例，平均年齡(26.89±5.19)歲。健康對照組男8例，女7例，年齡18～50歲，平均(25.67±4.23)歲。三組在性別、年齡上差異無統(tǒng)計學意義(性別統(tǒng)計用卡方檢驗，χ2=0.18，P=0.91；年齡統(tǒng)計用方差分析，F(xiàn)=0.13,P=0.89)。

4.其他：此外采取上述方法在同時期深圳市第三人民醫(yī)院健康體檢人員中選取30名健康體檢者標本，用于誘導分化人巨噬細胞，其中男18例，女12例，年齡在18周歲以上，平均年齡(28.42±6.20)歲。本研究經(jīng)深圳市第三人民醫(yī)院倫理委員會批準，所有入組研究對象均簽署知情同意書。

(二)主要儀器和試劑來源

RNA抽提試劑盒RNeasy購自德國Qiagen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Erase和SYBR Green Ⅰ實時定量 PCR試劑盒均購自日本TaKaRa公司；Nanodrop紫外分光光度計為美國Agilent公司產(chǎn)品；7500實時熒光定量PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品；CD14抗體和MACS(magnetic activated cell sorting)磁珠分選儀為德國美天旎生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Mtb減毒株H37Ra (美國模式菌種收藏中心，25177)、Mtb標準株H37Rv(美國模式菌種收藏中心，25618)標準菌株均由本實驗室(深圳市第三人民醫(yī)院肝病研究所)保存并提供；溫箱為美國Thermo公司產(chǎn)品；離心機為美國Beckman公司產(chǎn)品，型號Allegra@X-12R。

二、試驗方法

1.外周血單個核細胞(PBMCs)的分離：使用肝素鋰抗凝管采集結(jié)核病組、Mtb潛伏感染組和健康對照組空腹的外周血5 ml，和30名健康人空腹的外周血20 ml，磷酸鹽緩沖液(PBS，pH值7.4)進行等倍稀釋混勻，緩慢鋪在淋巴細胞分離液，室溫800×g離心20 min后讓離心機自然緩慢停止轉(zhuǎn)動，用毛細吸管輕輕插到混濁帶，沿管壁輕輕吸出此層細胞，使用PBS洗滌后離心，即獲得PBMCs。

2.誘導分化人巨噬細胞，并用H37Ra或H37Rv菌株感染：健康人30名外周血PBMCs細胞使用CD14免疫磁珠分選單核細胞，加入重組人巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)10 ng/ml刺激，用RPMI(roswell park memorial institute)-1640完全培養(yǎng)基37 ℃溫箱中培養(yǎng)，第0、2、4天換液。第7天，加H37Rv、H37Ra[感染復數(shù)(MOI): 5][5]感染6 h后收細胞，立即提取RNA，進行下一步操作。并以不加Mtb感染的分化巨噬細胞作為空白對照(Blank)。

3.總RNA提取及引物設(shè)計：采用 RNeasy試劑盒提取PBMCs/巨噬細胞總RNA，用Nanodrop紫外分光光度計測定RNA純度和濃度。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫人類IFNA和IFNB基因的c-DNA序列，使用Primer Express 2.0軟件設(shè)計擴增引物，IFNA上游引物：5′-GTGAGGAAATACTTCCAAAGAATCAC-3′，下游引物：5′-TCTCATGATTTCTGCTCTGACAA-3′ (92 bp)；IFNB上游引物：5′-GTCTCCTCCAAATTGCTCTC-3′，下游引物：5′-ACAGGAGCTTCTGACACTGA-3′ (113 bp)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參基因，上游引物：5′-ACAGTCCATGCCATCACTGCC-3′，下游引物：5′-GCCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′ (245 bp)。

4. 逆轉(zhuǎn)錄和SYBR Green實時定量PCR檢測IFNA和IFNB水平： 取7 μl總RNA，用TaKaRa的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Erase 試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用SYBR Green Ⅰ實時定量 PCR試劑盒，使用IFNA和IFNB基因特異性擴增引物進行PCR反應，體系如下：2×SYBR Premix Ex Taq 10 μl，上、下游引物各0.8 μl，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μl， cDNA模板2 μl，加雙蒸水至20 μl。反應條件：95 ℃ 30 s，隨后95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個循環(huán)。通過SBS 1.5軟件分析樣本閾值循環(huán)(cycle threshold，Ct)值，由于樣本間存在不一致因素，通過內(nèi)參基因Ct值進行標準化，最終以2-ΔΔCt值表示IFNA和IFNB拷貝數(shù)。

5.統(tǒng)計學分析：數(shù)據(jù)分析前均用Bartlett檢驗方差齊性，P>0.05，認為方差齊，計量資料用“均數(shù)±標準差”表示。三組均數(shù)之間比較采用方差分析，兩組均數(shù)間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。采用GraphPad 4.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理。

GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶；“IFNA/GAPDH”為“IFNA基因相對表達量2-ΔΔCt值”(相對表達量是與參照對象GAPDH內(nèi)參基因相對比的)圖1 H37Ra或H37Rv菌株感染健康人巨噬細胞后IFNA表達水平的變化

結(jié) 果

1. H37Ra或H37Rv菌株感染健康人巨噬細胞后IFNA和IFNB基因表達水平的變化： Real-time PCR結(jié)果顯示，30名健康人巨噬細胞經(jīng)H37Ra或H37Rv菌株感染后，三組間IFNA基因相對表達量2-ΔΔCt值分別為空白對照組(4.41±1.69)、H37Ra組(5.17±3.40)、H37Rv組(5.11±2.31)，IFNA基因相對表達量在用H37Ra或H37Rv菌株感染前后三組之間差異無統(tǒng)計學意義(F=0.16，P=0.85，圖1)。IFNB基因相對表達量經(jīng)H37Rv菌株感染后表達上調(diào)(10.38±2.24)，顯著高于空白對照組(6.26±3.42)，差異具有統(tǒng)計學意義(t=2.47,P=0.026)，H37Ra感染組與空白對照組之間比較(8.92±0.85和6.26±3.42)差異無統(tǒng)計學意義(t=1.84，P=0.09，圖2)。

GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶；“IFNA/GAPDH”為“IFNA基因相對表達量2-ΔΔCt值”(相對表達量是與參照對象GAPDH內(nèi)參基因相對比的)圖2 H37Ra或H37Rv菌株感染健康人巨噬細胞后IFNB表達水平的變化

2.三組人群中IFNA和IFNB基因的表達情況：三組人群間IFNA基因表達差異無統(tǒng)計學意義(F=1.94，P=0.16，圖3)。結(jié)核病患者IFNB基因表達量2-ΔΔCt值為(4.32±1.22)顯著高于健康對照組表達水平的(2.73±1.23)，差異具有統(tǒng)計學意義(t=3.55,P=0.0014，圖4)，與Mtb潛伏感染組(3.49±1.04)比較差異無統(tǒng)計學意義(t=1.97,P=0.06)。

GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶；“IFNA/GAPDH”為“IFNA基因相對表達量2-ΔΔCt值”(相對表達量是與參照對象GAPDH內(nèi)參基因相對比的)圖3 三組人群PBMCs中IFNA基因的相對表達量

GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶；“IFNA/GAPDH”為“IFNA基因相對表達量2-ΔΔCt值”(相對表達量是與參照對象GAPDH內(nèi)參基因相對比的)圖4 三組人群PBMCs中IFNB基因的相對表達量

討 論

結(jié)核病的診斷是一個世界性的難題，許多研究者致力于尋找新的Mtb分子診斷標識，但目前被廣泛應用于臨床的分子標識仍然是IFN-γ，同時作為干擾素家族，Ⅰ型干擾素在結(jié)核病方面的診斷價值尚未評估。筆者發(fā)現(xiàn)H37Rv可以誘導IFNB基因表達上調(diào)，所以筆者進一步對結(jié)核病患者、健康人和Mtb潛伏感染者三組人群Ⅰ型干擾素基因的表達情況進行了對比分析，結(jié)果表明，結(jié)核病患者組IFNB基因表達水平顯著高于健康人群，且差異有統(tǒng)計學意義。這與Nature雜志的報道結(jié)果一致：Berry等[6]的課題組用基因芯片鑒定出中性粒細胞來源的與IFN信號通路相關(guān)的86個基因標志物用于活動性結(jié)核病的診斷，提示結(jié)核病的發(fā)生、發(fā)展與IFN通路密切相關(guān)，這其中包括有Ⅰ型干擾素基因。

本研究結(jié)果顯示，Mtb標準株H37Rv和弱毒株H37Ra均能引起IFNB基因表達顯著上調(diào)，其中H37Rv感染組IFNB基因含量顯著高于空白對照組，且差異具有統(tǒng)計學意義。H37Ra感染組和H37Rv感染組IFNB基因含量有差別，但差異無統(tǒng)計學意義。H37Rv和H37Ra兩者之間主要在于毒力上的差別，而毒力很大程度上與毒力相關(guān)蛋白有關(guān)，蛋白的表達與否取決于基因及其調(diào)控基因。H37Rv在減毒為H37Ra的過程中，胞外蛋白有11種蛋白含量降低、3種蛋白含量增加和3種蛋白不表達[7]。這兩種菌株在感染巨噬細胞后誘導宿主細胞產(chǎn)生不同的轉(zhuǎn)歸：H37Rv能夠抑制細胞凋亡，在胞內(nèi)存活、繁殖、擴散，導致細胞壞死，從而引發(fā)炎癥反應、細菌擴散；而H37Ra能誘導宿主細胞產(chǎn)生大量凋亡[8]。導致Ⅰ型干擾素基因表達差異是由于菌株的哪一種蛋白引起的，目前還不清楚。

綜上所述，Mtb的感染可引起 IFNB基因的表達，且與Mtb菌株的毒力有一定的關(guān)聯(lián)，毒力不同的菌株IFNB基因的表達量有所不同，但是差異無統(tǒng)計學意義。對不同人群的比較研究發(fā)現(xiàn)，IFNB基因表達在結(jié)核病患者中的表達水平要高于正常人群，具有潛在的診斷價值。但目前還沒有經(jīng)大樣本評估，具體特異度與敏感度如何尚不明確。另外，本研究未探討不同毒力的Mtb菌株對Ⅰ型干擾素基因表達的影響機制，需進一步研究。

[1] World Health Organization. WHO Global tuberculosis control-surveillance, planning, financing. Geneva: World Health Organization, 2008.

[2] Stanley SA, Johndrow JE, Manzanillo P, et al. The typeⅠIFN response to infection with Mycobacterium tuberculosis requires ESX-1-mediated secretion and contributes to pathogenesis. J Immunol, 2007, 178(5): 3143-3152.

[3] Remoli ME, Giacomini E, Lutfalla G, et al. Selective expression of type Ⅰ IFN genes in human dendritic cells infected with Mycobacterium tuberculosis. J Immunol, 2002,169(1): 366-374.

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[7] M?len H, De Souza GA, Pathak S, et al. Comparison of membrane proteins of Mycobacterium tuberculosis H37Rv and H37Ra strains. BMC Microbiol,2011，11:18.

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(本文編輯：薛愛華)

The induction of type Ⅰ interferon by differentM.tuberculosisstrains and its expression in the peripheral blood of the patients with tuberculosis

ZHAN Sen-lin*, ZHANG Guo-liang, ZHONG Hong-jian, JIN Xiao-fei, LIN Qiao, ZHANG Ming-xia, CHEN Xin-chun, ZHOU Bo-ping.

*Guangdong Key Laboratory for Emerging Infectious Disease, the Affiliated Shenzhen Third Hospital，Guangdong Medical College， Shenzhen 518112，China

Corresponding author: ZHOU Bo-ping, Email：zhoubp@hotmail.com

Objective To study the induction of type I interferon (IFN) by different M. tuberculosis (Mtb) strains and its expression in the peripheral blood of the patients with tuberculosis. Methods CD14+cells were isolated from the peripheral blood mononuclear cells of 30 healthy people from Feb 2012 to Aug 2012, and were stimulated by the recombinant human macrophage colony stimulating factor (M-CFS) for 7 days, and differentiated into human macrophages. These macrophages were infected with Mtb strains H37Ra and H37Rv, respectively. The expression levels of type Ⅰ IFN genes IFNB and IFNA in the macrophages were detected with real-time PCR assay. We also observed the gene expression of type Ⅰ IFN in different population (15 healthy controls, 15 persons with latent Mtb infection and 15 patients with tuberculosis). Using GraphPad 4.0 software for statistical analysis,P<0.05 was considered statistically significant. Results After Mtb H37Rv infection, IFNB gene expression in human macrophages was significantly higher than that in the control group (10.38±2.24 vs 6.26±3.42;t=2.47,P=0.026). There were no significant differences in IFNB gene expression between Mtb H37Ra infection group and control group (8.92±0.85 vs 6.26±3.42;t=1.84,P=0.09). There were no significant differences in IFNA gene expression among Mtb H37Rv infection group, H37Ra infection group and control group (5.11±2.31 vs 5.17±3.40 vs 4.41±1.69;F=0.16，P=0.85). The IFNB gene expressions in TB patients (4.32±1.22) were significantly higher than that in healthy controls (2.73±1.23;t=3.55,P=0.0014). There were no significant differences in IFNA gene expression among healthy controls, the persons with latent Mtb infection and the patients with tuberculosis (3.91±0.75 vs 4.25±1.03 vs 4.73±1.44；F=1.93，P=0.064). Conclusion Virulent Mycobacterium tuberculosis infection can induce type Ⅰ IFN gene expression. Up-regulated expression of IFNB gene can be used as a potential molecular marker in the diagnosis of tuberculosis.

Tuberculosis； Interferon type Ⅰ； Gene expression

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.01.008

國家自然科學基金(81172732，81341128)；廣東省自然科學基金(S2012040007213)；深圳市科技計劃項目(201202189)；深圳市科技計劃基礎(chǔ)研究項目(JCYJ20140411111718166)

518112 廣東醫(yī)學院附屬深圳市第三人民醫(yī)院 廣東省新發(fā)傳染病診治重點實驗室(詹森林、張國良、金曉菲、張明霞、陳心春、周伯平)；深圳市寶安區(qū)慢性病防治院結(jié)核科(鐘紅劍、林巧)

周伯平，Email：zhoubp@hotmail.com

2014-10-28)