高 闖，張 全，王繼鋒

（1. 遼寧石油化工大學 石油化工學院，遼寧 撫順 113001；2. 中國石化 撫順石油化工研究院，遼寧 撫順 113001）

萘降解菌的篩選及其對多環(huán)芳烴的降解

高 闖1，2，張 全2，王繼鋒2

（1. 遼寧石油化工大學 石油化工學院，遼寧 撫順 113001；2. 中國石化 撫順石油化工研究院，遼寧 撫順 113001）

從柴油污染土壤中篩選分離出一株萘降解菌N-3，進行了菌種鑒定及萘雙加氧酶基因（nah）驗證，并考察了該菌對不同種類多環(huán)芳烴（PAHs）的降解能力及降解過程中脫氫酶活性的變化。實驗結果表明：該菌為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），含有nah基因；當分別對液體培養(yǎng)基中質量濃度為50 mg/L的萘、菲、蒽、芘、芴降解84 h時，菌株N-3對萘、菲、蒽、芘、芴的降解率分別為28.81%，34.83%，36.65%，27.50%，23.47%。菌株N-3的脫氫酶活性與其對不同PAHs的降解率呈一定的正相關性。該菌不僅能有效降解萘，且對其他種類PAHs也有一定降解作用。

萘降解菌；多環(huán)芳烴；生物降解；菌種篩選；銅綠假單胞菌

多環(huán)芳烴（PAHs）是一類含有兩個或兩個以上苯環(huán)的芳香族化合物。近年來，隨著人類生產活動的加劇，使環(huán)境中的PAHs大量增加［1］。由于PAHs具有疏水性強、相對分子質量高、穩(wěn)定性好、毒性大、難降解、在環(huán)境中存在時間長［2］、具有潛在致癌性等特點［3］，被很多國家列為優(yōu)先控制污染物［4-5］。土壤中的PAHs主要來源于污水灌溉、大氣沉降和工業(yè)滲漏等。PAHs被土壤粒子吸附后，可經(jīng)農作物富集而進入食物鏈，威脅人類健康［6］。此外，土壤中的PAHs還可進入大氣和水體，造成二次污染。目前，微生物法是降解PAHs最有效的方法之一［7-8］。該法通過微生物的生長代謝等過程將有毒、難降解的有機物轉化成無毒無害的化合物，安全經(jīng)濟且對環(huán)境無二次污染。近年來已有多名學者分離篩選出不同種類的萘、菲、蒽、芘、芴等PAHs的降解菌［9-14］。

本工作從柴油污染土壤中篩選、分離出一株高效萘降解菌N-3，對其進行了菌種鑒定及PCR擴增實驗，并考察了該菌株對單一萘、菲、蒽、芘、芴的降解能力及降解過程中脫氫酶活性的變化。

1 實驗部分

1.1 試劑、材料和儀器

萘、菲、蒽、芘、芴、氯化三苯基四氮唑（TTC）：純度均為99%，Sigma-Aldrich公司；正己烷：分析純；葡萄糖：純度為97%。

Tris-HCl 緩沖溶液：三羥甲基氨基甲烷濃度為0.05 mol/L，pH=7.19。

土樣：取自某市的柴油污染土壤。

LB 培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，NaCl 10.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH=7.0，121 ℃滅菌15 min，保存?zhèn)溆谩?/p>

無機鹽培養(yǎng)基：KH2PO41.0 g，K2HPO41.0 g，NH4NO31.0 g，MgSO40.5 g，CaCl20.01 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g，蒸餾水1 000 mL，pH=7.0，121 ℃滅菌15 min，保存?zhèn)溆谩?/p>

萘選擇性培養(yǎng)基及PAHs降解培養(yǎng)基：分別用正己烷配制萘、菲、蒽、芘、芴質量濃度為1 g/L的有機溶液，過濾除菌，取一定量添加到無機鹽培養(yǎng)基中，使萘、菲、蒽、芘、芴的質量濃度分別為50 mg/L，待正己烷揮發(fā)完畢后備用。

在上述培養(yǎng)基中分別加入質量分數(shù)為2%的瓊脂，即得相應的固體培養(yǎng)基。

6010型紫外-可見分光光度計：惠普公司；GC-2010型氣相色譜儀：日本島津公司。GTR21-1型離心機：北京時代北利公司。

1.2 萘降解菌的篩選

取10 g柴油污染土壤加入到100 mL無機鹽培養(yǎng)基中，于溫度30 ℃、轉速170 r/min條件下浸取4 h，將浸取液在3 000 r/min下離心5 min，將10 mL上清液加入到100 mL萘選擇性液體培養(yǎng)基中經(jīng)4代富集培養(yǎng)（萘質量濃度從50 mg/L逐步提高到200 mg/ L）后，取適量富集培養(yǎng)液，稀釋涂布在萘選擇性固體培養(yǎng)基平板上，待有明顯菌落出現(xiàn)時從中選取大小、形態(tài)各異的菌落在LB固體培養(yǎng)基上進行進一步劃線純化分離。

將各純化后的菌株分別接種于LB液體培養(yǎng)基中，于溫度30 ℃、轉速170 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)20 h，培養(yǎng)液在轉速6 000 r/min下離心，用生理鹽水重懸浮并調節(jié)菌懸液在600 nm處的吸光度（OD600）為1，冷藏備用。

將各菌懸液按10%（φ）的接種量分別接種到萘選擇性液體培養(yǎng)基中，觀察其生長情況并測定培養(yǎng)液中的萘含量，實驗設置3組平行試樣。

1.3 萘降解菌的鑒定

利用Baldwin等［15］2003年報道的nah基因的簡并引物nahf/nahr，對篩選出的菌株進行PCR擴增實驗，用細菌DNA提取試劑盒（Tiangen）對菌株進行DNA提取。選擇一株生長情況最好、對萘降解能力最強且含有nah基因的菌株作為萘降解菌。

菌株的鑒定工作委托中美泰和生物技術（北京）有限公司完成。

1.4 萘、菲、蒽、芘、芴的降解

將萘降解菌的菌懸液按10%（φ）的接種量分別接種于100 mL 含不同PAHs的降解培養(yǎng)基中，于溫度30 ℃、轉速170 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)，定時取樣，測定菌體生長曲線及降解后培養(yǎng)液中各PAHs含量，實驗設置3組平行試樣。

1.5 分析方法

1.5.1 菌體濃度的測定

以菌體培養(yǎng)液的OD600值表征培養(yǎng)液中的菌體濃度。

1.5.2 萘、菲、蒽、芘、芴質量濃度的測定

試樣經(jīng)正己烷萃取后，用氣相色譜儀測定各PAHs的質量濃度。色譜條件：進樣口溫度300 ℃，檢測器溫度330 ℃，毛細管柱50 m×0.25 mm×0.25 μm，柱溫130 ℃保持3 min，以15 ℃/min的升溫速率梯度升溫至280 ℃，進樣量1 μL。

1.5.3 脫氫酶活性的測定

通過測定微生物的脫氫酶活性可以了解微生物對有機污染物的氧化分解能力，具體方法見文獻［16］：取2 mL降解后培養(yǎng)液于一系列具塞試管中，加入pH=8.5 的0.05 mol/L Tris-HCl 緩沖溶液、0.1 mol/L 葡萄糖溶液、0.5%（w）TTC 各2 mL，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中反應4 h。加入2滴濃硫酸中止反應，并準確加入5 mL甲苯，充分振蕩，萃取。待反應生成的紅色三苯基甲臜（TF） 被完全萃取到有機相時，將有機相在4 000 r/min下離心5 min，過濾后測定濾液于486 nm處的吸光度（OD486），以此表征萘降解菌的脫氫酶活性。

2 結果與討論

2.1 萘降解菌的篩選

經(jīng)過富集培養(yǎng)，在萘選擇性固體培養(yǎng)基平板上得到3株能以萘為唯一碳源和能源生長的菌株，分別命名為N-1，N-2，N-3。3株菌在萘選擇性培養(yǎng)基中的生長曲線見圖1，降解60 h后3株菌的萘降解率見圖2。由圖1和圖2可見，菌株N-3生長情況最好，且降解60 h后的萘降解率最高，達到25.31%。

圖1 3株萘降解菌在萘選擇性培養(yǎng)基中的生長曲線

圖2 3株菌的萘降解率

3株菌的nah基因擴增電泳照片見圖3。由圖3可見，菌株N-1和N-3中均含有nah基因，而菌株N-2中未發(fā)現(xiàn)。結合圖1～3的結果，以下實驗選擇N-3作為萘降解菌。

圖3 3株菌的nah基因擴增電泳照片M：分子標記；NC：空白對照；N-1，N-2，N-3：萘降解菌

2.2 菌株N-3的鑒定

經(jīng)過對菌株N-3的16S rDNA序列分析，鑒定其為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。對該菌進行簡單生理生化實驗，結果表明：該菌為革蘭氏陰性菌，菌體的一端有單鞭毛，無芽胞；氧化酶陽性，能氧化分解葡萄糖和木糖，產酸不產氣，但不分解乳糖和蔗糖，可液化明膠，可分解尿素，可還原硝酸鹽為亞硝酸鹽并產生氮氣，吲哚試驗呈陰性，可利用枸櫞酸鹽，精氨酸雙水解酶陽性。

2.3 菌株N-3對萘、菲、蒽、芘、芴的降解

菌株N-3在不同PAHs體系中的生長曲線見圖4。由圖4可見：菌株N-3在萘、菲、蒽、芘、芴等5種PAHs中都能生長；在蒽和菲中生長情況最好，其次是萘，在芘和芴中生長情況最差。菌株N-3對不同PAHs的降解率見圖5。由圖5可見：經(jīng)過84 h的降解，菌株N-3對萘、菲、蒽、芘、芴的降解率分別為28.81%，34.83%，36.65%，27.50%，23.47%；菌株N-3對這5種PAHs降解能力的大小順序為：蒽＞菲＞萘＞芘＞芴，與該菌在不同PAHs體系中的生長情況呈一定的正相關性。實驗結果表明，該菌不僅可有效降解萘，而且也能有效降解液相中其他種類的PAHs。

圖4 菌株N-3在不同PAHs體系中的生長曲線

圖5 菌株N-3對不同PAHs的降解率

2.4 菌株N-3的脫氫酶活性

菌株N-3在不同PAHs體系中的脫氫酶活性見圖6。由圖6可見：菌株N-3在所有PAHs體系中的OD486都是先增大后減??；在菲和蒽體系中，菌株N-3的脫氫酶活性在前72 h上升迅速，而后略有下降；在萘、芘和芴體系中，菌株N-3的脫氫酶活性在前60 h上升迅速，而后呈下降趨勢，總體均低于菲和蒽體系中的脫氫酶活性。這表明該菌株對萘、芘和芴的降解能力沒有對菲和蒽的降解能力強。該結果與菌株N-3對不同PAHs降解率的結果呈正相關性，由此也可證明用脫氫酶活性表征微生物對有機污染物的降解能力是一種可靠的方法。

圖6 菌株N-3在不同PAHs體系中的脫氫酶活性

3 結論

a）從柴油污染土壤中分離出一株降解萘的菌株N-3。該菌能以萘為唯一碳源及能源生長，經(jīng)鑒定為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），含有萘雙加氧酶基因nah。

b）該菌能有效降解液相中的萘、菲、蒽、芘、芴。在質量濃度為50 mg/L的不同種單一PAHs體系中，經(jīng)過84 h的降解，萘、菲、蒽、芘、芴的降解率分別為28.81%，34.83%，36.65%，27.50%，23.47%。

c）菌株N-3的脫氫酶活性與其對不同PAHs的降解率呈一定的正相關性，且對PAHs的降解具有廣譜性。

［1］ 曹云者，柳曉娟，謝云峰，等. 我國主要地區(qū)表層土壤中多環(huán)芳經(jīng)組成及含量特征分析［J］. 環(huán)境科學學報，2012，32（1）：197 - 203.

［2］ 劉莉，陳玉成，于萍萍. 多環(huán)芳烴微生物降解的研究進展［J］. 安徽農業(yè)科學，2006，34（ 23） ：6289 -6291.

［3］ Shree N S，Rudra D T. Environmental Bioremediation Technologies［M］. Berlin：Springer，2007：409 - 443.

［4］ Nuttapun Supaka，Pairoh Pinphanichakam，Kobchai Pattaragulwanit，et al. Isolation and Characterization of a Phenanthrene-Degrading Sphingomonas sp. Strain P2 and Its Ability to Degrade Fluoranthene and Pyrene via Cometabolism［J］. Sci Asia，2011，27（ 1） ：21 - 28.

［5］ 張權，陳文生，洪亮，等. 混合表面活性劑-濁點萃取法測定沉積物中多環(huán)芳烴的含量［J］. 化工環(huán)保，2014，34（2）：191 - 194.

［6］ Dejean S，Raynaud C，Sinon V. Polycyclic Aromatic Hydrocarbons（PAHs） in Atmospheric Urban Area Monitoring on Various Types of Sites ［J］. Environ Monit Assess，2009，148（1/2/3/4）：27 - 37.

［7］ Rentz J A，Alvarez P J J，Schnoor J L. Benzo［a］pyrene Degradation by Sphingomonas yanoikuyae JAR02［J］. Environmental Pollution，2008，151（3）：669 - 677.

［8］ 張超，陳文兵，武道吉，等. 混合菌修復石油污染土壤［J］. 化工環(huán)保，2014，34（1）：19 - 23.

［9］ Zhang Zhengzhi，Hou Zhaowei，Yang Chunyu， et al. Degradation of n-Alkanes and Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Petroleum by a Newly Isolated Pseudomonas aeruginosa DQ8［J］. Bioresour Technol，2011，102（5）：4111 - 4116.

［10］ 王曉朝. 兩株芴高效降解菌的分離鑒定及降解特性研究［D］. 江蘇：江蘇科技大學環(huán)境微生物學院，2010.

［11］ Zeng Jin，Lin Xiangui，Zhang Jie，et al. Isolation of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons（PAHs）-Degrading Mycobacterium spp. and the Degradation in Soil ［J］. J Hazard Mater，2012，18（3）：718 - 723.

［12］ 白智勇，李博，楊琦. 兩株菌對萘的降解特性對比［J］. 油氣田地面工程，2013，32（3）： 48 - 49.

［13］ 李春霞. 環(huán)境污染物—萘降解菌的篩選、鑒定及應用［D］. 長春：長春理工大學，2014.

［14］ 劉芳，梁金松，孫英，等. 高分子量多環(huán)芳烴降解菌LD29的篩選及降解特性研究［J］. 環(huán)境科學，2011，32（6）：1799 - 1804.

［15］ Baldwin B R，Nakatsu C H，Nies L. Detection and Enumeration of Aromatic Oxygenase Genes by Multiplex and Real-time PCR［J］. Appl Environ Microbiol， 2003，69（6）：3350 - 3358.

［16］ 俞毓馨，吳國慶，孟憲庭. 環(huán)境工程微生物檢驗手冊［M］. 北京：中國環(huán)境科學出版社，1990.

（編輯 葉晶菁）

Screening of Naphthalene-Degrading Strain and Degradation of PAHs

Gao Chuang1，2，Zhang Quan2，Wang Jifeng2
（ 1. College of Petrochemical Engineering，Liaoning Shihua University，F(xiàn)ushun Liaoning 113001，China；2. Sinopec Fushun Petrochemical Research Institute，F(xiàn)ushun Liaoning 113001，China）

A naphthalene-degrading strain N-3 was isolated and identified from the diesel-contaminated soil. The naphthalene dioxygenase（nah）gene in the cell was verified. The degradation abilities to different PAHs and the dehydrogenase activity of the strain were studied. The experimental results show that：N-3 is a Pseudomonas aeruginosa strain，containing nah gene；When naphthalene，phenanthrene，anthracene， pyrene or fluorene with 50 mg/L of mass concentration are degraded in the medium by N-3 for 84 h，their degradation rates are 28.81%，34.83%，36.65%，27.50% and 23.47%，respectively. There is a positive correlation between the dehydrogenase activity of N-3 and the degradation rates of different PAHs. The strain not only can degrade naphthalene effectively，but also can degrade other kinds of PAHs.

naphthalene-degrading bacteriun；polycyclic aromatic hydrocarbons；bio-degradation；strain screening；Pseudomonas aeruginosa

X172

A

1006 - 1878（2015）01 - 0017 - 04

2014 - 07 - 23；

2014 - 11 - 03。

高闖（1987—），男，遼寧省撫順市人，碩士生，電話 18741390633，電郵 573088322@qq.com。聯(lián)系人：王繼鋒，電話 18941366706。