李 瑛 吳小明 汪永忠 段賢春 魏良兵 吳 健 韓燕全

UPLC法同時(shí)測(cè)定痺苓祛痛顆粒中常春藤皂苷元和齊墩果酸含量

李 瑛 吳小明 汪永忠 段賢春 魏良兵 吳 健 韓燕全

目的 建立UPLC法同時(shí)測(cè)定痺苓祛痛顆粒中常春藤皂苷元和齊墩果酸含量的方法。方法Acquity BEH C18(2.10 mm×100 mm，1.70 μm)為色譜柱，流動(dòng)相乙腈-水(90 ∶10)，0.20 mL/min流速，30℃柱溫，205 nm波長(zhǎng)為條件。結(jié)果常春藤皂苷元和齊墩果酸的進(jìn)樣量在0.093 2～0.932 0 μg(r=0.9995)、0.301 5～3.015 0 μg(r=0.999 4)范圍內(nèi)與其峰曲線下面積分別呈良好的線性關(guān)系；兩者平均回收率分別為96.28%和98.62%，RSD為2.53%和1.70%。結(jié)論建立的含量測(cè)定方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、快速，可用于痺苓祛痛顆粒的質(zhì)量控制。

痺苓祛痛顆粒；常春藤皂苷元；齊墩果酸；超高效液相色譜；含量測(cè)定

痺苓祛痛顆粒為國(guó)家中醫(yī)臨床研究基地(研究病種：糖尿病)特色中藥制劑，處方由威靈仙、當(dāng)歸、黃柏、萆薢等十味藥組成，具有清熱解毒，祛濕瀉濁，活血通絡(luò)之功效。臨床應(yīng)用多年，對(duì)于痛風(fēng)急性期、間歇期和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎紅腫痛患者效果良好[1]。本文采用UPLC法對(duì)痺苓祛痛顆粒的有效成分(常春藤皂苷元和齊墩果酸)含量進(jìn)行測(cè)定，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 超高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)；KQ3200DB型超聲儀(江蘇昆山超聲儀器有限公司)；電子天平(德國(guó)賽多利斯 BP211D)。

痺苓祛痛顆粒由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心提供，批號(hào)：20130226、20131012、20140307；常春藤皂苷元(含量測(cè)定用，批號(hào)：1117333-200904)、齊墩果酸(含量測(cè)定用，批號(hào)：110709-200505)、對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定研究院；液相用試劑為色譜純(美國(guó)TEDIA公司)，其它所用試劑均為分析純；蒸餾水(屈臣氏)。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 Acquity BEH C18(2.10 mm×100 mm,1.70 μm) 色譜柱，柱溫：30℃；以乙腈-水(90 ∶10)為流動(dòng)相；流速0.20 mL/min， 205 nm檢測(cè)。

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取常春藤皂苷元和齊墩果酸對(duì)照品，置容量瓶中，加入適量CH3OH超聲溶解，冷卻，再用CH3OH補(bǔ)充至刻度，搖勻，即得濃度分別為0.186 4 mg/mL、0.603 0 mg/mL混合對(duì)照品溶液，備用。

1.2.3 供試品溶液的制備[1]精密稱定制劑粉末4.0 g濾紙包裹，加乙酸乙酯適量，索式回流提取3 h，棄去提取液，殘?jiān)鼡]干溶劑，與濾紙筒一起轉(zhuǎn)移至燒瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，稱重，加熱回流1 h，取出，放冷后再稱重、補(bǔ)重，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液25 mL，水浴蒸干，殘?jiān)?.0 mol/L的HCl溶液30 mL使溶解，轉(zhuǎn)移至錐形瓶中水浴加熱回流2 h，取出，冷卻，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中。少量水洗滌容器，洗滌液合并轉(zhuǎn)移入分液漏斗中，加乙酸乙酯振搖提取3次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)覥H3OH溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加CH3OH至刻度，搖勻，即為供試品溶液。

另按痺苓祛痛顆粒處方比例制備不含威靈仙藥材的樣品，同法制備陰性對(duì)照溶液。

2 結(jié)果

2.1 專屬性考察 分別精密吸取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各1.0 μL，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果顯示對(duì)照品溶液與供試品溶液在相同的保留時(shí)間有對(duì)應(yīng)的色譜峰，而陰性對(duì)照溶液在對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間無(wú)色譜峰，表明本法的專屬性良好。見(jiàn)圖1～圖3。

2.2 線性關(guān)系考察 吸取配好備用，按梯度逐步稀釋成6個(gè)濃度的混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣量1.0 μL逐個(gè)進(jìn)樣，按“2.1”色譜條件測(cè)定，記錄AUC。以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，AUC為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，常春藤皂苷元標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=5 301 271.591 5X+10 863.186 3(r=0.999 5，n=6)，齊墩果酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=22 663 57.336 6X+18 503.3589 (r=0.999 4，n=6)。常春藤皂苷元和齊墩果酸的進(jìn)樣量分別在0.093 2～ 0.932 0 μg、0.301 5～3.015 0 μg范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液1.0 μL，照上述色譜條件重復(fù)6次進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果顯示常春藤皂苷元和齊墩果酸的RSD分別為0.62%和0.48%(n=6)，表明精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取20140307批供試品溶液于室溫下放置，分別于0、2、4、8、16、24 h按“1.2.1”色譜條件進(jìn)樣1.0 μL測(cè)定，記錄AUC。結(jié)果顯示常春藤皂苷元和齊墩果酸的RSD分別為0.61%和1.08%(n=6)，表明供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取20140307批次制劑樣品4.0 g，按1.2.3項(xiàng)下制備方法平行制備6份供試品溶液，按“1.2.1”色譜條件進(jìn)樣1.0 μL測(cè)定，記錄AUC。結(jié)果顯示常春藤皂苷元和齊墩果酸的RSD分別為0.98%和1.48%(n=6)，表明本法重復(fù)性良好。

2.6 加樣回收率試驗(yàn) 取20140307批已知含量的制劑樣品適量6份，精密稱定，分別精密加入適量常春藤皂苷元和齊墩果酸對(duì)照品溶液，按“1.2.3”制備方法制備供試品溶液，照“1.2.1”色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄AUC，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.7 樣品含量測(cè)定 取上述3個(gè)批次的制劑樣品各4.0 g，按“1.2.3”方法制備供試品溶液，按“1.2.1”色譜條件各進(jìn)樣1.0 μL測(cè)定，記錄AUC，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中常春藤皂苷元和齊墩果酸的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(mg/g)

3 討論

威靈仙古時(shí)就為治療痹證的常用方藥，對(duì)于痹證的治療效果良好。本文采用UPLC法對(duì)痺苓祛痛顆粒君藥威靈仙中的有效成分常春藤皂苷元和齊墩果酸同時(shí)進(jìn)行了含量測(cè)定[2,3]，同時(shí)測(cè)定的方法可以對(duì)樣品中的兩個(gè)及以上的指標(biāo)成分進(jìn)行同步分析，可以減少分析的時(shí)間及溶劑的損耗[4]。另外本文采用的UPLC法較普通HPLC法更具有靈敏度高、分離度高、分析時(shí)間短和進(jìn)樣量少等特點(diǎn)[5]，兩者一起大大提高了制劑分析的效率，是對(duì)于中藥制劑的復(fù)雜成分特別適用，可以在中藥分析中廣泛應(yīng)用[6]。

由于本實(shí)驗(yàn)供試品溶液提取方法較為復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)中分別比較了不同濃度的乙醇超聲及水浴回流提取方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與索式提取除雜相比，其他方法中的雜質(zhì)峰干擾均較明顯，雜質(zhì)成分較多，因此本實(shí)驗(yàn)仍采用了2010年版《中國(guó)藥典》威靈仙項(xiàng)下的方法處理樣品。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本研究建立的同時(shí)含量測(cè)定方法可行，具有較高分離度和專屬性，可作為痺苓祛痛顆粒的質(zhì)量控制方法之一。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:234.

[2] 郝寧,于艷,張漫霞,等.威靈仙總皂苷和總黃酮超聲提取工藝[J].中藥材,2014,37(5):884-889.

[3] 郭宇姝,竇冕,張沂,等.HPLC-ELSD測(cè)定咽炎顆粒中齊墩果酸與常春藤皂苷元[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2014,20(2):51-54.

[4] 李璐,林文華,嚴(yán)萍,等.不同來(lái)源威靈仙常春藤皂苷元和齊墩果酸的含量測(cè)定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,41(7):2910-2911.

[5] 吳健,吳小明,高家榮,等.UPLC同時(shí)測(cè)定復(fù)方守宮散中蒽醌類含量[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2014,16(6):60-62.

[6] 汪永忠,姜蕾,韓燕全,等.超高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定丹蛭降糖膠囊中丹皮酚和芍藥苷含量[J].中國(guó)新藥雜志,2012,21(12):1337-1340.

(2014-11-01 收稿 2014-12-22 修回)

Simultaneous determination of ivy sapogenin and oleanolic acid contents in Biling qutong powder by UPLC

LiYing,WuXiaoming,WangYongzhong,etal

AnhuiUniversityofChineseMedicine,Hefei230032,China

Objective To establish a UPLC method for the determination of ivy sapogenin and oleanolic acid in Biling qutong powder. Methods The determination was performed on Acquity BEH C18(2.1 mm×100 mm, 1.70 μm) with mobile phase consisted of Acetonitrile-water (90 ∶10)at a flow rate of 0.20 mL/min. Column temperature was 30 ℃.The UV detection wavelength was set at 205 nm. Results The calibration curves were linear in the range of 0.0932～0.9320μg(r=0.999 5) for Ivy sapogenin, 0.301 5～3.015 0 μg(r=0.999 4)for oleanolic acid. The average recovery was 96.28% and 98.62% respectively, and the RSD was 2.53% and 1.70% respectively. Conclusion The determination method is simple, accurate and fast, which can be used for quality control of Biling qutong powder.

Biling qutong powder; Ivy sapogenin; Oleanolic acid; UPLC; Content determination

安徽中醫(yī)藥大學(xué)臨床科學(xué)研究基金項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：2012LC1-016B)

230032 合肥 安徽中醫(yī)藥大學(xué)(李瑛,汪永忠) 230031 合肥 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院(李瑛,吳小明,汪永忠,段賢春,魏良兵,吳健,韓燕全)

汪永忠, wyzhmail@163.com

10.3969/j.issn.1000-0399.2015.03.003