陳希 李曉轅 李玲 孟萍 張廷軍 趙紅梅 李云鵬

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·論著·

結(jié)核感染T細胞斑點試驗在結(jié)核性胸膜炎診斷中的價值

陳希 李曉轅 李玲 孟萍 張廷軍 趙紅梅 李云鵬

目的 評價結(jié)核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)在結(jié)核性胸膜炎診斷及鑒別診斷中的臨床應(yīng)用價值。方法 選取沈陽市胸科醫(yī)院2012年8月至2013年6月住院的診斷明確的所有胸腔積液患者93例。其中符合《臨床診療指南結(jié)核病分冊》對結(jié)核性胸膜炎診斷標準的48例患者為結(jié)核病組；根據(jù)病理學(xué)、病原學(xué)、療效等確診的非結(jié)核性胸腔積液45例患者為對照組。用T-SPOT.TB方法檢測兩組患者的外周血單個核細胞(PBMC)中對結(jié)核分枝桿菌早期分泌靶抗原6(ESAT-6)和(或)培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP-10)致敏的T淋巴細胞(即斑點形成細胞，SFC)的數(shù)量，再對兩組患者SFC陽性率進行比較；同時檢測兩組患者胸腔積液中腺苷脫氨酶(ADA)、血清結(jié)核抗體(TB-AB)、胸腔積液結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)(Mtb culture)情況，并與T-SPOT.TB檢測進行比較。采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，各組樣本“率”的比較采用Pearsonχ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果 T-SPOT.TB檢測在結(jié)核病組陽性率為91.67%(44/48)，顯著高于對照組的陽性率8.89%(4/45)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=63.73，P<0.05)。T-SPOT.TB(E/C)的敏感度(91.67%，44/48)高于單用 ESAT-6的敏感度(85.42%，41/48)或單用CFP-10 的敏感度(75.00%，36/48)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(與ESAT-6比較：χ2=0.92，P>0.05；與CFP-10比較：χ2=4.8，P>0.05)。T-SPOT.TB、胸腔積液中ADA檢測、血清TB-AB檢測、胸腔積液Mtb culture的敏感度分別為91.67%(44/48)、70.83%(34/48)、62.50%(30/48)、14.58%(7/48)；特異度分別為91.11%(41/45)、55.56%(25/45)、62.22%(28/45)、100.00%(45/45)；診斷準確率分別為94.62%(88/93)、63.44%(59/93)、62.37%(58/93)、55.91%(52/93)；除胸腔積液Mtb culture特異度高于T-SPOT.TB外(χ2=4.18，P<0.05)，T-SPOT.TB(E/C)檢測敏感度和特異度均高于其他檢驗方法，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(T-SPOT.TB與ADA比較：敏感度χ2=6.84，P<0.05；特異度χ2=14.55，P<0.05。T-SPOT.TB與TB-AB比較：敏感度χ2=11.56，P<0.05；特異度χ2=10.49，P<0.05。T-SPOT.TB與Mtb culture比較：敏感度χ2=57.27，P<0.05；χ2=4.18，P<0.05)。結(jié)論 T-SPOT.TB在診斷結(jié)核性胸膜炎時有較高的敏感度、特異度和診斷準確率，值得在臨床廣泛推廣和應(yīng)用。

結(jié)核, 胸膜； 干擾素γ釋放試驗； 敏感性與特異性

結(jié)核性胸膜炎是胸腔積液最常見的原因，在各種不同病因的胸腔滲液中占30%～60%，與淋巴結(jié)結(jié)核并列為最常見的肺外結(jié)核[1]。目前結(jié)核性胸膜炎的診斷主要是通過病史、臨床表現(xiàn)、影像學(xué)和胸腔積液常規(guī)檢查和療效觀察，診斷準確率較低，與惡性胸腔積液等難以鑒別，易造成誤診，從而帶來嚴重后果[2]。細菌學(xué)和病理學(xué)檢查是結(jié)核性胸膜炎診斷的金標準，但因結(jié)核性胸腔積液中細菌含量少，胸腔積液中涂片和培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌陽性率低，且胸腔積液結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)(Mtb culture)時間較長，通過胸膜活檢或胸腔鏡取病理檢查陽性率相對較高，但這些為有創(chuàng)性檢查，不能作為常規(guī)應(yīng)用，免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)簡便、快速，適合大規(guī)模篩查，但有假陽性和操作不當(dāng)影響效果的缺點，現(xiàn)有檢測方法對結(jié)核性胸膜炎的診斷存在局限性，迫切需要一種新的檢測技術(shù)以提高結(jié)核性胸膜炎的診斷準確性。

目前，臨床上應(yīng)用由ELISPOT技術(shù)發(fā)展而來的結(jié)核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)進行結(jié)核分枝桿菌感染的早期診斷，此方法使用結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激外周血單個核細胞(PBMC)，通過細胞因子γ干擾素(INF-γ)的分泌檢測抗原特異性T淋巴細胞的應(yīng)答反應(yīng)，從而判斷結(jié)核分枝桿菌感染的狀態(tài)，具有較高的敏感度和特異度[3-4]。本實驗通過對患者外周血進行T-SPOT.TB檢測，并與胸腔積液中腺苷脫氨酶(ADA)檢測、血清結(jié)核抗體(TB-AB)檢測、胸腔積液Mtb culture共3種傳統(tǒng)檢測方法比較，探討其在結(jié)核性胸膜炎診斷及鑒別診斷中的臨床應(yīng)用價值，從而提高結(jié)核性胸膜炎早期診斷水平。

材料和方法

一、研究對象

1. 結(jié)核病組：2012年8月至2013年6月我院收治的全部符合《臨床診療指南結(jié)核病分冊》[5]對結(jié)核性胸膜炎診斷標準的患者48例為結(jié)核病組。其中男31例，女17例；年齡14～85歲，平均年齡(39.5±19)歲。30例為確診患者，其中胸腔積液Mtb culture陽性7例，23例經(jīng)胸膜病理檢查可見干酪性肉芽腫；臨床診斷患者18例，抗結(jié)核治療有效。48例患者中，單純結(jié)核性胸膜炎33例，合并肺結(jié)核15例。

2. 對照組：2012年8月至2013年6月我院收治的明確診斷的全部非結(jié)核性胸腔積液患者45例，其中胸膜轉(zhuǎn)移癌21例，胸膜間皮瘤6例，肺炎旁胸腔積液12例，風(fēng)濕性疾病3例，心功能不全3例。其中腫瘤患者均經(jīng)病理學(xué)或細胞學(xué)檢查明確診斷，其他疾病根據(jù)病原學(xué)、臨床癥狀、體征、化驗檢查、影像學(xué)表現(xiàn)及療效等證實。其中男25例，女20例；年齡26～78歲，平均年齡(53±15)歲。45例患者既往均無結(jié)核病病史和結(jié)核病接觸史，無合并活動性肺結(jié)核或影像學(xué)未顯示陳舊性結(jié)核病變，腫瘤患者未經(jīng)過放療、化療和手術(shù)治療。

兩組所有患者均無HIV感染者和艾滋病患者及急性病毒感染者，未接受免疫抑制劑和增強劑治療。兩組患者的年齡經(jīng)兩獨立樣本均數(shù)t檢驗(t=1.96，P>0.05)，性別經(jīng)卡方檢驗(χ2=0.815,P>0.05)，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性。本研究過程經(jīng)我院倫理委員會審核，所有研究對象對臨床診斷過程知情同意。

二、主要試劑和儀器

T-SPOT.TB試劑盒(牛津Immunotec公司產(chǎn)品，英國)，人淋巴細胞分析儀(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程醫(yī)學(xué)研究所灝陽生物公司產(chǎn)品)，細胞培養(yǎng)液 RPMI Medium 1640(美國Invitrogen/Gibco公司產(chǎn)品)，無血培養(yǎng)液 AIM-V(美國Invitrogen/Gibco公司產(chǎn)品)，二氧化碳培養(yǎng)箱(北京北方利輝試驗儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品)，酶聯(lián)斑點分析儀(Immunospot TATC Analyzer，美國CTL公司產(chǎn)品)，結(jié)核分枝桿菌IgG抗體檢測試劑盒(濰坊市康華生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)，腺苷脫氨酶測定試劑盒(北京九強生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)，TBA-40FR全自動生化分析儀[東芝醫(yī)療系統(tǒng)(中國)有限公司產(chǎn)品]，全自動Bactec MGIT 960系統(tǒng)(美國BD公司產(chǎn)品)，MGIT 960液體培養(yǎng)基(管)(美國BD公司產(chǎn)品)。

三、T-SPOT.TB檢測方法

采用T-SPOT.TB試劑盒檢測分泌IFN-γ的T細胞，嚴格按照說明書操作。抽取患者外周血4～5 ml，將抗凝液和血液混勻待用；放置室溫于4 h內(nèi)進行PBMCs的分離，用淋巴細胞分離液分離PBMCs，配制細胞濃度為2.5×106個/ml的細胞懸液至少300 μl待用。每份待測樣本需要4個檢測孔：空白對照孔、檢測孔A(抗原A)和檢測孔B(抗原B)、陽性質(zhì)控對照[植物血凝素(phytohaemagglutinin,PHA)對照]，在各反應(yīng)孔內(nèi)加入下列試劑：加入50 μl細胞培養(yǎng)液至每個空白對照孔內(nèi)；加入50 μl抗原A溶液至每個必要的檢測孔內(nèi)；加入50 μl抗原B溶液至每個必要的檢測孔內(nèi)；加入50 μl陽性質(zhì)控至每個細胞功能控制孔內(nèi)；然后每孔加入100 μl配制好的濃度為2.5×106個/ml的PBMCs懸液，將反應(yīng)板放入濕潤的培養(yǎng)箱在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)18～20 h，棄培養(yǎng)上清液，每個反應(yīng)孔用200 μl PBS緩沖液清洗4次，在每個孔中加入50 μl標記抗體工作液，2 ℃～8 ℃孵育1 h，棄去液體，每孔用200 μl PBS緩沖液清洗4次，每孔加入50 μl底物顯色溶液室溫孵育7 min，用蒸溜水或去離子水沖洗終止反應(yīng)，將板放入37 ℃烘箱干燥或者室溫干燥，記數(shù)著色的斑點，每一個點代表一個分泌IFN-γ的T淋巴細胞。

四、T-SPOT.TB結(jié)果判斷

1. 陽性判斷標準：按照T-SPOT.TB試劑盒使用說明書，根據(jù)檢測孔的反應(yīng)判斷結(jié)果，檢測結(jié)果為“陽性”，參照以下標準：(1)空白對照孔斑點數(shù)為0～5個時且(抗原A或抗原B孔斑點數(shù))-(空白對照孔斑點數(shù))≥6；(2)空白對照孔斑點數(shù)為6～10個時且(抗原A或抗原B孔斑點數(shù))≥2×(空白對照孔斑點數(shù))。

2. 陰性判斷標準：如果上述標準不符合，且陽性對照孔正常時，檢測結(jié)果為“陰性”。各抗原T-SPOT.TB陽性及陰性檢測結(jié)果見圖1～2。

圖1 陽性結(jié)果示意圖(抗原A或抗原B孔斑點數(shù)-陰性對照孔斑點數(shù)≥6)

圖2 陰性結(jié)果示意圖(陽性對照孔正常，抗原A或抗原B孔斑點數(shù)-陰性對照孔斑點數(shù)≤6)

五、血清TB-AB檢測

采用結(jié)核分枝桿菌IgG抗體檢測試劑盒，應(yīng)用膠體金法，取靜脈血4～5 ml，離心半徑15 cm，4000 r/min離心10 min，檢測卡平衡至室溫，在硝酸纖維膜區(qū)中間位置加4 μl血清，待血清完全吸收后，在加樣孔中加入50～80 μl稀釋液，15 min后觀察結(jié)果，出現(xiàn)1條紅色質(zhì)控線為陰性，出現(xiàn)質(zhì)控線和反應(yīng)線2條紅色為陽性。

六、胸腔積液中ADA檢測

采用速率法檢測，參照ADA測定試劑盒使用說明，取胸腔積液5 ml，離心半徑15 cm，2000 r/min離心10 min，取上清液，應(yīng)用TBA-40FR全自動生化分析儀進行結(jié)果分析，胸腔積液ADA≥45 U/L為陽性。

七、胸腔積液中Mtb culture

采用Bactec MGIT 960系統(tǒng)快速培養(yǎng)操作方法，取胸腔積液5 ml于無菌試管中，先將樣本消化處理，從中取0.5 ml樣本加入含有雜菌抑制劑和營養(yǎng)添加劑7 ml的Bactec MGIT 960液體培養(yǎng)基(管)中培養(yǎng)，培養(yǎng)陽性者均以鑒別培養(yǎng)基對其菌種進行鑒定，將非結(jié)核分枝桿菌排除。

八、統(tǒng)計學(xué)處理

斑點形成細胞(SFC)數(shù)量呈非正態(tài)分布，用中位數(shù)表示；兩組間SFC數(shù)量比較應(yīng)用Mann-WhiteyU檢驗；各組樣本率的比較采用Pearsonχ2檢驗；敏感度(結(jié)核病組患者中T-SPOT.TB檢測陽性例數(shù)/結(jié)核病組患者總例數(shù))、特異度(結(jié)核病組患者中T-SPOT.TB檢測陰性例數(shù)/結(jié)核病組患者總例數(shù))、陽性預(yù)測值(結(jié)核病組患者中T-SPOT.TB檢測陽性例數(shù)/兩組中T-SPOT.TB檢測陽性總例數(shù))、陰性預(yù)測值(對照組患者中T-SPOT.TB檢測陰性例數(shù)/兩組中T-SPOT.TB檢測陰性總例數(shù))、診斷準確率(結(jié)核病組患者中T-SPOT.TB檢測陽性例數(shù)+對照組患者中T-SPOT.TB檢測陰性例數(shù)/兩組患者總例數(shù))、約登指數(shù)(1-誤診率-漏診率)用四格表計算；應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、兩組間不同抗原T-SPOT.TB形成SFC數(shù)量的比較

分別以早期分泌靶抗原6(ESAT-6)和培養(yǎng)濾液蛋白-10(CFP-10)多肽抗原作為刺激物，結(jié)核病組和對照組每例患者T-SPOT.TB形成的SFC間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(U=205，P<0.001；U=327，P<0.001)，結(jié)核病組均顯著高于對照組的SFC數(shù)量(表1，圖3)。

表1 結(jié)核病組和對照組不同抗原T-SPOT.TB形成的SFC數(shù)量比較

注 括號外數(shù)值為兩組斑點形成細胞(SFC)數(shù)量的中位數(shù)，括號內(nèi)為各組患者SFC數(shù)量的最小值和最大值

圖中“圓點”代表兩組研究對象經(jīng)ESAT-6抗原和CFP-10多肽抗原刺激后形成的SFC數(shù)量，黑線代表SFC數(shù)量的中位數(shù)圖3 結(jié)核病組(48例)和對照組(45例)患者SFC數(shù)量散點圖

二、兩組間不同抗原T-SPOT.TB形成SFC陽性率的比較

結(jié)核病組和對照組兩組間ESAT-6、CFP-10和E/C(對ESAT-6抗原或CFP-10多肽抗原任一陽性)在T-SPOT.TB形成SFC陽性率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；結(jié)核病組3種抗原T-SPOT.TB形成SFC的陽性率顯著高于對照組形成SFC的陽性率(χ2=6.84，P<0.001)(表2)。

三、T-SPOT.TB對結(jié)核性胸膜炎的診斷評價

由于T-SPOT.TB試劑盒檢測孔A(ESAT-6抗原作為刺激物)和檢測孔B(CFP-10多肽抗原作為刺激物)使用的抗原不同，引起的細胞免疫反應(yīng)也有所差別，聯(lián)合應(yīng)用(E/C)可提高檢測的陽性率。T-SPOT.TB(E/C)在結(jié)核病組的診斷中敏感度(91.67%)、陰性預(yù)測值(91.11%)、約登指數(shù)(Youden)(0.828)，診斷準確率(94.62%)均高于單獨應(yīng)用ESAT-6抗原或CFP-10多肽抗原檢測的各項指標，但聯(lián)合應(yīng)用(E/C)與單用ESAT-6抗原的敏感度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.92，P>0.05)，聯(lián)合應(yīng)用(E/C)與單用CFP-10抗原的敏感度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.8，P<0.05)。ESAT-6抗原和CFP-10多肽抗原比較，除了特異度相同外，ESAT-6抗原的各項指標數(shù)均高于CFP-10多肽抗原(表3)，但兩者敏感度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.64，P>0.05)。

表2 兩組患者在3種抗原T-SPOT.TB檢測下SFC陽性率比較

注a：E/C表示對ESAT-6抗原或CFP-10多肽抗原任一陽性；表中括號內(nèi)的分母數(shù)值為兩組患者的例數(shù)，分子數(shù)值為各抗原檢測陽性的例數(shù)

表3 T-SPOT.TB檢測在結(jié)核性胸膜炎診斷中的評價

注 敏感度(%)=結(jié)核病組中“E/C”陽性例數(shù)/總例數(shù)×100%，特異度(%)=對照組中“E/C”陰性例數(shù)/總例數(shù)×100%，陽性預(yù)測值(%)=結(jié)核病組中“E/C”陽性例數(shù)/兩組中陽性總例數(shù)×100%，陰性預(yù)測值(%)=對照組中“E/C”陰性例數(shù)/兩組中陰性總例數(shù)×100%，診斷準確率(%)=(結(jié)核病組中“E/C”陽性例數(shù)+對照組中“E/C”陰性例數(shù))/兩組總例數(shù)×100%。敏感度：ESAT-6與CFP-10比較，χ2=1.64，P=0.2；ESAT-6與E/C比較，χ2=0.92，P=0.34；CFP-10與E/C比較，χ2=4.8，P=0.03。特異度：ESAT-6與CFP-10比較，相同；ESAT-6與E/C比較，χ2=1.08，P=0.30；CFP-10與E/C比較，χ2=1.08，P=0.3。陽性預(yù)測值：ESAT-6與CFP-10比較，χ2=0.24，P=0.87；ESAT-6與E/C比較，χ2=0.08，P=0.78；CFP-10與E/C比較，χ2=0.01，P=0.91。陰性預(yù)測值：ESAT-6與CFP-10比較，χ2=1.08，P=0.30；ESAT-6與E/C比較，χ2=0.66，P=0.42；CFP-10與E/C比較，χ2=3.22，P=0.07。診斷準確率：ESAT-6與CFP-10比較，χ2=1.16，P=0.28；ESAT-6與E/C比較，χ2=1.81，P=0.18；CFP-10與E/C比較，χ2=5.60，P=0.02

表4 各種檢驗方法診斷結(jié)核性胸膜炎的評價

注 T-SPOT.TB(E/C)檢測的敏感度分別與ADA、TB-AB和Mtb culture比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(分別為：χ2=6.84，P=0.009；χ2=11.56，P=0.001；χ2=57.27，P<0.001)。T-SPOT.TB(E/C)檢測的特異度分別與ADA、TB-AB和Mtb culture比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(分別為：χ2=14.55，P<0.001；χ2=10.49，P=0.001；χ2=4.18，P=0.04)

四、不同檢驗方法診斷結(jié)核性胸膜炎的評價

在診斷結(jié)核性胸膜炎敏感度方面：T-SPOT.TB(E/C)敏感度(91.67%)高于胸腔積液ADA(70.83%)，高于TB-AB(62.50%)，高于胸腔積液Mtb culture(14.58%)，與ADA、TB-AB、Mtb Culture比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(表4)。

在診斷結(jié)核性胸膜炎特異度方面：T-SPOT.TB(E/C)特異度(91.11%)高于胸腔積液ADA(55.56%)，高于TB-AB(62.22%)，低于胸腔積液Mtb culture(100.00%)，與ADA、TB-AB比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(表4)。

胸腔積液Mtb culture的特異度雖好(100.00%)，但敏感度過低(14.58%)，綜合比較T-SPOT.TB(E/C)無論在敏感度還是特異度等方面都較高。

討 論

1. 結(jié)核性胸膜炎早期診斷的重要性：結(jié)核性胸腔積液是肺外結(jié)核中常見的形式，在結(jié)核病患者中大約有5%會發(fā)生結(jié)核性胸腔積液。盡管部分患者未經(jīng)任何抗結(jié)核治療可以出現(xiàn)病情緩解，但未經(jīng)抗結(jié)核治療的患者中有65%在5年內(nèi)發(fā)生活動性肺結(jié)核或肺外結(jié)核，而且?guī)缀跛薪Y(jié)核性胸腔積液患者可以經(jīng)規(guī)范的抗結(jié)核治療得到治愈[6]。因此早期快速診斷并積極治療對結(jié)核性胸膜炎和肺結(jié)核的控制至關(guān)重要。

2. T-SPOT.TB檢測技術(shù)的優(yōu)越性：以T細胞免疫應(yīng)答為基礎(chǔ)的T-SPOT.TB檢測技術(shù)作為一種新的結(jié)核分枝桿菌感染的快速診斷工具被廣泛應(yīng)用于臨床，具有較高的敏感度和特異度，即使在免疫力低下的人群中，T-SPOT.TB依然能夠維持較高的敏感度[7]。由于兩種特異性結(jié)核分枝桿菌刺激原ESAT-6和CFP-10的使用，使得此方法的敏感度和特異度大幅度增加，目前已成為歐美國家檢測結(jié)核分枝桿菌感染的臨床常規(guī)方法之一。本研究中T-SPOT.TB檢測的SFC在分別以ESAT-6抗原和CFP-10多肽抗原作為刺激物，結(jié)核病組(中位數(shù)分別為35個/106、28個/106)和對照組(中位數(shù)分別為4個/106、4個/106)T-SPOT.TB形成的SFC間存在的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)核病組均顯著高于對照組的SFC數(shù)量，同時結(jié)核病組ESAT-6抗原和CFP-10多肽抗原T-SPOT.TB形成SFC的陽性率(85.42%、75.00%)顯著高于對照組形成SFC的陽性率(6.67%、6.67%)，此結(jié)果提示以結(jié)核分枝桿菌RDI區(qū)編碼蛋白ESAT-6、CFP-10為抗原的T-SPOT.TB檢測在結(jié)核性胸膜炎中有一定的診斷價值。

3. T-SPOT.TB對結(jié)核性胸膜炎診斷的應(yīng)用價值：胸腔積液是全身疾病或胸膜疾病所導(dǎo)致的液體過多滲出或漏出并積蓄在胸膜形成的病理現(xiàn)象。其鑒別是臨床經(jīng)常遇到的難題，且結(jié)核性胸膜炎早期胸腔積液少，不易抽胸腔積液化驗診斷。本研究結(jié)果表明，T-SPOT.TB在結(jié)核病組患者的陽性檢出率(91.67%)遠高于對照組(8.89%)，說明T-SPOT.TB在結(jié)核性胸膜炎鑒別診斷中有較好的性能。Losi等[8]對來源于歐洲國家的41例胸腔積液患者(20例結(jié)核性胸膜炎)的胸腔積液和PBMC進行T-SPOT.TB檢測，胸腔積液的T-SPOT.TB的敏感度和特異度分別為95%、76%，外周血的T-SPOT.TB敏感度和特異度分別為90%、67%。本研究用外周血進行檢測，T-SPOT.TB的敏感度為91.67%，特異度為91.11%，敏感度與Losi等[8]研究結(jié)果接近，特異度高于其研究結(jié)果。本研究表明，T-SPOT.TB進行外周血檢測對結(jié)核性胸膜炎早期診斷有較高的應(yīng)用價值。

4. T-SPOT.TB、ADA、TB-AB、Mtb culture檢測方法的比較：目前結(jié)核性胸膜炎尚缺乏敏感度和特異度高的診斷手段，對結(jié)核性胸膜炎最可靠的診斷依據(jù)是胸腔積液結(jié)核分枝桿菌的檢測和胸膜活檢病理檢查，陽性率分別為：胸腔積液涂片5.8%，胸腔積液培養(yǎng)約30%，胸膜活檢69.9%～82%[9]。本研究結(jié)果顯示，胸腔積液Mtb culture的特異度雖好(100.00%)，但敏感度過低(14.58%)，而且胸腔積液Mtb culture需時較長，影響了其對結(jié)核性胸膜炎的早期診斷。血清結(jié)核抗體檢測雖然快，但特異度不高[10]，檢測結(jié)果受很多因素的影響，當(dāng)體內(nèi)含有交叉抗原時會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；而當(dāng)存在免疫復(fù)合物或抑制性T細胞增多時又可引起假陰性結(jié)果。結(jié)核抗體增高程度與病變性質(zhì)有一定關(guān)聯(lián)，當(dāng)病變處于窗口期或穩(wěn)定狀態(tài)時，檢測結(jié)果會出現(xiàn)陰性可能[11]。對活動性結(jié)核分枝桿菌感染的診斷有一定的缺陷。本研究數(shù)據(jù)顯示，TB-AB檢測的敏感度為62.50%，特異度為62.22%，敏感度和特異度均不高。胸腔積液中ADA檢測目前已被臨床接受作為結(jié)核性胸膜炎的輔助診斷指標，但對其診斷價值意見不一，有文獻報道ADA診斷的敏感度和特異度偏低，敏感度降低的原因可能是炎癥早期或機體免疫功能減退(如感染人類獲得性免疫缺陷病毒)，而特異度降低可能出現(xiàn)在肺炎旁積液和類風(fēng)濕疾病中[12-13]。本研究結(jié)果顯示，胸腔積液ADA的敏感度(70.83%)、特異度(55.56%)、陽性預(yù)測值(62.96%)、陰性預(yù)測值(64.10%)、Youden指數(shù)(0.264)、診斷準確率(63.44%)均低于T-SPOT.TB的敏感度(91.67%)、特異度(91.11%)、 陽性預(yù)測值(91.67%)、陰性預(yù)測值(91.11%)、Youden指數(shù)(0.828)、診斷準確率(94.62%)。

5. ESAT-6和CFP-10兩種抗原應(yīng)用比較：由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群基因RDI區(qū)域編碼的ESAT-6和CFP-10是結(jié)核特異性抗原及T細胞最主要的靶抗原，可以誘導(dǎo)較強的細胞免疫反應(yīng)[14]，ESAT-6從結(jié)核分枝桿菌短期培養(yǎng)濾液中分離出來，經(jīng)純化后獲得，為低相對分子質(zhì)量分泌性蛋白，擁有較強的細胞免疫活性，在抗結(jié)核分枝桿菌感染的免疫記憶應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用。ESAT-6只存在于具有致病性的分枝桿菌中，包括結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌及蘇爾加分枝桿菌、海水分枝桿菌和堪薩斯分枝桿菌等非典型分枝桿菌，在BCG及其他非致病性的分枝桿菌上則ESAT-6缺失。CFP-10與ESAT-6位于同一基因族上，兩者分布相同，都為RDI區(qū)編碼。Hill等[15]報道使用任意單一抗原的敏感度要低于聯(lián)合使用兩種多肽抗原的敏感度，本研究結(jié)果與此相符，以聯(lián)合應(yīng)用ESAT-6和CFP-10的敏感度(91.67%)最高，高于單用ESAT-6的敏感度(85.42%)或單用CFP-10 的敏感度(75.00%)，但聯(lián)用與單用ESAT-6抗原的敏感度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.92，P>0.05)，聯(lián)用與單用CFP-10抗原的敏感度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.8，P<0.05)。單獨應(yīng)用ESAT-6的敏感度(85.42%)高于單獨應(yīng)用CFP-10的敏感度(75.00%)，但兩者敏感度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.64，P>0.05)，總體考慮ESAT-6抗原診斷的敏感度和特異度較高，相對CFP-10多肽抗原有更高的應(yīng)用價值，可能是由于ESAT-6是T細胞最主要的靶抗原之一，含有多個特異性T細胞表位。

T-SPOT.TB也有極少的假陽性和假陰性比例，出現(xiàn)假陽性的原因可能是患者曾經(jīng)有過結(jié)核分枝桿菌潛伏性感染，出現(xiàn)假陰性的原因可能是標本在細胞免疫發(fā)生前獲取，或者少數(shù)免疫系統(tǒng)功能不健全，因此當(dāng)其值接近臨界值時，應(yīng)慎重參考，結(jié)合臨床表現(xiàn)及其他輔助檢查進一步明確診斷。

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(本文編輯：郭萌)

The application value of T-SPOT.TB in the diagnosis of tuberculous pleurisy

CHEN Xi*, LI Xiao-yuan, LI Ling, MENG Ping, ZHANG Ting-jun, ZHAO Hong-mei, LI Yun-peng.

*Department of Tuberculosis, Shenyang Chest Hospital, Shenyang 110044, China

Corresponding author: LI Xiao-yuan, Email:xjg5624@sina.com

Objective To evaluate the clinical application value of Mycobacterium tuberculosis T cell enzyme-linked immunospot tuberculous test (T-SPOT.TB test) in the diagnosis and differential diagnosis of tuberculous pleurisy. Methods Ninety-three patients with pleural effusion who were hospitalized in Shenyang Chest Hospital from August 2012 to June 2013 were enrolled in this study. According to the diagnostic criteria of tuberculous pleurisy in clinical guidelines for the diagnosis and treatment of tuberculosis, 48 patients with tuberculous pleurisy and 45 cases of non-tuberculous pleurisy were divided into study group and control group. The number of T lymphocytes (namely spots forming cells, SFC) to early secretary antigenic target 6 (ESAT-6) and/or culture filtrate protein (CFP-10) sensitive in peripheral blood mononuclear cell (PBMC) of participants were determined by T-SPOT.TB test. The positive rates of SFC in two groups were compared. The results were compared with other related indicators (adenosine deaminase (ADA), serum tuberculosis antibody (TB-AB), and tuberculosis bacterium culture (Mtb culture) of pleural effusion. SPSS 17.0 was used for statistical analysis. Pearson Chi-square test was used to compare rates andPvalue less than 0.05 was considered statistically significant. Results The positive rate of tuberculous pleurisy group (91.67%, 44/48) by T-SPOT.TB test was significantly higher than that of control group (8.89%, 4/45). The difference was statistically significant (χ2=63.73,P<0.05). The sensitivity of T-SPOT.TB test in detection of ESAT-6 and CFP-10 (91.67%, 44/48) was higher than that in detection of ESAT-6 (85.42%, 41/48) or CFP-10 (75.00%, 36/48). The difference had no statistical significance (compared with ESAT-6,χ2=0.92,P>0.05; compared with CFP-10,χ2=4.8,P>0.05). The sensitivities of T-SPOT.TB, ADA detection, TB-AB detection and Mtb culture were 91.67% (44/48), 70.83% (34/48), 62.50% (30/48) and 14.58% (7/48) respectively. The specificities were 91.11% (41/45), 55.56% (25/45), 62.22% (28/45) and 100.00% (45/45). The diagnostic accuracy rates were 94.62% (88/93), 63.44% (59/93), 62.37% (58/93) and 55.91% (52/93). Except the specificity of Mtb culture which was higher than T-SPOT.TB test, the sensitivity and specificity of T-SPOT.TB test were higher than those of other test methods, and the difference was statistically significant (compared with ADA-sensitivityχ2=6.84,P<0.05, specificityχ2=14.55,P<0.05; compared with TB-AB-sensitivityχ2=11.56,P<0.05, specificityχ2=10.49,P<0.05; compared with Mtb culture-specificityχ2=57.27,P<0.05, specificityχ2=4.18，P<0.05). Conclusion T-SPOT.TB test has high sensitivity, specificity and diagnostic accuracy in the diagnosis of tuberculous pleurisy. Therefore, it is worth in the clinical extension and application.

Tuberculosis, pleural； Interferon-gamma release tests； Sensitivity and specificity

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.01.009

110044 沈陽市胸科醫(yī)院結(jié)核科(陳希、李玲、孟萍、張廷軍、趙紅梅、李云鵬)；吉林大學(xué)第一醫(yī)院呼吸科(李曉轅)

李曉轅，Email：xjg5624@sina.com

2014-07-23)