蒲麗君，趙珂，羅勇川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科，四川南充637000

阿托伐他汀對自發(fā)性高血壓大鼠左室肥厚的影響及其可能機(jī)制

蒲麗君，趙珂，羅勇
川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科，四川南充637000

[摘要]目的應(yīng)用阿托伐他汀抑制自發(fā)性高血壓大鼠出現(xiàn)左室肥厚心肌過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）和p21表達(dá)及其改善機(jī)制。方法隨機(jī)將同批次16只具有8周齡的自發(fā)性高血壓大鼠分為阿托伐他汀ATV組與自發(fā)性高血壓SHR組（各8只）；另選取8只同周齡大鼠作為正常血壓WKY組。采用阿托伐他汀對ATV組進(jìn)行灌胃，50 mg/（kg·d）；對SHR組與WKY組進(jìn)行等容量蒸餾水灌胃，測量3組大鼠血壓，5周/次；持續(xù)干預(yù)10周后，對其血壓及血脂水平進(jìn)行觀察與測量，同時計算其心肌肥厚指標(biāo)，并使用RT-PCR、免疫組化觀察PPARγ和p21的表達(dá)。結(jié)果血脂及血壓觀測結(jié)果顯示，SHR組與ATV組無顯著差異，ATV組心肌肥厚指標(biāo)明顯低于SHR組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；ATV組PPARγ和p21的表達(dá)明顯高于SHR組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。心肌組織PPARγ和p21 mRNA的表達(dá)表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)性。結(jié)論阿托伐他汀可自行對自發(fā)性高血壓大鼠心肌細(xì)胞中PPARγ、p21上調(diào)以對細(xì)胞周期進(jìn)行調(diào)節(jié)，對高血壓左室肥厚具有改善作用。

[關(guān)鍵詞]激活受體γ；p21；自發(fā)性高血壓大鼠；左室肥厚；阿托伐他汀

心血管疾病常見病之一高血壓，其心臟彩超顯示心臟由于長期受壓超負(fù)荷下為左心室肥厚，同時左室肥厚也是心臟終末心衰發(fā)展過程的共同基礎(chǔ)，同時也是引發(fā)高血壓患者出現(xiàn)嚴(yán)重心血管疾病的重要危險因素。參與這一病理生理過程的因素較為多樣且復(fù)雜，常規(guī)除去高血壓的影響外，細(xì)胞的增殖與凋亡失衡也與其關(guān)系密切。多種蛋白及基因?qū)?xì)胞的增殖與凋亡進(jìn)行調(diào)控。其中過氧化物酶體增值物激活受體γ（PPARγ）是細(xì)胞分化過程中的重要轉(zhuǎn)錄因子，主要參與脂質(zhì)及糖代謝，并在細(xì)胞增殖凋亡過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，其在高血壓發(fā)展與左室肥厚的關(guān)系探究中具有重要觀察意義。p21可促導(dǎo)細(xì)胞的增殖與分化，其實增殖細(xì)胞周期的負(fù)性調(diào)節(jié)因子。他汀類藥物除具有調(diào)節(jié)血脂的作用外還能夠發(fā)揮心血管保護(hù)效應(yīng)，大量研究表明阿托伐他汀可抑制膠原蛋白的合成，有抗氧化、抗炎的作用，使其可以對高血壓左室肥厚進(jìn)行干預(yù)和影響。但有關(guān)基因PPARγ、p21是否參與其中目前研究較少。該研究于2014年8月12日—2014 年10月14日以SHR為實驗?zāi)Ｐ停接懓⑼蟹ニ?、高血壓左室肥厚以及PPARγ、p21之間的聯(lián)系和影響。

1　材料與方法

1.1實驗動物與分組

實驗開始于2014年8月12日，歷時10周到2014年10月14日結(jié)束。24只大鼠均于重慶藤清生物技術(shù)有限公司購入，其中16只同批次的SHR、ATV以及8只WKY大鼠，均為體重在120～150 g的8周齡雄性大鼠，清潔級。將16只8周齡自發(fā)性高血壓大鼠隨機(jī)分為兩組各8只，分別為阿托伐他汀組(ATV組)與自發(fā)性高血壓對照組（SHR組）；另選取8只同周齡大鼠作為正常血壓WKY組。對ATV組進(jìn)行阿托伐他汀(輝瑞制藥有限公司)灌胃，50 mg/（kg·d）；對SHR組與WKY組進(jìn)行等容量蒸餾水灌胃，測量3組大鼠血壓，5周/次；持續(xù)干預(yù)10周后，每隔5周測1次血壓。10周后,觀察大鼠血壓、血脂水平，計算心肌肥厚指標(biāo)，采用免疫組化及RT-PCR觀察PPARγ和p21的表達(dá)。

1.2血壓測定

采用尾袖法無創(chuàng)式測大鼠血壓，從第八周齡開始，每5周測血壓1次。

1.3左室質(zhì)量指數(shù)

10周后大鼠空腹稱取體重（BW），使用2.5%戊巴比妥鈉進(jìn)行注射麻醉，劑量50 mg/kg，腹主動脈抽取2 ml血液進(jìn)行檢測，分別檢測TC、TG、HDL-C、LDL-C水平。將大鼠心臟取出吸干并稱其重量（HW），并分離出左心室（包括室間隔），沖洗及吸干后稱取左心重(LVW)；計算心臟重量與體重的比值（HW/BW）以及左心室重點與體重的比值（LVW/BW），并以此作為判斷心肌肥厚的指標(biāo)。自心尖部取心肌組織約4 mm放入10%甲醛內(nèi)固定，用于制備組織蠟塊。剩余左心室組織保存于-80℃冰箱內(nèi)用于提取RNA。

1.4血脂測定

將采集的腹主動脈血離心分離得到血清，采用Hitachi全自動化學(xué)分析儀測定血清中TC、TG、LDL-C及HDL-C的水平。

1.5心肌組織形態(tài)學(xué)檢測

將石蠟包埋的心肌組織用石蠟冰凍切片機(jī)（LEICA SM 2500E）切片，厚度為4μm，HE染色，電子顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞形態(tài)。

1.6心肌細(xì)胞p21、PPARγ的分布

嚴(yán)格按照SABC試劑盒說明書進(jìn)行操作。使用由美國Santa Cruz公司生產(chǎn)的鼠抗鼠p21單克隆抗體以及鼠抗鼠PPARγ單克隆抗體作為一抗；由中國武漢博士德生物工程公司生產(chǎn)的羊抗鼠IgG作為二抗。光學(xué)顯微鏡下顯示，心肌細(xì)胞正常狀態(tài)下呈藍(lán)色細(xì)胞核，p21、PPARγ的表達(dá)呈棕色（+）。每只大鼠均隨機(jī)抽取5張切片在×400的高倍鏡下觀察陽性心肌細(xì)胞所占比例，計算其蛋白的表達(dá)率。

1.7心肌組織p21、PPARγ mRNA表達(dá)水平

取100 mg心肌細(xì)胞標(biāo)本，采用TRIzol法對標(biāo)本進(jìn)行總RNA提取，并使用UV-2500紫外線分光光度計算RNA純度，取2 μg總RNA根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),制備cDNA ,作為PCR反應(yīng)的模板。使用中國上海生工生物工程公司合成的引物具體見表1。在94℃溫度下預(yù)變5 min，后進(jìn)入30個循環(huán)。預(yù)變過程：預(yù)變30 s后溫度降至56℃退火，30 s，溫度升至72℃延伸30 s，最后溫度定為74℃延伸5 min。使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳PCR終產(chǎn)物8 μL，時間約40 min，采取凝膠成像儀對條帶的灰度值進(jìn)行分析，計算基因、GAPDH的灰度比作為mRNA的表達(dá)相對量。

表1　目的基因及內(nèi)參照GAPDH基因的引物序列

表3　ATV對大鼠血脂及心肌肥厚指標(biāo)的影響（±s）

表3　ATV對大鼠血脂及心肌肥厚指標(biāo)的影響（±s）

注：與WKY組比較，aP<0.05；與SHR組比較，bP<0.05。

WKY（n=8）SHR（n=8）ATV（n=8）組別0.53±0.09 (0.31±0.07)a(0.35±0.11)aTG (mmol/L) 2.44±0.32 (1.36±0.18)a(1.37±0.11)aTC (mmol/L) 0.91±0.20 (0.41±0.11)a(0.39±0.06)aLDL-C (mmol/L) 1.29±0.14 (0.83±0.07)a(0.82±0.07)aHDL-C (mmol/L) 3.36±0.21 (4.48±0.47)a(3.90±0.40)ab2.82±0.18 (3.77±0.47)a(3.26±0.29)abHW/BW (mg/g) LVW/BW (mg/g)

1.8統(tǒng)計方法

采用統(tǒng)計軟件包SPSS 17.0對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間變量的比較采用單因素方差法分析，以P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用Spearman相關(guān)分析PPARγ和p21 mRNA的表達(dá)與心肌肥厚指標(biāo)的相關(guān)性。

2　結(jié)果

2.1阿托伐他汀藥物對血壓、血脂水平的影響

ATV組和SHR組的血壓均顯著高于WKY組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），而ATV組和SHR組兩組間的血壓，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表2。10周后，ATV、SHR兩組血脂水平均明顯低于WKY組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），在阿托伐他汀干預(yù)后ATV組血脂水平與SHR組相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表3。

表2　各組大鼠血壓值[mmHg，（±s）]

表2　各組大鼠血壓值[mmHg，（±s）]

注：與WKY組比較，aP<0.01。

WKY（n=8）SHR（n=8）ATV（n=8）組別收縮壓舒張壓收縮壓舒張壓收縮壓舒張壓血壓141.0±16.0 100.5±11.2 （162.0±32.6）a（122.4±15.9）a（160.8±31.9）a（121.0±24.6）a8 weeks 141.7±19.2 99.4±10.3 （178.1±24.7）a（131.4±22.1）a（175.2±30.3）a（127.9±31.2）a142.0±15.9 96.9±10.5 （182.6±26.2）a（135.8±21.2）a（176.5±27.6）a（134.6±20.8）a13 weeks　18 weeks

2.2阿托伐他汀藥品對心肌肥厚指數(shù)的影響

對比發(fā)現(xiàn)，SHR組大鼠HW/BW、LVW/BW明顯高于WKY組大鼠；ATV組上述指標(biāo)均降低且與SHR組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但并未降至正常水平，與WKY組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），具體結(jié)果見表3。

2.3心肌組織的光鏡下觀察

WKY組：形態(tài)正常，排列整齊，無明顯肥大；SHR組：形態(tài)異常、排列紊亂，明顯肥大，部分心肌纖維出現(xiàn)斷裂；ATV組：介于WKY、SHR兩組之間，形態(tài)及排列較SHR組相比較為整齊規(guī)則，心肌纖維斷裂較少，細(xì)胞肥大較少。見圖1。

圖1　心肌組織病理形態(tài)學(xué)改變（HE染色，×400）A:WKY組；B:SHR組；C:ATV組。

2.4免疫組化檢測結(jié)果

結(jié)果顯示：p21、PPARγ蛋白均在大鼠心肌細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，SHR組和ATV組PPARγ和p21蛋白的（+）表達(dá)率均低于WKY組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；ATV干預(yù)后，PPARγ和p21的（+）表達(dá)率明顯上升，ATV組高于SHR組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖2、圖3。

圖2　免疫組化觀察心肌細(xì)胞PPARγ蛋白表達(dá)（×400）A:WKY組；B:SHR組；C: ATV組。表達(dá)（+）的心肌細(xì)胞核呈棕黃色（如白色箭頭所示），表達(dá)（-）的心肌細(xì)胞核呈藍(lán)色（如黑色箭頭所示）

圖3　免疫組化觀察心肌細(xì)胞p21蛋白表達(dá)影響（×400）A:WKY組；B:SHR組；C:ATV組

2.5RT-PCR結(jié)果

結(jié)果顯示：SHR、ATV兩組大鼠p21、PPARγ mRNA相對表達(dá)量均低于WKT組大鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；ATV干預(yù)后，p21、PPARγ mRNA的表達(dá)均上升，ATV組高于SHR組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖4、表4。

A組　B組C組Marker A組　B組C組Marker圖4 PPARγ、p21的電泳圖A:WKY組；B:SHR組；C:ATV

表4　阿托伐他汀對PPARγ、p21mRNA表達(dá)的影響（±s）

表4　阿托伐他汀對PPARγ、p21mRNA表達(dá)的影響（±s）

注：與WKY組相比較aP<0.05；與SHR組相比較*P<0.05。

PPARγ P21基因1.26±0.03 1.12±0.05 WKY組（1.02±0.03）a（0.81±0.08）a（1.12±0.04）ab（0.98±0.07）abSHR組　ATV組

2.6p21、PPARγ mRNA與心肌肥厚相關(guān)性

p21 mRNA的表達(dá)與HW/BW、LVW/BW均呈高度負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（r=-0.708、-0.667，P<0.0001）；PPARγ mRNA的表達(dá)與HW/BW、LVW/BW同樣均呈高度負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（r=-0.859、-0.902，P<0.0001）。

3　討論

高血壓可使心肌肥厚、心室重構(gòu)，是對心臟損傷的表現(xiàn)之一，也是引起心血管事件的獨立危險因素[1]。研究表明，他汀類藥物除降脂外還可干預(yù)細(xì)胞周期，以此對多種腫瘤細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞進(jìn)行增殖與凋亡調(diào)節(jié)，但現(xiàn)如今對心肌細(xì)胞增殖與凋亡是否也通過干預(yù)細(xì)胞周期改善心室重構(gòu)目前尚不清楚。

近年有研究表明，在心肌肥厚的發(fā)病機(jī)制中，p21參與其中并起到重要作用。在國外學(xué)者的研究中表明，左心室肥厚可使p21蛋白表達(dá)能力下降，引起心肌細(xì)胞肥大[4]。且還有學(xué)者對阿托伐他汀的研究中發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物可通過下調(diào)細(xì)胞周期蛋白相關(guān)的抑制蛋白促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白的表，使細(xì)胞衰老過程減慢。也有研究表明，他汀類藥物主要通過對p21、p27的調(diào)節(jié)實現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的過程[5]。該實驗結(jié)果表明，p21表達(dá)降低可介導(dǎo)心肌細(xì)胞的肥大、促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖，從而參與心肌肥厚的發(fā)生。

有研究表明[6]PPARγ的活化可能與心肌細(xì)胞肥大的負(fù)性調(diào)節(jié)有關(guān),可抑制心肌細(xì)胞增殖，進(jìn)而改善心室重構(gòu)。在過去的研究中人們發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀對大鼠心肌中PPARα、PPARβ、PPARγ的表達(dá)有促進(jìn)作用，明顯減少了左心室壁的厚度，逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)[7]。也有學(xué)者對壓力負(fù)荷誘導(dǎo)心肌肥厚的大鼠進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀可使左心室壁厚度減小，上調(diào)PPARγ蛋白的表達(dá)。因此, PPARγ的激活應(yīng)用阿托伐他汀改善心肌肥大的作用有極大關(guān)系。在該實驗中，PPARγ表達(dá)上調(diào)可改善心肌肥厚癥狀，也證實了PPARγ表達(dá)可對心肌肥厚起到負(fù)調(diào)控作用，與既往研究基本相符[8]。

在心血管方面，Li M等[ 9]在體外的研究結(jié)果表明，PPARγ活化可通過誘導(dǎo)血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1)的表達(dá)及上調(diào)p21的表達(dá)來抑制大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞的增殖。Zhang D等[ 10]在體內(nèi)實驗中也同樣表明，肺動脈高壓大鼠PPARγ的激活可明顯降低右心室的收縮壓，抑制右心室肥厚，部分抑制肺血管的重構(gòu)，其機(jī)制可能與上調(diào)HO-1 and p21的表達(dá)有關(guān)。通過該研究可推測，阿托伐他汀可激活心肌PPARγ進(jìn)行表達(dá)，間接影響p21表達(dá)上調(diào)，在兩者共同作用下抑制了心肌肥大、心室重構(gòu)等癥狀，而具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

該研究中還發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀并不影響血脂水平，結(jié)果提示其對心臟的改善作用與血壓無關(guān)，但本文研究樣本較小，可能影響此結(jié)果。

綜上，阿托伐他汀可自行對自發(fā)性高血壓大鼠心肌細(xì)胞中PPARγ、p21上調(diào)以對細(xì)胞周期進(jìn)行調(diào)節(jié)，對高血壓左室肥厚具有改善作用。

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Effects and its Underlying Mechanism of Atorvastatin on Spontaneously Hypertensive rats with Left Ventricular Hypertrophy

PU Li-jun, ZHAO Ke, LUO Yong
Department of Cardiology, Affiliated Hospital of Chuanbei Medical College, Nanchong, Sichuan Province, 637000 China

[Abstract]Objective To investigate the effect of atorvastatin on peroxisome proliferator-activated receptor-γ(PPARγ) and p21 expression of hypertrophic myocardium in spontaneously hypertensive rats and discuss the underlying mechanisms which atorvastatin improves left ventricular hypertrophy. Methods 16 eight -week -old male spontaneously hypertensive rats were randomly divided into atorvastatin group (ATV group, n=8) and spontaneously hypertensive rats group (SHR group, n=8). Age–matched Wistar - kyoto rats were served as normal blood pressure control group (WKY group, n=8). In ATV group, atorvastatin was given at a dose of 50 mg/(kg·d) perday by gastric gavage, and in SHR and WKY group, the same volume of distilled water by gavage. Measure the blood pressure every five weeks. Ten weeks later, blood pressure and plasma lipid levels were measured. The ratio of the heart weight to body weight (HW/BW) and the left ventricular weight to body weight (LVW/BW) were calculated as myocardial hypertrophy index. The expressions of PPARγ and p21 were investigated by the method of immunohistochemistry analysis and RT-PCR. Results There was not much difference of plasma lipid levels and blood pressure between ATV and SHR group. Compared with SHR group, Myocardial hypertrophy index decreased significantly in ATV group (P<0.01). The myocardium PPARγ and p21 expression increased significantly (P<0.01). The association between expression of PPARγmRNA and p21mRNA in cardiomyocytes and myocardial hypertrophy index are negative correlation. Conclusion Atorvastatin increases myocardium PPARγ and P21 expression and improves left ventricular hypertrophy in spontaneously hypertensive rats.

[Key words]Peroxisome proliferator-activated receptor-γ; P21; Spontaneously hypertensive rats; Left ventricular hypertrophy; Atorvastatin

[中圖分類號]R544.1

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1674-0742（2015）07（c）－0012-04

[基金項目]川北醫(yī)學(xué)院苗圃基金（MP-ZK-24）

[作者簡介]蒲麗君（1978.4-），女，四川南充人,碩士，主治醫(yī)師，研究方向:高血壓病心衰的發(fā)病機(jī)制。

[通訊作者]羅勇（1966.2-），男，四川南充人，碩士研究生，教授，主要從事心血管疾病臨床與基礎(chǔ)研究。

收稿日期：（2015-04-25）