緱鴻達(dá) 陳麗珍 任芯 王春良 翟銳銳

摘 要：目的 研究五指山綠茶茶多糖的提取工藝與含量測(cè)定方法。方法 茶多糖含量測(cè)定采用蒽酮-硫酸法；采用水浸提法，以茶多糖提取得率為指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察對(duì)茶多糖提取得率的影響因素。結(jié)果 多糖含量測(cè)定的線性回歸方程為C=6.637 6A-7.249 89，r=0.999 1，線性范圍為10.040～100.40μg/mL。最佳提取工藝為加入15倍量的水，90 ℃提取3次，每次180 min。結(jié)論 為五指山綠茶提供了穩(wěn)定可行的茶多糖提取工藝，準(zhǔn)確可靠的茶多糖含量測(cè)定方法。

關(guān)鍵詞：五指山綠茶 茶多糖 提取 含量測(cè)定

中圖分類號(hào)：S571.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-3791（2015）09（c）-0255-02

五指山綠茶，由于長(zhǎng)年生長(zhǎng)于云霧里，清香持久，醇香甘甜，養(yǎng)肺潤(rùn)喉，提神醒腦，去除疲勞，防止感冒、解毒通腸等功效。茶多糖（Tea Polysaccharides，TPS）是茶葉中一類與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起的酸性多糖或酸性糖蛋白，隨原料的老嫩、茶樹(shù)品種、采摘季節(jié)與制作工藝的不同有所差別，一般老葉比嫩葉含量高。現(xiàn)代藥理研究表明，茶多糖具有降血糖、防治糖尿病、降血脂、防治心血管疾病等多種功能，同時(shí)在抗氧化和增強(qiáng)人體非特異性免疫功能等作用也較顯著，是一種很有開(kāi)發(fā)前景的天然資源[1-2]。

為了對(duì)茶葉中有效成分進(jìn)行提取進(jìn)行綜合開(kāi)發(fā)利用，并將其應(yīng)用到食品、醫(yī)藥等多種領(lǐng)域。因此，在茶葉中分離并提取茶多糧，提高產(chǎn)品的質(zhì)量，茶葉是一種傳統(tǒng)的天然生物資源將其進(jìn)行綜合利用是具有重要意義的。該實(shí)驗(yàn)著重研究探討了影響茶葉中茶多糖提取得率的多種因素，優(yōu)選出最佳提取工藝條件， 以期為茶葉資源的深度加工和應(yīng)用提供一定的科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試原料

綠茶（市購(gòu)于海南五指山市茶葉市場(chǎng)）。將茶葉在40 ℃烘箱中干燥，用粉碎機(jī)粉碎后過(guò)60目篩，得到茶葉細(xì)粉末，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑

實(shí)驗(yàn)試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水均為雙蒸水。蒽酮-硫酸試液。

1.1.3 儀器

722S分光光度計(jì)。

1.2 茶多糖提取工藝流程

干燥茶葉粉碎 過(guò)60目篩子 水浸提

離心4000 r/min 取上清液于容量瓶中定容

蒽酮-硫酸分光光度法測(cè)定茶多糖的含量并計(jì)算得率。

1.3 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)主要提取條件：浸提溫度（ 60 ℃、70 ℃、80 ℃）、浸提時(shí)間（2 h、3 h、4 h）、料液比（1∶10、1∶15、1∶20 g/mL）、浸提次數(shù)（1、2、3次）4個(gè)因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，每個(gè)因素設(shè)定3個(gè)水平，選用L9（34）正交表安排試驗(yàn)，優(yōu)化出茶多糖提取的最佳條件。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取無(wú)水葡萄糖對(duì)照品適量，加雙蒸水配成1.004 0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密移取對(duì)照品溶液1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL分別置100 mL容量瓶，各加水至刻度，搖勻。分別精密移取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液各2.00 mL置具塞試管中，以2.00 mL雙蒸水作空白，每管再加入8 mL蒽酮-硫酸試液（勿沿壁，直接加在液面），立即搖勻，冰水浴中冷卻。一起置于沸水浴中加熱7 min，然后用冷水迅速冷卻，放置10 min后[3-4]，在580 nm處測(cè)定吸光度（A）。橫坐標(biāo)為葡萄糖濃度（C），縱坐標(biāo)為吸光度，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程。

1.5 茶多糖的制備與測(cè)定[1-3]

將從實(shí)驗(yàn)中得到的提取液用雙蒸水進(jìn)行適當(dāng)稀釋定容，搖勻，備用。測(cè)定時(shí)吸取2 mL該稀釋液于試管中，然后按1.4中的方法測(cè)定吸光度，由回歸方程計(jì)算茶多糖提取液中葡萄糖濃度。茶多糖得率以如下公式計(jì)算：

茶多糖含量（mg/g）=（ C×V×f）/（ W×103）

式中為C：茶多糖提取液中葡萄糖濃度（mg/mL）；V為茶多糖提取物體積（mL）；W為茶葉的質(zhì)量（g）；f為換算因子。

1.6 方法學(xué)考察

1.6.1 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批號(hào)樣品約2 g，精密稱定，按樣品溶液的制備與測(cè)定方法操作，于580 nm處每隔1 h測(cè)定吸光度一次，連續(xù)6 h。

1.6.2 精密度試驗(yàn)

取同一批樣品約2 g，精密稱定，按樣品溶液的制備與測(cè)定方法操作，于580 nm處連續(xù)測(cè)定吸光度6次。

1.6.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品約2 g（n=6），精密稱定，按樣品溶液的制備與測(cè)定方法操作，于580 nm處分別測(cè)定吸光度值，

1.6.4 加樣回收試驗(yàn)

精密稱取同一批樣品2.0 g，共6份，分別精密加入適量多糖對(duì)照品溶液，按照供試品溶液的制備方法操作，于580 nm處分別測(cè)定其吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程：C=6.6376 A-7.249 89，r=0.999 1，線性范圍：10.040～100.40μg/mL。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)正交軟件對(duì)茶多糖提取工藝數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所得正交試驗(yàn)分析與方差分析結(jié)果表明，4個(gè)提取因素對(duì)茶多糖得率影響的主次順序即：次數(shù)>時(shí)間>溫度>料液質(zhì)量比，其中次數(shù)和時(shí)間呈顯著水平。茶多糖提取的最佳工藝為在90 ℃下，以1∶15的料液質(zhì)量比，浸提180 min，次數(shù)3次，此條件下茶多糖得率為495.65 mg/g。

2.3 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

經(jīng)最佳提取工藝條件下平行提取6次，測(cè)定得到的吸光度值為0.292、0.292、0.295、0.291、0.293和0.291，計(jì)算得到茶多糖含量為501.30 mg/g，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.56%。

2.4 方法學(xué)考查

2.4.1 穩(wěn)定性試驗(yàn)

測(cè)定得到的吸光度值為0.291、0.290、0.287、0.286、0.288、0.293和0.294，RSD為1.14%。結(jié)果表明該實(shí)驗(yàn)提取的多糖溶液較為穩(wěn)定，放置6h內(nèi)重現(xiàn)性較好。

2.4.2 精密度試驗(yàn)

測(cè)得的吸光度值分別為0.291、0.288、0.289、0.288、0.291和0.290，RSD=0.52% （n=6），結(jié)果表明該方法具有較高的精密度。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法有較好的重復(fù)性，計(jì)算多糖平均含量為501.30 mg/g，RSD=0.56%（n=6）。表明該實(shí)驗(yàn)方法偶然誤差較小，方法可靠。

2.4.4 加樣回收試驗(yàn)

結(jié)果見(jiàn)表1。6次實(shí)驗(yàn)的回收率在94.62%～98.97%之間，平均回收率為95.52%，RSD=1.72%。表明該方法比例系統(tǒng)誤差較小，準(zhǔn)確度高。

3 結(jié)語(yǔ)

目前在測(cè)定茶多糖時(shí)常用葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，這是由于茶多糖是由6種以上的單糖組成的復(fù)合多糖；且提取所得茶多糖成分也不相同，是因?yàn)椴璧姆N類、產(chǎn)地、制作方法、發(fā)酵工藝等因素的影響，同時(shí)也受提取過(guò)程中多種因素影響，尤其是料液質(zhì)量比、時(shí)間、溫度和次數(shù)都會(huì)對(duì)茶多糖得率造成影響。

從海南五指山產(chǎn)綠茶中分離提取出粗茶多糖，所得最佳提取工藝為：在90 ℃浸提溫度下，以1∶15的料液質(zhì)量比浸提180 min，次數(shù)3次，最佳含量為495.65 mg/g。用蒽酮-硫酸法測(cè)定茶多糖含量表明，五指山產(chǎn)綠茶中茶多糖含量為501.30 mg/g。經(jīng)方法學(xué)考查實(shí)驗(yàn)可知，含量測(cè)定方法的重復(fù)性、精密度與穩(wěn)定性均較高，回收率符合要求，可作為茶多糖的含量測(cè)定的科學(xué)方法。有關(guān)五指山產(chǎn)綠茶茶多糖的分離純化與單糖組成結(jié)構(gòu)，以及相關(guān)的生物活性有待深入探討研究，旨在為茶多糖在醫(yī)藥和食品保健等眾多領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)利用提供嶄新的思路。

參考文獻(xiàn)

[1] 崔宏春，余繼忠，黃海濤，等.茶多糖的提取及分離純化研究進(jìn)展[J].茶葉，2011，37（2）：67-71.

[2] 王黎明，夏文水.葸酮—硫酸法測(cè)定茶多糖含量的研究[J].食品科學(xué)，2005，26（7）：185-188.

[3] 趙麗平，肖穎，董翠.信陽(yáng)綠茶中茶多糖提取工藝研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（10）：245-246.