賴(lài)杰仁 楊毅生

（1九江市中醫(yī)醫(yī)院，江西 九江 332000；2江西省食品藥品檢驗(yàn)所，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，南昌 330029）

參龍散結(jié)丸（濃縮丸）系九江市中醫(yī)醫(yī)院自主研發(fā)的國(guó)家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)專(zhuān)科腫瘤科的特色醫(yī)院制劑，處方源于《太平惠民和劑局方》之四君子湯，依臨床實(shí)踐精心加減而成。全方由太子參、白術(shù)、陳皮、天龍、菝葜、夏枯草、靈芝等10余味中藥組成，具有益氣健脾，軟堅(jiān)散結(jié)，清熱解毒等功效，臨床應(yīng)用于證屬脾虛濕困型消化系統(tǒng)腫瘤10余年，使用安全，療效顯著。本文采用薄層色譜法（TLC）鑒別方中白術(shù)、菝葜和夏枯草3味藥材組分，建立處方中陳皮藥材有效成分橙皮苷的含量測(cè)定方法，為參龍散結(jié)丸的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

HS-2060A超聲清洗器（天津恒高技術(shù)發(fā)展公司），2F-Ⅰ型三用紫外分析儀（上海顧村電子儀器廠），SHIMADZULC-2010AHT高效液相色譜儀，紫外可變波長(zhǎng)檢測(cè)器UV-2550，METTLER TOLEDO十萬(wàn)分之一天平。

1.2 試藥

白術(shù)對(duì)照藥材、菝葜對(duì)照藥材、夏枯草對(duì)照藥材、橙皮苷對(duì)照品（含量測(cè)定用，批號(hào)：110721-200512，含量為95.3%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；參龍散結(jié)丸（批號(hào)：20121001，20121002，20121003，20121004，20121005，20121101，20121102，20121103，20121104，20121105，九江市中醫(yī)醫(yī)院），甲醇（流動(dòng)相）為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 定性鑒別

2.1 白術(shù)的薄層色譜鑒別

取本品10 g，研細(xì)，乙醚30 mL，浸漬過(guò)夜，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾渣備用，濾液蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL使溶解，作為供試品溶液。另取白術(shù)對(duì)照藥材1 g同法制成對(duì)照藥材溶液。按處方配比，取除白術(shù)外各藥材，按制法工藝制備缺白術(shù)陰性樣品，按上述供試品溶液同法制成缺白術(shù)陰性樣品溶液。照《中國(guó)藥典》2010年版一部（附錄ⅣB）“薄層色譜法”試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液、缺白術(shù)陰性樣品溶液和對(duì)照藥材溶液各5～10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯（7∶3）為展開(kāi)劑，預(yù)飽和 15 min 后展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%對(duì)二甲氨基苯甲醛的10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。色譜斑點(diǎn)分離清晰，層析效果好。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的斑點(diǎn)。陰性對(duì)照樣品對(duì)鑒別無(wú)干擾。

2.2 菝葜的薄層色譜鑒別

取白術(shù)鑒別備用濾渣，揮干乙醚，加乙醇50 mL，加熱回流30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，加2 mol/L鹽酸溶液 30 mL，加熱回流 1 h，迅速冷卻，用乙醚振搖提取 2次，每次 20 mL，合并乙醚液，用水20 mL洗滌，乙醚液用鋪有適量無(wú)水硫酸鈉的濾紙濾過(guò)，濾液揮干乙醚，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液。另取菝葜對(duì)照藥材5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。按處方配比，取除菝葜外各藥材，按制法工藝制備缺菝葜陰性樣品，按上述供試品溶液同法制成缺菝葜陰性樣品溶液。照《中國(guó)藥典》2010年版一部（附錄ⅣB）“薄層色譜法”試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液、缺菝葜陰性樣品溶液和對(duì)照品溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯（4∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%磷鉬酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。色譜斑點(diǎn)分離清晰，層析效果好。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的斑點(diǎn)。陰性對(duì)照樣品對(duì)鑒別無(wú)干擾。

2.3 夏枯草的薄層色譜鑒別

取白術(shù)鑒別備用濾渣，揮干乙醚，加正丁醇40 mL，加熱回流1 h，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取夏枯草對(duì)照藥材，同法制成對(duì)照藥材溶液。按處方配比，取除夏枯草外各藥材，按制法工藝制備缺夏枯草陰性樣品，按上述供試品溶液同法制成缺夏枯草陰性樣品溶液。照《中國(guó)藥典》2010年版一部（附錄ⅣB）“薄層色譜法”試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液、陰性對(duì)照樣品溶液和對(duì)照藥材溶液10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸（4∶4∶0.4）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以 2%三氯化鐵乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的斑點(diǎn)。陰性對(duì)照樣品對(duì)鑒別無(wú)干擾。

3 橙皮苷的含量測(cè)定

3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-乙酸-水（35∶4∶61）為流動(dòng)相；柱溫為 30 ℃，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為283 nm。理論板數(shù)按橙皮苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

3.2 溶液的制備

3.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取橙皮苷對(duì)照品11.63 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得對(duì)照品母液。精密量取對(duì)照品母液5 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。

3.2.2 供試品溶液 本品適量，研細(xì)，取約2 g，精密稱(chēng)定，置索式提取器中，加石油醚（60～ 90℃）85 mL，加熱回流 2～ 3 h，棄去石油醚，藥渣揮干，加甲醇85 mL，再加熱回流至提取液無(wú)色，放冷，濾過(guò)，濾液置100 mL量瓶中，用少量甲醇分?jǐn)?shù)次洗滌容器，洗液濾入同一量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

3.2.3 陰性樣品溶液 按處方配比，取除陳皮外各藥材，按制法工藝制備缺陳皮陰性樣品，同供試品溶液制備方法，制得缺陳皮陰性樣品溶液。

3.3 專(zhuān)屬性考察

分別精密吸取上述供試品溶液、對(duì)照品溶液和陰性樣品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果顯示橙皮苷峰形良好，供試品溶液在與對(duì)照品溶液相應(yīng)位置上色譜峰一致，且陰性樣品對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

3.4 線(xiàn)性關(guān)系考察

分別精密吸取上述對(duì)照品溶液 2，5，10 μL，對(duì)照品母液 3，5 μL，注入液相色譜儀中，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定對(duì)照品峰面積，以進(jìn)樣量與峰面積進(jìn)行回歸處理，回歸方程為：

r=0.999 9，橙皮苷對(duì)照品進(jìn)樣量在0.044 34～1.108 5 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

3.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液 10 μL，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定橙皮苷峰面積，橙皮苷峰面積的RSD為0.48%。

3.6 重復(fù)性試驗(yàn)

重量差異項(xiàng)下本品（批號(hào)：20121102）適量，研細(xì)，取約 2 g，共 6份，精密稱(chēng)定，照“3.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，橙皮苷的平均含量為1.320 8 mg/g，RSD為1.21%，方法重現(xiàn)性良好。

3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別在 0，1，3，5，7，9，12，24 h，精密吸取照“3.2.2”項(xiàng)下制備的供試品（批號(hào)：20121102）溶液10 μL，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，橙皮苷峰面積值的RSD為0.61%，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.8 加樣回收率試驗(yàn)

重量差異項(xiàng)下本品（批號(hào)：20121102，橙皮苷含量為1.320 8 mg/g）適量，研細(xì)，取6份，每份約1 g，精密稱(chēng)定，置于索式提取器中，分別精密加入含橙皮苷對(duì)照品的甲醇混合溶液（濃度：0.233 1 mg/mL）5 mL，照“3.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率（表1）。樣品中橙皮苷平均回收率為96.88%，RSD值為1.49%。

3.9 耐用性試驗(yàn)

圖1 HPLC圖

重量差異項(xiàng)下本品（批號(hào)：20121102，20121103），研細(xì)，取約 2 g，精密稱(chēng)定，照“3.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，分別用 A：YMC-Pack ODS-A C18（150 mm ×4.6 mm，5 μm）、B：Phenomenex C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）、C：Agilent C18（150 mm × 4.6 mm，5 μm）3 種品牌的色譜柱，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定橙皮苷含量，RSD值低于1.0%（表2）。

表1 加樣回收率試驗(yàn)

3.10 樣品測(cè)定

重量差異項(xiàng)下本品10批次，研細(xì)，各取約2 g，精密稱(chēng)定，照“3.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算橙皮苷含量（表3），橙皮苷含量在1.246 0～ 1.300 3 mg/g。根據(jù)表3結(jié)果，考慮藥材來(lái)源、配制操作等因素的差異影響，設(shè)以平均含量（1.266 2 mg/g）的 80%為參龍散結(jié)丸橙皮苷含量的指標(biāo)。即規(guī)定：本品每1 g含陳皮以橙皮苷（C28H34O15）計(jì)，不得少于1.0 mg。

表2 不同色譜柱測(cè)定橙皮苷的含量

表3 參龍散結(jié)丸中橙皮苷含量

4 討論

4.1 薄層色譜定性鑒別實(shí)驗(yàn)研究中，分別優(yōu)化了供試品與對(duì)照品的點(diǎn)樣量，比較了不同廠家的預(yù)制薄層板與自制薄層板展開(kāi)情況，考察了不同溫度、不同濕度條件下的展開(kāi)情況，充分驗(yàn)證了薄層色譜鑒別方法的耐用性。

4.2 橙皮苷含量測(cè)定方法學(xué)研究中，分別比較了以甲醇-乙酸-水（35∶4∶61）、甲醇-0.1%磷酸為流動(dòng)相，對(duì)橙皮苷的分離情況及峰形影響，結(jié)果以甲醇-乙酸-水（35∶4∶61）為流動(dòng)相的分離情況及峰形最佳，故采用其作為測(cè)定方法的流動(dòng)相。

4.3 在含量測(cè)定供試品溶液的制備方法實(shí)驗(yàn)中，分別考察了加熱回流、超聲提取和索氏回流提取等3種提取方式，結(jié)果顯示，樣品中橙皮苷以索氏提取最充分，故采用索氏提?。环謩e選用50%甲醇、95%乙醇、甲醇為提取溶劑，考察提取溶劑對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，結(jié)果表明，用甲醇作為提取溶劑最滿(mǎn)意，所以選擇甲醇為提取溶劑；分別選擇索氏回流提取2，3，5 h，考察提取時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，結(jié)果顯示，索氏提取回流3 h索氏管中提取液已近無(wú)色，故選定加熱回流至提取液無(wú)色。

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