楊素清 劉暢　張海龍　安月鵬

摘要：目的 探討蜈蚣敗毒飲對(duì)銀屑病HaCaT細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2、核因子-κB（NF-κB）mRNA表達(dá)的影響。方法 實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、西藥對(duì)照組、中藥對(duì)照組和蜈蚣敗毒飲低、中、高劑量組，分別給予生理鹽水、甲氨蝶呤混懸液、復(fù)方青黛膠囊混懸液和蜈蚣敗毒飲低、中、高劑量濃縮液灌胃，制備相應(yīng)的藥物血清，將其分別作用于HaCaT細(xì)胞中培養(yǎng)傳代，采用RT-PCR法檢測(cè)不同藥物血清對(duì)目的基因表達(dá)的干預(yù)作用。結(jié)果 各組藥物血清均能夠降低HaCaT細(xì)胞Bcl-2、NF-κB mRNA的表達(dá)，蜈蚣敗毒飲高劑量組和西藥對(duì)照組的作用效果最為明顯，且蜈蚣敗毒飲各劑量組呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。結(jié)論 蜈蚣敗毒飲可能通過(guò)降低Bcl-2、NF-κB mRNA的表達(dá)促進(jìn)了HaCaT細(xì)胞凋亡，調(diào)控T細(xì)胞相關(guān)因子降低免疫反應(yīng)，從而發(fā)揮抗銀屑病樣的作用。

關(guān)鍵詞：銀屑病；蜈蚣敗毒飲；HaCaT細(xì)胞；細(xì)胞凋亡抑制因子；核因子

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.016

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2015）04-0055-04

Effects of Wugong Baidu Drink Drug-containing Serum on Expressions of Genes Related to the Apoptosis of HaCaT Cell in Psoriasis YANG Su-qing， LIU Chang， ZHANG Hai-long， AN Yue-peng （First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine， Harbin 150040， China）

Abstract：Objective To discuss effects of Wugong Baidu Drink on expressions of Bcl-2， NF-κB mRNA genes related to the apoptosis of HaCaT in psoriasis. Methods Wistar rats were randomly divided into 6 groups：blank group， Western medicine control group， TCM control group， and Wugong Baidu Drink high， medium， and low dose groups. They were given normal saline， methotrexate suspension， compound natural indigo capsule suspension， and the different doses of Wugong Baidu Drink for gavage， respectively. Drug-containing serum of each group was prepared， and was put in the HaCaT respectively to subculture. The intervention effect of different Drug-containing serums on expressions of objective genes were detected through PR-PCR method. Results Drug-containing serum of each group could decrease the expressions of Bcl-2 mRNA and NF-κB mRNA. The most obvious effects were shown in the groups of Western medicine control group and Wugong Baidu Drink high dose group. All Wugong Baidu Drink groups showed a dose-response relationship. Conclusion Wugong Baidu Drink probably can promote the apoptosis of HaCaT by reducing the gene expressions of Bcl-2 and NF-κB. It can also decrease immune response by regulating serum factors related to T cells to play the role of anti-psoriasis.

Key words：psoriasis；Wugong Baidu Drink；HaCaT cell；inhibiting factor of apoptosis；nuclear factor

銀屑病是一種常見(jiàn)的、反復(fù)發(fā)作的慢性炎癥性皮膚病，目前普遍認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制與HaCaT的高度異常

基金項(xiàng)目：黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（12531619）

通訊作者：安月鵬，E-mail：anyuepeng_021@163.com

增殖密切相關(guān)[1]，因HaCaT細(xì)胞的加速增殖，導(dǎo)致表皮更替時(shí)間縮短，從而導(dǎo)致皮膚角化過(guò)度及紅斑、鱗屑等現(xiàn)象產(chǎn)生。我們前期對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖相關(guān)基因角蛋白-6（Keratin-6）進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，這種基因的表達(dá)水平與表皮細(xì)胞的增殖存在正相關(guān)作用[2]。但皮膚細(xì)胞的代謝是增殖和凋亡雙方面調(diào)控的共同結(jié)果，在與表皮細(xì)胞凋亡相關(guān)基因中，細(xì)胞凋亡抑制基因Bcl-2和核因子-κB（NF-κB）起到了十分重要的作用，均可通過(guò)表達(dá)而抑制細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)HaCaT細(xì)胞的壽命，導(dǎo)致表皮增厚，最終形成銀屑病樣反應(yīng)。故本研究選擇以上2種基因的表達(dá)作為研究對(duì)象，同時(shí)結(jié)合蜈蚣敗毒飲組方依據(jù)的中醫(yī)毒瘀理論，探討中藥對(duì)于銀屑病表皮細(xì)胞“抑制增殖”和“促進(jìn)凋亡”的雙向調(diào)控機(jī)能。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物與細(xì)胞株

雄性Wistar大鼠36只，體質(zhì)量180～220 g，鼠齡6～8周，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供（動(dòng)物合格證號(hào)：醫(yī)動(dòng)字第09-3-3號(hào)）；HaCaT細(xì)胞株來(lái)源于武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)保藏中心。

1.2 試劑

無(wú)菌蒸餾水（TA6007，北京天安聯(lián)合科技有限公司），異丙醇、氯仿、戊巴比妥鈉、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液（PBS，濟(jì)南世紀(jì)通達(dá)化工有限公司），Trizol Reagent、DEPC、引物設(shè)計(jì)合成（上海浩然生物技術(shù)有限公司），DL2000 DNA Marker、TransScript Reverse Transcriptase（上海捷瑞生物工程有限公司），2×EasyTaq PCR SuperMix（北京全式生物技術(shù)有限公司）。

1.3 儀器

細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板（美國(guó)康寧公司），細(xì)胞培養(yǎng)箱（德國(guó)Binder公司），DMEM培養(yǎng)基（上海慧穎生物科技有限公司），超低溫冰箱（8600，美國(guó)Thermo Scientific），倒置顯微鏡（CX22，日本Olympus），電泳儀（TE70X，美國(guó)Hoefer），高速低溫離心機(jī)（MR18.2，德國(guó)Herolab），臺(tái)式離心機(jī)（XPN-100，美國(guó)Optima），凝膠成像分析系統(tǒng)（MSD-2000A，北京麥思奇高科技有限公司），PCR儀（PQ9000，德國(guó)analytikjena），超凈工作間（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中基實(shí)驗(yàn)室）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥液制備

蜈蚣敗毒飲（蜈蚣3 g、紫草30 g、鬼箭羽30 g、土茯苓30 g、烏梢蛇20 g、甘草10 g，藥物均購(gòu)自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院門(mén)診草藥局），藥物經(jīng)2次煎煮，先加8倍量水，經(jīng)4 h浸泡后煎煮1 h，再加6倍量水煎煮1 h，2次煎汁混合均勻，分別濃縮為濃度5.94、2.97、1.48 g/mL。甲氨蝶呤片（批號(hào)070803，上海信誼藥廠(chǎng)有限公司），取15 mg溶于134.41 mL無(wú)菌蒸餾水，配制0.11 mg/mL甲氨蝶呤混懸液；復(fù)方青黛膠囊（批號(hào)201207013，陜西醫(yī)藥控股集團(tuán)），取18 g藥物劑量的膠囊制劑溶解于134.43 mL的無(wú)菌蒸餾水，配制成0.13 g/mL復(fù)方青黛膠囊混懸液。

2.2 藥物血清提取

將Wistar大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、西藥對(duì)照組、中藥對(duì)照組和蜈蚣敗毒飲低、中、高劑量組，每組6只?？瞻讓?duì)照組灌服生理鹽水，西藥對(duì)照組灌服甲氨蝶呤混懸液，中藥對(duì)照組灌服復(fù)方青黛膠囊混懸液，蜈蚣敗毒飲低劑量組、中劑量組、高劑量組灌服相應(yīng)濃度的蜈蚣敗毒飲濃縮液。灌服劑量均為每日2 mL/100 g，每日2次，連續(xù)3 d。末次給藥后，大鼠戊巴比妥鈉（35 mg/kg）腹腔注射麻醉，取腹主動(dòng)脈血靜置后3000 r/min離心5 min分離血清，取上層血清，經(jīng)56 ℃滅活，混勻，濾菌，分裝，保存。

2.3 細(xì)胞分組與給藥

將HaCaT細(xì)胞置于DMEM培養(yǎng)液中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，經(jīng)傳代、計(jì)數(shù)、凍存、復(fù)蘇等過(guò)程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞的制備。將HaCaT細(xì)胞隨機(jī)分成6組，并取細(xì)胞以2×104/mL接種于培養(yǎng)瓶中，每瓶4 mL，培養(yǎng)24 h后，顯微鏡下觀察細(xì)胞已貼壁生長(zhǎng)良好，再吸棄上清液和沒(méi)有貼壁的細(xì)胞，分別給予空白血清、甲氨蝶呤藥物血清、復(fù)方青黛膠囊藥物血清和蜈蚣敗毒飲低、中、高劑量血清于6個(gè)瓶中，并按照比例加入胎牛血清、DMEM，使其與藥物血清的比例保持在1∶8∶1，處理48 h。

2.4 觀察指標(biāo)和檢測(cè)方法

2.4.1 RNA提取及檢測(cè) 應(yīng)用Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA。將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液倒出，用預(yù)冷的PBS緩沖液清洗細(xì)胞表面3次，按1 mL/25 cm2加入Trizol，反復(fù)吹打后移入新的DEPC處理過(guò)的Eppendorf管內(nèi)。室溫下孵育細(xì)胞5 min，使核蛋白完全碎裂。按照每1 mL Trizol加入0.2 mL的比例加入氯仿，蓋緊管蓋，劇烈震蕩混勻30 s，室溫下孵育2～3 min，4 ℃、12 000 g離心10～15 min。Eppendorf管內(nèi)液體分為3層，小心吸取最上層的水性上清，加入異丙醇0.5 mL，顛倒混勻，室溫孵育10 min后，4 ℃、12 000 g離心10 min，RNA沉淀管底，呈膠凍狀。棄上清，保留沉淀，加入4 ℃的75%乙醇，每1 mL Trizol至少加入1 mL乙醇，并振蕩。2～8 ℃、7500 g離心5 min，小心吸棄上清后空氣干燥3～5 min，加入10 μL DEPC水，吹打溶解RNA，進(jìn)行純度及完整性檢測(cè)，或凍存于-70 ℃冰箱備用。

2.4.2 第一鏈cDNA合成 加入總RNA 500 ng， Anchored Oligo（dT）18（0.5 μg/μL） 1 μL，10 mmol/L dNTPs 1 μL，5×RT Buffer 4 μL，Ribonuclease Inhibitor（50 U/μL） 0.5 μL，TransScript RT 1 μL， ddH2O to final volume 20 μL。輕輕混勻，42 ℃孵育30 min。85 ℃加熱5 min失活。

2.4.3 聚合酶鏈反應(yīng) 引物：從美國(guó)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載mRNA序列，用Primer3.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)：Bcl-2（Forward primer：CTGGGGGAGGATTGTGGCCTTCT； Reverse primer：CTCCAACCCCCGCATCTCGGAC；產(chǎn)物長(zhǎng)度220 bp）；NF-κB（Forward primer：CGCCACCCGGCT TCAGAATGG；Reverse primer：TATGGGCCATCTGCTGTTGGC AG；產(chǎn)物長(zhǎng)度148 bp）；ACTB（Forward primer：ACAGAG CCTCGCCTTTGCCGATC；Reverse primer：ATCCTTCTGACC CATGCCCACCA；產(chǎn)物長(zhǎng)度208 bp）。反應(yīng)體系：Template DNA 2 μL，F(xiàn)orward Primer（10 μmol/L） 1 μL；Reverse Primer（10 μmol/L） 1 μL，2×EasyTaq PCR SuperMix 25 μL，ddH2O to final volume 50 μL。PCR循環(huán)：94 ℃預(yù)變性4 min、94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，連續(xù)30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。

2.4.4 PCR產(chǎn)物分析 應(yīng)用凝膠圖像處理系統(tǒng)對(duì)電泳后的凝膠進(jìn)行觀察、拍照，測(cè)量各產(chǎn)物的光密度。以目的基因光密度值與同時(shí)擴(kuò)增的內(nèi)參基因光密度比值表示目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以—x±s表示，多組計(jì)量資料的兩兩比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

與空白對(duì)照組比較，各藥物組對(duì)HaCaT細(xì)胞Bcl-2、NF-κB mRNA表達(dá)均有干預(yù)作用（P<0.05）；其中西藥對(duì)照組干預(yù)作用優(yōu)于除蜈蚣敗毒飲高劑量組外各給藥組（P<0.05），且蜈蚣敗毒飲高劑量組與西藥對(duì)照組藥效相當(dāng)（P<0.05）。蜈蚣敗毒飲各劑量組作用療效隨藥液濃度的增加而增強(qiáng)。通過(guò)凝膠電泳圖可以直觀看出兩目的基因的表達(dá)成像情況。

5 討論

銀屑病臨床突出表現(xiàn)為大量的紅斑、鱗屑堆積。以往對(duì)于銀屑病發(fā)病機(jī)制的研究多集中于對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖機(jī)制的探討[3]，從正向思維認(rèn)為，增殖的過(guò)度必然會(huì)導(dǎo)致表皮堆積成厚層銀屑。但這僅僅是其中的一個(gè)方面，凋亡的抑制和減慢同樣可造成內(nèi)表皮細(xì)胞數(shù)量的增多而發(fā)病。

HaCaT細(xì)胞凋亡在皮膚發(fā)育和更新平衡穩(wěn)定中起著重要的作用，與其增殖密切相關(guān)。在正常表皮，角質(zhì)形成細(xì)胞增殖速率與凋亡速率相等，以維持表皮細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，銀屑病中角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡受阻，其凋亡的減少可造成多余細(xì)胞堆積及角層增厚[4]。有學(xué)者比較了銀屑病來(lái)源的角質(zhì)形成細(xì)胞和正常人角質(zhì)形成細(xì)胞對(duì)凋亡反應(yīng)的差異，發(fā)現(xiàn)銀屑病來(lái)源的角質(zhì)形成細(xì)胞對(duì)凋亡具有抵抗性[5]。細(xì)胞凋亡的發(fā)生和發(fā)展是多基因嚴(yán)格控制的過(guò)程，Bcl-2是第一個(gè)被確認(rèn)有抑制凋亡作用的基因，是目前發(fā)現(xiàn)的與凋亡關(guān)系密切的原癌基因之一，也是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的一類(lèi)調(diào)節(jié)因子[6]。Bcl-2的表達(dá)可調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)凋亡的易感性，增加細(xì)胞對(duì)多種凋亡刺激因素的抵抗性，抑制許多細(xì)胞的凋亡，同時(shí)，可延長(zhǎng)具有分化潛能的上皮細(xì)胞的壽命且允許增殖、分化和形態(tài)發(fā)生發(fā)展，從而導(dǎo)致表皮增厚。NF-κB在銀屑病發(fā)病過(guò)程中亦起到了關(guān)鍵的作用，實(shí)驗(yàn)研究表明，NF-κB介導(dǎo)的對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制包括誘導(dǎo)超氧化物歧化酶表達(dá)、誘導(dǎo)凋亡抑制因子表達(dá)這兩個(gè)主要功能[7]，同時(shí)，NF-κB亦具有調(diào)控T淋巴細(xì)胞所介導(dǎo)的多種細(xì)胞因子及黏附分子表達(dá)的作用，通過(guò)干預(yù)這些血清學(xué)因子的含量從而影響銀屑病的發(fā)展發(fā)生[8]。

本研究結(jié)果顯示，甲氨蝶呤、復(fù)方青黛膠囊、蜈蚣敗毒飲藥物血清均有降低HaCaT細(xì)胞Bcl-2、NF-κB mRNA表達(dá)的作用，與空白對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同時(shí)，蜈蚣敗毒飲高劑量組和西藥對(duì)照組的作用效果明顯優(yōu)于其他各藥物組，并且蜈蚣敗毒飲藥物血清的作用強(qiáng)度隨著濃度的增高而表現(xiàn)出一定的不典型量效關(guān)系。因此我們推測(cè)，基于中醫(yī)毒瘀理論而創(chuàng)立的蜈蚣敗毒飲在中醫(yī)學(xué)角度上可以產(chǎn)生良好的解毒化瘀之效，將熱毒、濕毒、瘀毒隨因而解，以防疾病的轉(zhuǎn)化和變歸。而在病因?qū)W角度其發(fā)揮抗銀屑病作用機(jī)制方面，一是可能與抑制了HaCaT細(xì)胞增殖相關(guān)；另一方面是通過(guò)降低Bcl-2、NF-κB基因的表達(dá)，促進(jìn)了HaCaT細(xì)胞凋亡；再者，與其干預(yù)和調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞相關(guān)因子，降低免疫反應(yīng)有關(guān)。蜈蚣敗毒飲通過(guò)多途徑、多靶點(diǎn)的作用機(jī)制來(lái)達(dá)到治療銀屑病的目的，體現(xiàn)出中醫(yī)藥的多點(diǎn)優(yōu)勢(shì)和雙向調(diào)控作用。

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（收稿日期：2014-06-29；編輯：華強(qiáng)）