陳齊勇 梁清 林煜 劉泊齡 李照輝

【摘 要】目的：研究體外雷奈酸鍶對(duì)鈦（Ti）顆粒刺激單核/巨噬細(xì)胞分泌溶骨因子及其膜上RANK表達(dá)的影響，探討雷奈酸鍶預(yù)防人工關(guān)節(jié)假體周圍無菌性松動(dòng)的可能性。方法：體外培養(yǎng)單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞RAW264.7，制備Ti顆粒，并采用MTT法檢測(cè)繪制RAW264.7細(xì)胞增殖曲線，尋找雷奈酸鍶最佳干預(yù)濃度。將RAW264.7分為3組：Ti微粒組（體積分?jǐn)?shù)為0.1%的含Ti微粒+質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清DMEM培養(yǎng)基）、Ti+雷奈酸鍶組（體積分?jǐn)?shù)為0.1%的含Ti微粒+最佳濃度雷奈酸鍶+含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清DMEM培養(yǎng)基）和對(duì)照組（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清DMEM常規(guī)培養(yǎng)基）。采用ELISA法檢測(cè)各組培養(yǎng)液白細(xì)胞介素-1（IL-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）濃度。采用實(shí)時(shí)熒光定量SYBR GREEN法檢測(cè)RANK mRNA表達(dá)。結(jié)果：Ti微粒組及Ti+雷奈酸鍶組的細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1、TNF-α的含量及RAW264.7細(xì)胞RANK mRNA的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組（P < 0.05）。而Ti+雷奈酸鍶組的IL-1、TNF-α的含量及RAW264.7細(xì)胞RANK mRNA的表達(dá)量明顯低于Ti微粒組（P < 0.05）。

結(jié)論：Ti顆粒能刺激單核/巨噬細(xì)胞分泌IL-1、TNF-α，并能促進(jìn)單核/巨噬細(xì)胞表達(dá)RANK。雷奈酸鍶能明顯抑制Ti顆粒誘導(dǎo)單核細(xì)胞分泌IL-1、TNF-α，以及抑制單核/巨噬細(xì)胞表達(dá)RANK。

【關(guān)鍵詞】 雷奈酸鍶；鈦顆粒；單核細(xì)胞；骨溶解；溶骨因子；RANK

doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2015.05.001

【ABSTRACT】Objective：To study the effects of strontium ranelate in vitro on titanium（Ti）particles stimulating mononuclear macrophage to secrete osteolysis factor and its RANK expression in order to probe the possibility of strontium ranelate to prevent periprosthetic aseptic loosening.Methods：Cultured in vitro mononuclear macrophage leukemia cells RAW264.7，prepared Ti particles，and detected and drew the cell proliferation curve of RAW264.7 with MTT method，to look for the best intervention concentration of strontium ranelate.RAW264.7 were divided into 3 groups：a Ti group（Ti particles with the volume ratio of 0.1% + 10% FBS DMEM），a Ti + strontium ranelate group（Ti particles with the volume ratio of 0.1% + strontium ranelate with best concentration + 10% FBS DMEM）and a control group（10% FBS DMEM）.The ELISA method was used to detect the concentration of interleukin-1（IL-1）and tumor necrosis factor-α（TNF-α）in each culture solution.Detected the expression of RANK mRNA with the real-time fluorescence quantitative SYBR GREEN method.Results：The content of IL-1 and TNF-α and the expression of RANK mRNA of RAW264.7 cells in the cell culture fluid of the Ti group and the Ti + strontium ranelate group were significantly higher than those in the control group（P < 0.05）.While the content of IL-1 and TNF-α and the expression of RANK mRNA of RAW264.7 cells in the cell culture fluid of the Ti + strontium ranelate group were significantly lower than those in the Ti group，the difference between them being statistically significant （P <0.05）.Conclusion：Ti particles can stimulate mononuclear macrophage to secrete IL-1 and TNF-α and its RANK expression.Strontium ranelate can obviously inhibit Ti particles to secrete IL-1，TNF-α and the expression of RANK.

【Keywords】 strontium ranelate；titanium particles；mononuclear cells；osteolysis；osteolysis factor；RANK

人工關(guān)節(jié)置換術(shù)是治療包括髖、膝關(guān)節(jié)等嚴(yán)重的關(guān)節(jié)終末期疾病的重要手段，而人工假體周圍骨溶解引起的假體無菌性松動(dòng)仍然是影響人工關(guān)節(jié)置換術(shù)遠(yuǎn)期療效的主要原因[1]。目前認(rèn)為，假體使用中產(chǎn)生的磨屑顆粒與假體周圍的組織、細(xì)胞相互作用，引發(fā)一系列生物反應(yīng)，單核/巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子，活化破骨細(xì)胞導(dǎo)致骨溶解，引起假體松動(dòng)[2-5]。單核/巨噬細(xì)胞膜上的核因子κB受體活化因子（receptor activator of nuclear factor kappa B，RANK）具有調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化、成熟和功能等重要作用[6-7]。雷奈酸鍶已被證實(shí)能抑制破骨細(xì)胞活躍導(dǎo)致的骨吸收[8]，故可能可以抑制鈦（Ti）顆粒引發(fā)的骨溶解。本文擬通過體外實(shí)驗(yàn)研究雷奈酸鍶對(duì)Ti顆粒誘導(dǎo)單核細(xì)胞分泌炎癥因子及RANK表達(dá)的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞RAW264.7（中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心），雷奈酸鍶（Servier公司），Ti微粒[北京有色金屬公司，平均直徑（0.91±0.65） μm]，白細(xì)胞介素-1（IL-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒（上海西唐公司）。

2 方 法

2.1 Ti微粒的制備與處理 Ti顆粒300 ℃高溫烘培6 h，取每100 mg Ti顆粒懸浮于25 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%的乙醇中，水平搖床200 r·min-1振蕩24 h，離心后更換質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%的乙醇繼續(xù)振蕩24 h，PBS洗滌3次，紫外線下干燥后備用，內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒檢測(cè)顯示顆粒黏附內(nèi)毒素濃度< 0.10 EU·mL-1，可排除內(nèi)毒素對(duì)細(xì)胞的影響。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的硝酸和0.1 N的氫氧化鈉反復(fù)清洗后，將Ti微粒置于磷酸緩沖液（DPBS）中配制成體積分?jǐn)?shù)為0.1%的混懸液并經(jīng)高溫消毒備用。體積分?jǐn)?shù)每毫升0.1%的Ti微?；鞈乙杭s含4.5×107微粒，實(shí)驗(yàn)加樣前用超聲磁力震蕩器震蕩10 min，消除微粒粘連。

2.2 雷奈酸鍶對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的影響 取RAW264.7以104·mL-1接種于96孔板中，培養(yǎng)過夜后，棄去舊培養(yǎng)液，分別加入含0，0.078，0.156，0.3125，0.625，1.25，2.5，5，10 mg·mL-1的培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)8孔，培養(yǎng)72 h，每孔加入20 μL四唑鹽液（5 g·L-1），37 ℃孵育4 h后吸去上清液，加入DMSO液體每孔150 μL，在搖床上振蕩10 min，用酶標(biāo)儀選擇490 nm波長測(cè)定各孔吸光度值（A），其值與細(xì)胞數(shù)量成正比。比較不同濃度雷奈酸鍶對(duì)RAW264.7增殖的影響，并找出最佳的干預(yù)RAW264.7的藥物濃度。

2.3 雷奈酸鍶干預(yù) 將單核/巨噬細(xì)胞以1×106個(gè)/

孔密度接種于6孔板，將其放入孵箱過夜。在加入金屬離子前，酞酚藍(lán)檢測(cè)6孔板中單核/巨噬細(xì)胞活性 > 98%。分為3組：Ti微粒組（體積分?jǐn)?shù)為0.1%的含Ti微粒+質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清DMEM培養(yǎng)基）、Ti+雷奈酸鍶組（體積分?jǐn)?shù)為0.1%的含Ti微粒+最佳濃度雷奈酸鍶+含質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基）和對(duì)照組（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清DMEM常規(guī)培養(yǎng)基）。3組均連續(xù)培養(yǎng)48 h。

2.4 ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)液IL-1、TNF-α濃度 干預(yù)培養(yǎng)48 h取培養(yǎng)液。每孔分別加入樣品、樣品稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)品各100 μL，37 ℃溫育30 min后，先后加入酶標(biāo)偶合液、底物、終止液50 μL，于450 nm波長讀取OD值。樣品、標(biāo)準(zhǔn)品均設(shè)復(fù)孔，每個(gè)樣本重復(fù)一次。

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量SYBR GREEN法檢測(cè)RANK mRNA表達(dá) 培養(yǎng)48 h，采用Trizol法提取總RNA，抽提后的RNA加入溴芬蘭進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果通過凝膠圖像分析系統(tǒng)對(duì)條帶進(jìn)行分析；檢驗(yàn)RNA無降解，測(cè)定RNA的吸光度值，計(jì)算出RNA的濃度，再根據(jù)濃度計(jì)算出體積后取RNA 500 ng按試劑盒步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄后在ABI7500上按照試劑說明進(jìn)行mRNA擴(kuò)增，得到擴(kuò)增曲線與CT值。設(shè)復(fù)孔取均值，每個(gè)樣本每個(gè)指標(biāo)重復(fù)3次。使用7500 system SDS軟件計(jì)算數(shù)據(jù)，進(jìn)行組間相對(duì)量的比較。所用引物序列見表1。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，多組之間比較先采用F檢驗(yàn)，而后進(jìn)行q檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 不同濃度雷奈酸鍶組促RAW264.7細(xì)胞增殖情況 通過MTT法檢測(cè)繪制RAW264.7細(xì)胞增殖曲線圖發(fā)現(xiàn)，隨著雷奈酸鍶的濃度增加，細(xì)胞增殖速度逐漸上升，當(dāng)濃度達(dá)到1.25 mg·mL-1時(shí)達(dá)到頂峰，之后細(xì)胞增殖明顯降低。因此確定

1.25 mg·mL-1雷奈酸鍶為干預(yù)最佳濃度。見圖1。

3.2 各組培養(yǎng)液中IL-1、TNF-α表達(dá)結(jié)果 Ti微粒組培養(yǎng)液中IL-1、TNF-α的表達(dá)明顯高于Ti+雷奈酸鍶組，而以上兩組細(xì)胞液中的IL-1、TNF-α含量均高于對(duì)照組，各組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表2。

3.3 干預(yù)48 h后各組RAW264.7細(xì)胞RANK mRNA

基因表達(dá)結(jié)果 熒光定量PCR結(jié)果表明，Ti微粒組及Ti+雷奈酸鍶組的RANK的RNA表達(dá)均高于未含Ti顆粒的對(duì)照組，且Ti微粒組的RANK表達(dá)高于Ti+雷奈酸鍶組，各組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。該實(shí)驗(yàn)按照同樣方法重復(fù)4次，采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析比較Ti微粒組及Ti+雷奈酸鍶組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。見表3、圖2、圖3。

4 討 論

人工關(guān)節(jié)置換術(shù)已普遍運(yùn)用于臨床，但假體松動(dòng)的問題始終存在。目前認(rèn)為，假體在使用過程中的相對(duì)運(yùn)動(dòng)、老化、電解等產(chǎn)生磨屑顆粒，這些顆粒作為異物被單核/巨噬細(xì)胞吞噬后，誘發(fā)后者產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，釋放一系列炎癥因子（TNF-α、IL-6、IL-1、M-CSF、PGEZ）；這些因子再通過一系列生物學(xué)反應(yīng)活化破骨細(xì)胞，釋放泌酸性磷酸酶、金屬蛋白酶等，引發(fā)骨溶解[9]。另有文獻(xiàn)表明，在一定條件下，單核細(xì)胞可以向破骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，引起骨吸收[10]。在破骨細(xì)胞的前體細(xì)胞表面存在RANK，它與相應(yīng)配體（RANKL）結(jié)合能引發(fā)破骨細(xì)胞分化、成熟，RANK的表達(dá)是調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞活化的重要環(huán)節(jié)[11]。TNF能直接使野生型破骨細(xì)胞前體表達(dá)RANK，激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）、c-Fos和NFATc1，并使其向破骨細(xì)胞分化，而IL-1可直接誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成[12]。TNF還能在rankl-/-和rank-/-小鼠體內(nèi)間接通過自身或其他因子誘導(dǎo)成骨細(xì)胞生成RANKL來促進(jìn)形成破骨細(xì)胞，提示TNF能通過非RANK途徑促進(jìn)破骨細(xì)胞形成[13]。因此抑制單核/巨噬細(xì)胞分泌TNF、IL-1并抑制其表達(dá)RANK，對(duì)抑制破骨細(xì)胞形成與活化具有重要意義。已有一些研究提示，二磷酸鹽、辛伐他汀等能抑制單核細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6、IL-1等，能在某種程度上使破骨細(xì)胞活化受到抑制[14-16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，Ti微粒組的培養(yǎng)液中IL-1、TNF-α明顯增多，說明Ti顆粒能誘導(dǎo)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞分泌溶骨因子。而與對(duì)照組比較，Ti微粒組RANK表達(dá)增加，說明Ti顆粒能促進(jìn)破骨細(xì)胞前體分化。與Ti微粒組比較，Ti+雷奈酸鍶組的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞RANK mRNA的表達(dá)明顯減少（P < 0.05），其培養(yǎng)液中IL-1、TNF-α也明顯減少（P < 0.05），說明雷奈酸鍶可以明顯抑制Ti顆粒誘導(dǎo)單核細(xì)胞分泌的IL-1和TNF-α，以及抑制其表達(dá)RANK。

綜上所述，雷奈酸鍶可以減少Ti顆粒誘導(dǎo)的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞分泌IL-1和TNF-α，且能明顯減少其表達(dá)RANK mRNA，抑制破骨細(xì)胞前體的分化潛能，從而可能延緩骨溶解；因而，可以認(rèn)為，雷奈酸鍶可能有預(yù)防假體周圍骨溶解的作用，有望成為防治假體周圍骨溶解的新選擇。本實(shí)驗(yàn)屬體外研究，只研究了單核/巨噬細(xì)胞的部分生物學(xué)行為。雷奈酸鍶在體內(nèi)是否能預(yù)防或延緩假體松動(dòng)，以及雷奈酸鍶具體通過什么機(jī)制影響單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞這些行為，都尚需進(jìn)一步研究。

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收稿日期：2015-01-06；修回日期：2015-02-17