耿廣琴，楊雅麗，李 揚(yáng)，黃 勇

(甘肅中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

·實(shí)驗(yàn)研究·

黨參水提物對(duì)D-半乳糖致衰老模型小鼠肝、腎線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅳ酶活性及線粒體結(jié)構(gòu)的影響*

耿廣琴，楊雅麗，李 揚(yáng)，黃 勇

(甘肅中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

目的:研究黨參水提物對(duì)D-半乳糖致衰老模型小鼠肝、腎線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅳ酶活性和線粒體結(jié)構(gòu)的影響，探討黨參在延緩衰老中的作用及其機(jī)制。方法:將100只小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組和黨參水提物低、中、高劑量組5組。除正常對(duì)照組外，其余4組每日每只小鼠頸背部皮下注射5% D-半乳糖溶液，注射量為0.025 mL/ g，正常對(duì)照組注射同體積生理鹽水。黨參低、中、高劑量組每日上午依次按相當(dāng)于生藥量 5，10，15 g/kg個(gè)劑量給致衰老小鼠灌服黨參水煎液，與造模同步，連續(xù)服藥 42 d。采用分光光度法測(cè)定肝、腎線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅳ酶活性，電鏡觀察肝、腎線粒體結(jié)構(gòu)損傷。結(jié)果：黨參水提物中、高劑量組小鼠肝、腎線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅳ酶活性均升高，其中高劑量組的肝、腎線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅳ酶活性與模型對(duì)照組對(duì)比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。黨參水提物高劑量組小鼠肝、腎線粒體結(jié)構(gòu)異常變化明顯改善，黨參水提物高劑量組肝、腎線粒體損傷程度顯著低于模型對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論:高劑量的黨參水提物能通過某種機(jī)制減緩或阻止線粒體結(jié)構(gòu)的異常改變，改善或維持其正常功能的執(zhí)行, 起到延緩衰老的作用，具體的機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

黨參水提物/藥效學(xué)；衰老/藥物作用；D-半乳糖致衰老模型；線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅳ酶活性；線粒體結(jié)構(gòu)；動(dòng)物模型；小鼠

衰老的過程復(fù)雜，受多種因素調(diào)控[1]。衰老既是一種病理變化, 又是一種不可逆轉(zhuǎn)的生理過程；但是，延緩衰老是完全可能的[2]。線粒體是細(xì)胞進(jìn)行氧化磷酸化、產(chǎn)生能量的主要場(chǎng)所，是細(xì)胞的“動(dòng)力工廠”，同時(shí)線粒體也是機(jī)體產(chǎn)生氧自由基的主要場(chǎng)所[3]。研究表明，線粒體結(jié)構(gòu)和功能異常與衰老的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4-5]。本研究通過研究黨參水提物對(duì)D-半乳糖致衰老模型小鼠肝、腎線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅳ酶活性和線粒體結(jié)構(gòu)的影響，探討中藥黨參在延緩衰老中的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

SPF級(jí)2月齡昆明種小鼠100只，雌雄各半，體質(zhì)量(18±2) g，購(gòu)自甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào):SCXK(甘) 2011-0001。

1.2 藥品、試劑與儀器

黨參采自甘肅岷縣，經(jīng)甘肅中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)教研室鑒定為白條黨參。取黨參100 g，分2次煎煮，第1次加10倍量水煎煮1 h，第2次加6倍水煎煮1 h，合并兩次提取液，過濾后，濃縮成含生藥0.5 g/mL的水煎劑，置4 ℃冰箱備用，水煎液每5d制備1次。D-半乳糖，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品,批號(hào)G-0625，臨用前用生理鹽水配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)12 g/L的溶液；動(dòng)物細(xì)胞/組織活性線粒體分離試劑盒(批號(hào)GMS10006.2)、純化線粒體凍存液(酶學(xué)和膜結(jié)構(gòu)保護(hù))(批號(hào)GMS12198.1)、Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒(批號(hào)GMS30030.1)、動(dòng)物線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ(NADH-輔酶Q還原酶)活性定量檢測(cè)試劑盒(批號(hào)GMS50007)、動(dòng)物線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅳ(正鐵細(xì)胞色素C-氧化還原酶)活性定量檢測(cè)試劑盒(批號(hào)GMS50010)，均購(gòu)自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。BS224S型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，鄭州杜甫儀器廠產(chǎn)品；XYJ80-20型離心機(jī)，金壇市恒豐儀器廠產(chǎn)品；XW-80A型旋渦混勻器，上海精科實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；UV754N型紫外可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；JEOL-1230透射電子顯微鏡，日本電子公司產(chǎn)品。

1.3 動(dòng)物分組及模型的建立

將100只小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組和黨參水提物低、中、高劑量組5組，每組20只，雌雄各半。模型對(duì)照組和黨參水提物低、中、高劑量組每日每只小鼠頸背部皮下注射50 g/L D-半乳糖溶液，注射量為0.025 mL/g；正常對(duì)照組小鼠注射等體積生理鹽水。黨參低、中、高劑量組每日上午依次按相當(dāng)于生藥量 5，10，15 g/kg劑量灌服黨參水煎液，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組灌服等體積生理鹽水，與造模同步，連續(xù)服藥 42 d。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 肝、腎組織線粒體制備

于末次給藥2 h后，稱量各組小鼠體質(zhì)量，斷頭處死小鼠，迅速剖取肝、腎，用預(yù)冷的4℃生理鹽水洗凈表面殘血備用。剪取大鼠肝、腎組織，按照試劑盒所示方法進(jìn)行線粒體的提取，用Bradford蛋白質(zhì)濃度定量法測(cè)定線粒體蛋白含量，調(diào)整蛋白濃度在10～20 g/L。各組線粒體蛋白懸液分裝，于-80 ℃保存，保存時(shí)間不超過2周。

1.4.2 線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅳ酶活性測(cè)定

測(cè)定前將線粒體蛋白置于-20 ℃/20 ℃反復(fù)凍融 3 次，使之成為線粒體膜片段以達(dá)到最大酶活性。線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅳ酶活性測(cè)定的具體操作步驟嚴(yán)格按照相應(yīng)定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書進(jìn)行。復(fù)合體Ⅰ的活性單位以每毫克線粒體蛋白每分鐘消耗NADH的納摩爾數(shù)表示，即nmol/(min·mgpro)。復(fù)合體Ⅳ的活性單位以每毫克線粒體蛋白每分鐘氧化cytC的納摩爾數(shù)表示，即nmol/(min·mgpro)。

1.4.3 超微結(jié)構(gòu)觀察

筆者前期研究了黨參水提物對(duì)小鼠肝、腎組織中SOD活性、MDA含量的影響[7]，結(jié)果顯示高劑量黨參水提物延緩衰老的作用更為理想，因此本項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)中，僅對(duì)黨參水提物高劑量組小鼠的肝、腎細(xì)胞線粒體的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察。取大鼠肝及腎皮質(zhì)組織結(jié)構(gòu)1 mm3；分別固定于1/15 mol/L磷酸緩沖液(PBS)配制的體積分?jǐn)?shù)30 mL/L戊二醛固定液2 h，PBS液漂洗3次，每次10 min；10 g/L鋨酸固定1.5 h，PBS液漂洗3次，每次10 min；以500，700，800，900，1 000 mL/L乙醇梯度脫水，每次10 min，純丙酮脫水2次，每次10 min；1∶1EPON-812環(huán)氧樹脂∶純丙酮浸透2 h；EPON-812環(huán)氧樹脂包埋；35 ℃下24 h、45 ℃下24 h、65 ℃下24 h 聚合；半薄切片，甲苯胺藍(lán)染色；光鏡下定位，超薄切片； 透射電子顯微鏡觀察。

采用Flameng分級(jí)法[6]對(duì)線粒體損傷程度進(jìn)行半定量評(píng)分，在每個(gè)標(biāo)本中隨機(jī)選擇5個(gè)視野，每個(gè)視野內(nèi)隨機(jī)觀察20個(gè)線粒體，根據(jù)損傷程度分為0～4 5個(gè)等級(jí)。0級(jí)(無損傷)：線粒體結(jié)構(gòu)正常，有顆粒狀沉淀物；1級(jí)(輕度損傷)：線粒體嵴和基質(zhì)正常，但無顆粒狀沉淀物；2級(jí)(中度損傷)：基質(zhì)顆粒消失，基質(zhì)透明，無嵴破裂；3級(jí)(重度損傷)：基質(zhì)顆粒消失，基質(zhì)普遍透明，嵴破裂；4級(jí)(極其嚴(yán)重?fù)p傷)：基質(zhì)顆粒消失，嵴普遍破裂，線粒體呈空泡樣變。根據(jù)觀察結(jié)果，計(jì)算每個(gè)標(biāo)本線粒體損傷級(jí)數(shù)的平均分。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠肝、腎線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅳ酶活性對(duì)比

模型對(duì)照組小鼠的肝、腎線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅳ酶活性較正常對(duì)照組明顯降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01) 。黨參水提物中、高劑量組小鼠肝、腎線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅳ酶活性均升高，其中高劑量組的肝、腎線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅳ酶活性與模型對(duì)照組對(duì)比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見表1。

表1 各組小鼠肝、腎線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅳ酶活性對(duì)比

表1 各組小鼠肝、腎線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅳ酶活性對(duì)比

組 別動(dòng)物數(shù)劑量/(g·kg-1)復(fù)合體Ⅰ酶活性肝腎復(fù)合體Ⅳ酶活性肝腎正常對(duì)照組20—11．76±0．72??8．14±0．61??52．44±2．31??49．44±3．78??模型對(duì)照組20—7．75±0．423．93±0．6838．57±1．3429．09±2．63黨參水提物低劑量組2057．66±0．484．03±0．4438．93±1．7827．26±2．38黨參水提物中劑量組20109．81±0．356．02±0．3443．15±2．2834．78±3．06黨參水提物高劑量組201511．02±0．67??7．01±0．84?49．63±4．63??41．92±3．00?

注：與模型對(duì)照組對(duì)比，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 各組線粒體形態(tài)學(xué)改變及損傷程度評(píng)分

電鏡觀察顯示：正常對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞線粒體圓形，腎細(xì)胞線粒體長(zhǎng)橢圓形，線粒體數(shù)量較多，結(jié)構(gòu)完整清晰。模型對(duì)照組小鼠線粒體腫脹、線粒體內(nèi)膜和外膜的完整性時(shí)有破壞，嵴排列紊亂、斷裂、減少或消失，基質(zhì)變稀薄，電子密度降低，線粒體空泡樣變。黨參水提物高劑量組小鼠肝、腎線粒體結(jié)構(gòu)異常變化明顯改善，其中肝細(xì)胞中線粒體腫脹明顯減輕，多數(shù)線粒體結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常；腎細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)也明顯緩解，但個(gè)別線粒體仍存在一定程度的水腫、嵴排列紊亂及斷裂的現(xiàn)象。見圖1，2。

圖1 肝細(xì)胞線粒體變化

圖2 腎細(xì)胞線粒體變化

線粒體損傷級(jí)別計(jì)算結(jié)果顯示：正常對(duì)照組、黨參水提物高劑量組肝、腎線粒體損傷程度均低于模型對(duì)照組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表2 各組小鼠肝、腎線粒體損傷級(jí)數(shù)的平均分對(duì)比 分

注：與模型對(duì)照組對(duì)比，*P<0.05，**P<0.01。

3 討 論

線粒體是真核生物重要的細(xì)胞器，是細(xì)胞呼吸產(chǎn)生能量(ATP)的主要場(chǎng)所。衰老的線粒體學(xué)說認(rèn)為線粒體是細(xì)胞衰老與死亡的分子基礎(chǔ)[8]，衰老源于線粒體[9]，是衰老發(fā)生的根源所在。

呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ～Ⅳ是線粒體呼吸鏈的組成成。復(fù)合體I位于線粒體呼吸鏈的起始端，在代謝反應(yīng)中，大部分代謝物脫下的2H是由NAD+接受，形成NADH+H+，經(jīng)復(fù)合體Ⅰ進(jìn)行傳遞，這條氧化呼吸鏈被稱為NADH氧化呼吸鏈，是機(jī)體最普遍的一條氧化呼吸鏈。復(fù)合體Ⅳ又稱為細(xì)胞色素C氧化酶，位于線粒體呼吸鏈的末端，最易被氧化損傷[10]。有文獻(xiàn)報(bào)道，衰老時(shí)線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ及Ⅳ等活性下降，氧化磷酸化能力相應(yīng)減弱，導(dǎo)致細(xì)胞能量不足，引起衰老和老年病的發(fā)生[11]。本研究結(jié)果顯示：模型對(duì)照組小鼠肝、腎線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅳ酶活性較正常對(duì)照組顯著降低，給予高劑量的黨參水提物后，酶活性顯著升高，說明高劑量黨參水提物可通過增強(qiáng)線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅳ酶活性，確保電子傳遞的正常進(jìn)行，進(jìn)而改善或維持衰老小鼠線粒體呼吸鏈的功能。

線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果顯示，衰老模型小鼠肝、腎細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯改變，表現(xiàn)為內(nèi)膜斷裂、消失，線粒體呈現(xiàn)空泡樣變。線粒體的主要功能是進(jìn)行氧化磷酸化和三羧酸循環(huán)，前者在線粒體內(nèi)膜上進(jìn)行，產(chǎn)生ATP；后者在線粒體基質(zhì)內(nèi)進(jìn)行，是3大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)糖、脂肪、蛋白質(zhì)的最終代謝通路。其重要作用在于為氧化磷酸化反應(yīng)提供還原當(dāng)量。結(jié)構(gòu)是功能的基礎(chǔ)，結(jié)構(gòu)異常改變，必然會(huì)影響其正常功能的發(fā)揮。高劑量黨參水提物明顯減慢或阻止了線粒體結(jié)構(gòu)的異常變化，對(duì)線粒體結(jié)構(gòu)的完整起到了積極保護(hù)作用。

綜上所述，線粒體結(jié)構(gòu)的損傷，呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅳ酶活性的下降，影響了線粒體氧化磷酸化或三羧酸循環(huán)的進(jìn)程，導(dǎo)致ATP生成減少、細(xì)胞供能不足，可能是衰老發(fā)生的一個(gè)重要原因。高劑量的黨參水提物能通過某種機(jī)制減緩或阻止線粒體結(jié)構(gòu)的異常改變，增強(qiáng)線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅳ酶活性，維持線粒體正常功能的執(zhí)行，進(jìn)而起到延緩衰老的作用，具體的機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

[1]Navarro A.Mitochondrial enzyme activities as biochemical markers of aging[J].Mol Aspects Med，2004, 25(1/2):37-48.

[2]石作榮.關(guān)于衰老與抗衰老的中醫(yī)理論探析[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2009, 20(12):3173-3175.

[3]Zorov DB.Mitochondrial damage as a source of disease and aging:a strategy of how to fight these[J].Biochim Biophys Acta，1996, 1275(1/2):10-15.

[4]程莉娟,劉群良,譚峰，等.還少丹對(duì)D-半乳糖致衰小鼠心肌線粒體結(jié)構(gòu)與功能的影響[J].國(guó)際病理科學(xué)與臨床雜志，2011,31(2):93-97.

[5]Coskun P,Wyrembak J,Schriner SE，et al.A mitochondrial etiology of Alzheimer and Parkinson disease[J].Biochim Biophys Acta，2012,1820(5):553-64.

[6]Flameng W,Borgers M,Daenen W，et al.Ultrastructural and cytochemical correlates of myocardial protection by cardiac hypothermia in man[J].Thorac Cardiovasc Surg,1980,79 (3):413-24.

[7]耿廣琴,楊雅麗,王晶等.黨參水提物對(duì)D-半乳糖致衰老模型小鼠肝腎SOD活性、MDA含量及超微結(jié)構(gòu)的影響[J].中醫(yī)研究，2014，27(7)：70-74.

[8]張宗玉,范新青.衰老分子機(jī)制研究新進(jìn)展[J].實(shí)用老年醫(yī)學(xué)， 1994,8(3):97-99.

[9]童坦君,張宗玉.醫(yī)學(xué)老年學(xué)-衰老與長(zhǎng)壽[M].北京:人民衛(wèi)生出版，1995:59-142.

[10]王志軍,歐芹,魏曉東，等.菟絲子醇提液對(duì)衰老模型小鼠肝線粒體保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)老年學(xué)雜志， 2008,28(15):1457-1459.

[11]Cottrell DA,Blakely EL,Johnson MA,et al.Mitochondrial enzyme-deficient hippocampal neurons and choroidal cells in AD[J].Neurology,2001,57(2) :260-264.

(編輯 陶 珠)

1001-6910(2015)01-0067-04

R285.5

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.01.33

耿廣琴(1971—)，女(漢族)，河南開封人，動(dòng)物學(xué)碩士，現(xiàn)甘肅中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化教研室教師，主要從事生物化學(xué)的教學(xué)及研究。

李楊，講師，657061621@qq.com

甘肅省教育廳科研項(xiàng)目 (2013A-087)

2014-05-03；

2014-10-31